茯苓酸抑制H2O2诱导的脑微血管内皮细胞凋亡及促进细胞存活

【摘要】目的 探讨茯苓酸（PA）对过氧化氢（H2O2）诱导的脑微血管内皮细胞凋亡及增殖的影响。方法 体外培养小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3,随机分为NC组（正常培养细胞）、H2O2组（H2O2浓度为100 μmol/L）、H2O2+PA 10 μmol/L组（H2O2浓度为100 μmol/L,PA浓度为10 μmol/L）、H2O2+PA 20 μmol/L组（H2O2浓度为100 μmol/L,PA浓度为20 μmol/L）、H2O2+PA 40 μmol/L组（H2O2浓度为100 μmol/L,PA浓度为40 μmol/L）。采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;检测乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）、活性氧（ROS）的水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase 3）的表达量。结果 与NC组比较,H2O2组细胞存活率及CAT、SOD、GSH Px的水平显著降低（P＜005）,LDH、MDA、ROS的水平显著升高（P＜005）,细胞凋亡率与Cleaved caspase 3蛋白水平显著升高（P＜005）;与H2O2组比较,H2O2+PA 10 μmol/L组、H2O2+PA 20 μmol/L组、H2O2+PA 40 μmol/L组细胞存活率及CAT、SOD、GSH Px的水平显著升高（P＜0.05）,LDH、MDA、ROS的水平显著降低（P＜005）,细胞凋亡率与Cleaved caspase 3蛋白水平显著降低（P＜005）。结论 茯苓酸可抑制H2O2诱导的脑微血管内皮细胞凋亡及促进细胞存活。     

三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡的机制研究

目的 通过研究三氧化二砷对人肝癌细胞株HepG2活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）水平、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和核因子E2相关因子2(Nrf2)表达的影响,探讨三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡的机制。方法 分别采用0、 2.5、5和10 μmol/L三氧化二砷处理HepG2达24 h后,MTT实验测定细胞存活率（另增25、50 μmol/L浓度组）,流式细胞术检测细胞凋亡水平,DCFH-DA荧光探针测定细胞内ROS水平,5,5-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）比色法检测细胞中GSH含量,蛋白印记检测γ-GCS催化亚基GCLC和调节亚基GCLM以及核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白的表达水平。结果 随着三氧化二砷染毒浓度的增加,HepG2细胞凋亡率、ROS水平和Nrf2蛋白表达均增加(P<0.05),而细胞存活率、GSH含量、GCLC和GCLM蛋白表达量均降低(P<0.05)。结论 三氧化二砷通过诱导细胞产生ROS,抑制γ-GCS的表达以及减少GSH合成,从而诱导人肝癌细胞凋亡。     

小檗碱通过激活 Nrf2-HO-1/GPX4 通路抑制小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡

目的 探讨小檗碱对于Erastin诱导小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡的保护作用及其可能机制。方法 以HT22小鼠海马神经元细胞为研究对象,分为对照组、Erastin模型组、Erastin+30 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/L BBR组。采用CCK-8法、特异性 Fe2+ 荧光探针、荧光染料（DAPI）检测和荧光探针（H2DCFH-DA）检测各实验组细胞的增殖情况、活性铁水平、细胞凋亡和活性氧（ROS）变化。 RT-qPCR和Western blot分别检测各实验组细胞的Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA和蛋白表达情况。以60 μmol BBR的最适浓度来进一步探究其作用机制,分为对照组、Erastin模型组、Erastin+60 μmol/L BBR组、Erastin+60 μmol/LBBR+2 μmol Nrf2抑制剂 ML385组。通过使用荧光探针和Western blot检测Nrf2抑制剂（ML385）作用后的活性铁的水平、活性氧含量以及Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的表达来验证小檗碱调节的Nrf2-HO-1/GPX4通路对Erastin处理的HT22细胞的保护作用。结果 0.5 μmol/L Erastin作用于HT22细胞8 h,细胞存活率与对照组相比显著被抑制（P<0.05）;同时细胞凋亡、ROS以及活性铁含量增加（P<0.05）。与Erastin组比较,Erastin+30 μmol/L BBR组和Erastin+60 μmol/L BBR组的细胞存活率明显升高（P<0.05）,同时显著降低细胞凋亡、ROS以及活性铁含量（P<0.05）。小檗碱增加 HT22细胞中Nrf2、HO-1、GPX4基因及蛋白的 表达量（P<0.05）。加入Nrf2抑制剂ML385后,Nrf2-HO-1/GPX4通路被抑制,并且ROS以及活性铁含量升高（P<0.05）。结论 Erastin诱导HT22细胞发生铁死亡,小檗碱抑制Erastin诱导的铁死亡,可能机制是激活了Nrf2-HO-1/GPX4通路。     

