人类γδT细胞细胞毒活性的调控机制的作用途径

γδT细胞是不同于αβT细胞的另一类T细胞，对肿瘤细胞的细胞毒活性不受MHC限制。近年的研究发现，γδT细胞也表达NK细胞的抑制性MHCⅠ类分子受体（INMRs)，并调控其对肿瘤细胞的杀伤活性，溶解MHCⅠ类分子缺失的靶细胞。γδT细胞的细胞毒活性主要由穿孔素／颗粒酶介导，另外Fas/FasL诱导的凋亡可能也起作用。     

人类γδT细胞细胞毒活性的调控机制和作用途径

γδT细胞是不同于αβT细胞的另一类T细胞 ,对肿瘤细胞的细胞毒活性不受MHC限制。近年的研究发现 ,γδT细胞也表达NK细胞的抑制性MHCⅠ类分子受体 (INMRs) ,并调控其对肿瘤细胞的杀伤活性 ,溶解MHCⅠ类分子缺失的靶细胞。γδT细胞的细胞毒活性主要由穿孔素 /颗粒酶介导 ,另外Fas/FasL诱导的凋亡可能也起作用。     

人γδT细胞识别肿瘤抗原的分子机理研究

作者在自建体外扩增人γδT细胞的基础上,分析了γδT细胞识别肿瘤细胞的分子机理.主要结果:(1)γδT细胞能够杀伤K562、Daudi、XG-7等肿瘤细胞,杀伤率分别高达62±7.2%,73±8.7%和84±6.1%;(2)γδT细胞对正常淋巴母细胞(自体和异体)的细胞毒活性均低于20%;(3)抗热休克蛋白70(HSP-70)单克隆抗体可阻断γδT细胞对XG-7细胞的杀伤作用,但对Daudi,K562肿瘤细胞却无明显的阻断作用.提示γδT细胞可通过识别肿瘤细胞表面的HSP或相关分子,并以MHC非限制性方式杀伤肿瘤细胞.     

MAPK信号转导途径在Mtb-Ag激活的γδT细胞杀伤肿瘤细胞中的作用

目的：探讨MAPK信号转导途径在结核杆菌抗原(Mtb-Ag)活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞中的作用。方法：用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增，并用磁珠阳性分选法分离高纯度的γδT细胞；用MTT比色法测定γδT细胞对肿瘤细胞系K562和Raji的细胞毒活性，并观察MEK／Erk特异性抑制剂PD98059和p38 MAPK特异性抑制剂SB203580，对细胞毒活性的阻断作用：用流式细胞仪检测肿瘤细胞诱导γδT细胞上CD69的表达，并观察PD98059和SB203580对CD69表达的抑制作用。结果：新鲜分离的PB-MC，用Mtb-Ag刺激培养第10天，用磁珠阳性法分离的细胞中γδT细胞的比率，分别为3．56％、74．63％和98．20％。PD98059可抑制γδT细胞的杀瘤活性，且对γδT细胞杀伤Fas低表达的K562细胞的抑制率(39．27％)高于对γδT细胞杀伤高表达Fas的Raji细胞的抑制率(26．58％)。PD98059还能明显抑制肿瘤细胞诱导γδT细胞表达CD69；而SB203580对γδT细胞的杀瘤活性和肿瘤细胞诱导的CD69的表达均无影响。结论：MAPK途径中的Erk通路(而不是p38通路)参与了γδT细胞对肿瘤细胞细胞毒活性的启动，且可能对γδT细胞的颗粒外吐作用较大，而对Fas／FasL介导的细胞毒活性的作用较小。MAPK途径的Erk通路可能还参与肿瘤细胞诱导γδT细胞的活化。     

磷酸脂配体体外激活人外周血γδT细胞的研究

人γδT细胞可识别非肽类的磷酸脂分子。本研究用非肽类磷酸脂配体MEP在体外选择性扩增人外周血γδT细胞。MEP激活的PBMC中主要为CD3+ CD45RO+ γδTCR+ 细胞群。激活的γδT细胞可分泌IFN γ ,但不分泌IL 4,因此激活的γδT细胞可能分泌Thl型细胞因子。MEP激活γδT细胞需要有辅佐细胞的存在 ,但不需要抗原的处理和递呈 ,并且激活的γδT细胞对多种肿瘤细胞具有非MHC限制性的细胞毒作用。以上结果提示MEP可有效激活γδT细胞 ,使其表现出独特的免疫学特征和生物学功能。     

HLA-G研究进展

HLA-G分子属MHC Ⅰ类非典型分子(MHC Ⅰb),组织特异性地高表达于胎母界面的滋养层细胞,MHC Ⅰ、Ⅱ类抗原是缺乏的。HLA-G分子通过NK细胞受体抑制NK细胞杀伤活性,并作为CD8~+细胞毒抑制性T细胞的识别和激活因子,抑制CTL的杀伤作用,HLA-G在胎母耐受中发挥重要作用。     