活性氧（ROS）在三氧化二砷诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡中的作用

目的：利用Mn（Ⅲ）TBAP能特异性清除细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）,观察不同浓度三氧化二砷（As2O3）单独和联合Mn（Ⅲ）TBAP作用于人肝癌HepG2细胞后细胞内活性氧（ROS）的变化和对凋亡的影响,探讨活性氧（ROS）在三氧化二砷（As2O3）诱导肝癌细胞株HepG2凋亡中的作用。方法：实验分3组：对照组,不同浓度三氧化二砷（As2O3）组,三氧化二砷（As2O3）＋Mn（Ⅲ）TBAP组。用四甲基偶氮唑盐（MTr）比色法测定细胞生长增殖活性;激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内ROS的变化;AnnexinV／PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：2、4、8μol／L三氧化二砷（As2O3）处理HepG2细胞后各组细胞增殖抑制率高于对照组（P〈0．05）,细胞增殖抑制率随As2O3浓度的增加及作用时间的延长而升高（P〈0．05）;HepG2细胞内ROS的水平随As2O3浓度的增加而升高（P〈0．05）,As2O3处理组HepG2细胞内ROS水平高于空白对照组（P〈0．05）,As2O3＋Mn（Ⅲ）TBAP组HepG2细胞内ROS的水平低于As2O3组（P〈0．05）,但高于对照组（P〈0．05）。细胞早期凋亡率随As2O3浓度的增加及作用时间的延长而升高（P〈0．05）,且均高于Mn（Ⅲ）TBAP＋As2O3组和对照组,Mn（Ⅲ）TBAP＋As2O3组高于对照组。结论：三氧化二砷作用于HepG2细胞促进了细胞内ROS的产生,ROS水平的提高增加了三氧化二砷促HepG2细胞凋亡的敏感性。     

金丝桃苷通过激活Keap1/Nrf2/HO-1通路保护小鼠GC-2细胞的氧化损伤

目的 从Keap1/Nrf2/HO-1通路角度研究金丝桃苷（Hyp）对H2O2所诱导的小鼠精母细胞（GC-2）氧化损伤的保护作用。方法 将GC-2细胞随机分为正常组、模型组、氮乙酰半胱氨酸组（阳性组,NAC,2.5 mmol/L)以及金丝桃苷组（50、100、200 μmol/L）,各组按剂量孵育48 h后,除正常组外其余各组细胞加入H2O（2 150 μmol/L）处理2 h,正常组给予等容量培养基。采用CCK-8法检测细胞的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,酶联免疫法检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）活力以及丙二醛（MDA）含量,Western blot和RT-qPCR检测Nrf2、Keap1、HO-1蛋白及mRNA的相对表达水平,免疫荧光法检测Nrf2核转位水平。结果 150 μmol/L H2O2干预2 h可制备GC-2细胞氧化损伤模型。与正常组比较,模型组GC-2细胞增殖率以及SOD、GSH、CAT活力显著降低,MDA含量、细胞凋亡率,Keap1和Nrf2 mRNA表达显著升高（P<0.05）以及Keap1蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较,NAC组和金丝桃苷200 μmol/L组细胞增殖率和SOD、GSH-PX、CAT活力显著升高,MDA含量、细胞凋亡率显著下降（P<0.05）;金丝桃苷200 μmol/L组Keap1 mRNA表达显著下降,HO-1 mRNA表达显著升高（P<0.01）;金丝桃苷200 μmol/L组Nrf2核蛋白（NEs-Nrf2）以及HO-1的蛋白表达显著升高（P<0.05）,Keap1蛋白表达显著下降（P<0.01）;金丝桃苷组出现了明显的核转位现象（P<0.05）。结论 金丝桃苷可能通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,对H2O2诱导的GC-2细胞氧化损伤具有保护作用。     

氯氰菊酯通过抑制Nrf2/ARE信号通路诱导原代C57BL/6小鼠大脑皮层神经元损伤

目的 探讨Nrf2/ARE信号通路在CYP诱导的小鼠大脑皮层神经元损伤中的作用及其机制。方法 原代培养并鉴定C57BL/6小鼠大脑皮层神经元细胞,建立CYP诱导细胞损伤模型。将不同剂量的CYP（0、25、50、100 μmol/L）分别暴露细胞48 h。 CCK-8分析CYP对细胞活性的影响、荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧、流式细胞术检测细胞凋亡率,qPCR及Westernblotting检测Nrf2及其下游基因HO-1、NQO1的mRNA和蛋白表达。结果 与0 μmol/L组相比,CYP各剂量组神经元活性均受抑制,随着CYP剂量增加,神经元细胞活性逐渐下降、细胞内ROS随之增加、细胞凋亡率逐渐升高,且CYP剂量越高,神经元损伤程度越严重。与0 μmol/L组相比,CYP 50 μmol/L组HO-1、NQO1,CYP 100 μmol/L组HO-1、NQO1、Nrf2 mRNA及蛋白表达下调（P<0.01）。结论 CYP暴露抑制Nrf2/ARE信号通路,下调Nrf2及其下游基因HO-1、NQO1 mRNA和蛋白表达,诱导神经元细胞氧化损伤和凋亡,CYP对神经元的毒性呈现剂量效应关系。     

三氧化二砷对黑素瘤B16细胞内活性氧自由基的影响

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）对黑素瘤B16细胞增殖及细胞内活性氧自由基（ROS）水平的影响。方法：30μmol/LAs2O3与500μmol/L N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）分别单独或联合作用于B16细胞,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生长抑制情况;流式细胞术检测ROS水平。结果：As2O3能明显抑制B16细胞的增殖,NAC可部分拮抗As2O3对黑素瘤细胞的杀伤效应及诱导凋亡效应。As2O3作用1 h后的B16细胞内ROS水平比对照组升高（P〈0.01）,4 h达到高峰,24 h有所下降,与对照组差异均有统计学意义（P〈0.01）。ROS升高的趋势可被抗氧化物NAC部分阻断（P〈0.05-P〈0.01）。结论：As2O3诱导B16细胞凋亡与ROS水平改变有关,As2O3可通过提高细胞内ROS水平诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用,这也可能是As2O3抗黑素瘤的途径之一。     

低氧条件下三氧化二砷诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡作用

目的：探讨低氧条件下三氧化二砷（As2O3）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡作用。方法：分别在常氧和低氧（CoCl2 200μmol/L）条件下以2、4、8μmol／LAs2O3作用人肝癌Hep岛细胞,24、48、72小时后以MTr法检测细胞增殖抑制率,以AnnexinV／PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡,分析两种条件下As2O3对细胞增殖抑制率和凋亡率的影响。结果：常氧及低氧条件下细胞增殖抑制率,细胞早期凋亡率均随As2O3浓度增加及作用时间延长而升高（P〈0．05）。相同浓度As2O3相同作用时间,低氧条件下细胞增殖抑制率及凋亡率升高更为明显。结论：在低氧条件下As2O3促进细胞凋亡,抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用显著增强。     

三氧化二砷联合抗坏血酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究三氧化二砷(As2O3)联合抗坏血酸(AA)对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其细胞内谷胱甘肽(GSH)水平.方法:As2O3和AA不同组合孵育细胞HepG2,采用台盼蓝染色实验检测药物对细胞生长的影响,流式细胞仪检测亚二倍体凋亡峰,Annexin V染色检测细胞凋亡率,GSH实验检测细胞内GSH水平.结果:100 μmol/L的AA单独作用与对照组相比在细胞增殖和凋亡都无显著性差异;低剂量(2 μmol/L)和高剂量(5 μmol/L)的As2O3都能抑制细胞增殖活性和诱导细胞凋亡,联合AA作用后,比相应浓度的单独As2O3作用更为显著;AA和As2O3分别处理都能明显消减细胞GSH含量,两种药物联合作用后与相应单独As2O3作用相比GSH水平显著性降低.结论:GSH在As2O3对肝癌细胞抑制增殖和诱导凋亡作用机制中起到重要的作用,高低剂量的As2O3联合AA通过降低GSH水平均可以增强As2O3对肝癌细胞抑制生长及其诱导凋亡作用的敏感性.     

维甲酸联合三氧化二砷对NB4细胞NF-κB、ROS表达的影响

摘要目的探讨全反式维甲酸(ATRA)联合三氧化二砷(As2O3)对NB4细胞的生长以及核因子-κB(NF-κB)、活性氧(ROS)表达的影响.方法选择NB4细胞,加入ATRA和不同剂量的As2O3,观察细胞生长曲线,流式细胞仪检测CD11 b、ROS、NF-κB的变化,DNA片段梯度观察细胞凋亡.结果 0.5 μmol/L As2O3下调了1 μmol/L ATRA诱导的NB4细胞的分化凋亡发生,同时抑制了NF-κB的激活,提高了ROS水平.2 μmol/L As2O3联合同浓度ATRA对增殖抑制、诱导凋亡更明显.结论 ATRA联合As2O3对NB4细胞具有分化和凋亡的双重效应.     

沉默ANGPTL2对氧—葡萄糖剥夺/复氧诱导的HT22细胞氧化应激及凋亡的影响

目的 探究沉默血管生成素样蛋白2(angiopoietin-like protein 2,ANGPTL2)对氧-葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)诱导的神经元细胞(hippocampal neuronal cell line, HT22)细胞氧化应激及凋亡的影响。方法 通过OGD/R处理建立小鼠海马HT22细胞模型。通过实时荧光定量聚合酶链反应、细胞计数试剂盒、末端标记法及试剂盒检测ANGPTL2 mRNA的含量、细胞活力、细胞凋亡、细胞乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平及细胞氧化应激。通过蛋白质印迹检测各种蛋白质含量。结果 与对照组比较,模型组ANGPTL2 mRNA表达水平、LDH、凋亡率、ROS、MDA、核苷酸寡聚化结构域样受体家族3(nucleotide oligomeric domain-like receptor family 3,NLRP3)及凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein contain...     

EGCG对氧糖剥夺/再灌注神经元氧化应激及Nrf2/HO-1通路的影响

目的：研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)对氧糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)导致的神经元氧化应激损伤及核因子E2-相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)通路的影响。方法：取原代培养的大鼠大脑皮层神经元,建立 OGD/R损伤细胞模型。于OGD/R前加入不同浓度(12.5,25.0,50.0,100.0 μmol/L)EGCG,再灌注后,测定细胞活 力、活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,检测HO-1 mRNA,HO-1蛋白及细胞核Nrf2蛋白表达水平。结果：OGD/R导致神经元细胞活力降低,ROS水平和MDA含量升 高,SOD和GSH-Px活性降低,HO-1 mRNA,HO-1蛋白及细胞核Nrf2蛋白表达增多(P<0.01)。EGCG能明显促进OGD/R 神经元存活,降低ROS水平和MDA含量,提高SOD和GSH-Px活性,上调HO-1 mRNA,HO-1蛋白及细胞核Nrf2蛋白表 达水平(P<0.01)。结论：EGCG能减轻OGD/R诱导的神经元氧化应激损伤,可能与激活Nrf2/HO-1信号通路,增强神 经元的抗氧化能力有关。     

金丝桃苷对高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤的影响及其机制研究

目的 探索金丝桃苷在高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤中的作用及其分子机制。 方法 高糖处理模拟心肌细胞氧化应激损伤。细胞分为5个组:正常对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）,高糖损伤模型组（35 mmol/L葡萄糖）,低、中、高浓度金丝桃苷保护组（35 mmol/L葡萄糖+4/8/20 nmol/L金丝桃苷）。各组细胞培养48 h后,CCK-8检测细胞存活力;流式细胞术分析细胞凋亡;通过流式细胞仪利用活性氧（ROS）检测试剂盒DCFH-DA分析ROS水平;超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒检测SOD和MDA水平;Western blot法检测磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化（p）-AKT、核因子E2相关因子2（Nrf2）、p-Nrf2的表达;免疫荧光染色分析AKT的活化情况。 结果 与正常对照组比较,高糖损伤模型组细胞存活率降低,细胞凋亡率增高,ROS、MDA水平升高,SOD水平降低,PI3K相对表达量及AKT、Nrf2磷酸化水平（p-AKT/AKT和p-Nrf2/Nrf2的比值）降低,AKT阳性细胞数比率降低,以上差异均有统计学意义（P<0.05）。与高糖损伤模型组相比,金丝桃苷保护组（4、8、20 nmol/L）细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,ROS、MDA水平降低,SOD水平升高,PI3K相对表达量及AKT、Nrf2磷酸化水平升高,AKT阳性细胞数比率升高,以上差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 金丝桃苷可通过激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路保护心肌细胞免受高糖诱导的氧化应激损伤。     

干扰Nrf2可增强Hirsutanols A对肿瘤细胞增殖的抑制作用

目的探讨干扰Nrf2对HirsutanolsA抑制人结肠癌细胞SW480、肝癌细胞HepG2细胞增殖的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度Hirsutanols A对细胞增殖抑制作用。流式细胞仪检测细胞内ROS的含量;Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡;Western blot检测siRNA干扰NRF2蛋白表达的效果。结果 HirsutanolsA(1.25、2.5、5、10、20和40μmol/L)对SW480、HepG2细胞增殖有明显的抑制作用,并呈现剂量依赖关系;Hirsutanols A处理SW480(15μmol/L)、HepG2(30μmol/L)细胞后,诱导细胞中过氧化氢迅速增加,并引起细胞凋亡,用自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)预处理完全抑制HirsutanolsA诱导的ROS增加及细胞凋亡。siRNA有效地干扰Nrf2表达后可极大增强Hirsutanols A对肿瘤细胞的增殖抑制作用。结论Hirsutanols A通过增加细胞内ROS诱导其凋亡同时激活Nrf2,Nrf2在维持细胞氧化还原稳态中起重要作用,干扰其表达可增强Hirsutanols A的凋亡诱导作用。     

毛钩藤碱对H2O2诱导的大鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及机制

目的：观察毛钩藤碱（HS）对H2O2诱导的大鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用,并初步探讨其机制。方法：选取出生1～2 d的大鼠乳鼠提取原代心肌细胞作为研究对象,用400 μmol/L浓度的H2O2刺激细胞,复制细胞氧化应激模型。将细胞分为4组：Control组、HS组、H2O2组、H2O2+HS组。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞活性,采用Tunel法检测细胞凋亡情况,采用免疫荧光法检测细胞形态结构,采用蛋白质印迹法（Western blot）检测Bcl-2、Bax、Caspase 3、Cleaved-caspase 3、Nrf2及HO-1的蛋白水平表达情况。结果：细胞活力检测结果发现,与Control组比,H2O2处理6、12、24 h,细胞活性均显著降低（P ＜0.01）;与H2O2 组比,H2O2+1 μmol/L HS、H2O2+10 μmol/L HS组细胞活力显著升高（P ＜0.01）;与H2O2组比,H2O2+100 μmol/L HS组细胞活力显著下降（P ＜0.01）。细胞凋亡检测结果显示,与H2O2组比,H2O2+HS组细胞凋亡显著下降（P ＜0.05）,肌节结构相对完整;与H2O2组比,H2O2+HS组细胞Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase 3/Caspase 3 蛋白比值下调（P ＜0.05）,Nrf2、HO-1 蛋白表达上调（P ＜0.05）。结论：HS对H2O2诱导的大鼠心肌细胞线粒体凋亡有保护作用,其机制可能通过Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。     

辛伐他汀在心肌细胞缺血再灌注中的作用及机制

目的研究辛伐他汀在大鼠乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤中的保护作用及分子机制。方法分离培养乳鼠心肌细胞,建立I/R模型,实验分组：正常对照组（Control组）、缺血再灌注组（I/R组）、辛伐他汀预处理组（Sim,按辛伐他汀浓度分为0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L的低、中、高三个浓度组）、辛伐他汀＋锌原卟啉（Znpp）组、辛伐他汀＋全反视黄酸（ATRA）组。使用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,检测细胞上清液中CK,LDH的水平变化。运用Western blot分析HO-1、Nrf2的蛋白表达水平。结果与I/R组相比,1.0μmol/L、10.0μmol/L Sim组细胞凋亡率明显下降,LDH、CK平均值明显下降,而HO-1蛋白水平及Nrf2蛋白水平与I/R相比均明显增加。而Znpp会阻断辛伐他汀预处理对心肌细胞的保护作用,ATAR的加入会抑制Nrf2在细胞核的聚集进而抑制辛伐他汀对HO-1的诱导。结论辛伐他汀预处理诱导大鼠乳鼠心肌细胞HO-1过表达,抑制缺氧复氧心肌细胞凋亡,作用机制可能与Nrf2-ARE信号通路相关。