HLA-E的表达对RSA及PIH患者外周血γδT细胞细胞毒效应的影响

探索HLA-E分子的表达对习惯性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)及妊高症(pregnancy-induced hypertension,PIH)患者外周血γδT细胞细胞毒效应的影响。通过固相抗体法体外分离并扩增外周γδT血细胞作为效应细胞,以HLA-E转染的LcL721.221细胞(.221E)及滋养层细胞JAR作为靶细胞,采用4 h乳酸脱氢酶(LDH)释放试验观察NK细胞对靶细胞的细胞毒效应。结果显示,来自RSA、PIH及正常对照组的γδ细胞均不能有效杀伤HLA-E转染的.221E细胞及JAR细胞,但未经HLA-E转染的LcL721.221细胞则被溶解;抗HLA-E单抗3D12及抗CD94单抗HP-3B1的阻断可以分别部分恢复效应细胞对靶细胞LcL721.221E的杀伤,但对JAR细胞没有影响;与正常对照组相比,RSA及PIH患者外周血γδT细胞对.221、.221E及JAR细胞的细胞毒活性没有显著性差异(P>0.05)。这说明HLA-E分子的体外表达可以保护靶细胞防止γδT细胞的杀伤,该保护机制主要是通过γδT细胞受体CD94/NKG2对靶细胞表面HLA-E分子的识别来实现的;滋养层细胞对γδT细胞杀伤的抵抗可能存在MHC I类非依赖的机制。     

T细胞受体γδ表型淋巴细胞与肿瘤免疫

T细胞受体γδ表型细胞是一个新发现的T淋巴细胞亚群，约占人外周血淋巴细胞总数的3％～10％。实验证明，此类细胞具有多种细胞因子的分泌能力且可表现出对多种自体及建系肿瘤细胞较强的细胞毒活性。因其具有特殊的MHC非限制性的抗原识别方式，在某些肿瘤浸润淋巴细胞中的存在以及经过继免疫实验可获明显的抗肿瘤效应而引起了免疫学工作者们的兴趣。本文仅就γδT细胞在肿瘤免疫研究的近年进展作一综述。     

干扰素-α1b增强人γδT细胞对Daudi细胞系的细胞毒活性及相关机制

目的探讨干扰素-α1b(IFN-α1b)对人γδT细胞体外杀伤肿瘤细胞的促进作用及其相关机制。方法用IFN-α1b预处理的Daudi细胞作为靶细胞;用IFN-α1b预处理的γδT细胞作为效应细胞;LDH法检测γδT细胞对Daudi细胞的细胞毒活性;ELISA检测效靶细胞混合上清中γδT细胞分泌的颗粒酶B和γ干扰素水平;流式细胞计量技术检测IFN-α1b预处理Daudi细胞表面Fas受体和应激蛋白配体ULBP3/ULBP4的表达,以及γδT细胞表面活化分子CD69和CD25的变化。结果IFN-α1b分别预处理Daudi细胞和γδT细胞都能显著增强γδT细胞对Daudi细胞的细胞毒活性(P<0.0001);IFN-α1b预处理的γδT细胞分泌颗粒酶B和γ干扰素的能力显著提高(P<0.05);IFN-α1b能上调Daudi细胞表面Fas受体和应激配体ULBP4的表达水平,而应激配体ULBP3的表达没有变化;IFN-α1b还能上调γδT细胞表面CD69的表达水平,而CD25的表达没有变化。结论IFN-α1b能通过不同的途径促进人γδT细胞对肿瘤细胞系Daudi细胞的体外细胞毒活性,两者的联用能增强γδT细胞的肿瘤治疗疗效。     

小鼠γδT细胞抗原呈递功能的实验研究

目的:证实小鼠γδT细胞抗原也具有呈递功能.方法:观察了高度纯化的小鼠γδT细胞体外激活后MHC Ⅱ分子及其他共刺激分子的表达与其表面特征性TCR的关系.用自身反应抗原IRBP/MOG特异性T细胞株作为反应细胞,以增殖反应及细胞因子表达作为效应指标,观察γδT细胞的抗原呈递功能.结果:小鼠γδT细胞在激活后可表面表达MHC Ⅱ分子,并能有效呈递抗原给T细胞,使之发生抗原特异性免疫应答.结论:小鼠γδT细胞具有抗原呈递功能,在启动特异性免疫应答的过程中起重要作用.另一方面,不象人γδT细胞,表达MHC Ⅱ分子限于新激活的小鼠γδT细胞,后者失去了表面γδTCR.当γδT细胞重新获得表面γδTCR时,其MHC Ⅱ抗原表达则逐渐减少.     

结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδ+T细胞的细胞毒活性研究

目的探讨选择性扩增人γδ+T细胞的方法及其细胞毒活性.方法用耐热性结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb)刺激正常人PBMC,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδ+T细胞,通过MTT试验观察γδ+T细胞对人红白细胞白血病细胞株K562的细胞毒活性.结果 Mtb刺激及磁珠分选后的γδ+T细胞可达73%和98%,效靶细胞比例为10:1时其对K562细胞的杀伤率分别为59%和78.5%.结论 Mtb刺激及磁珠分选所获得的高纯度γδ+T细胞可介导对K562细胞的高效细胞毒活性.     

抗原处理相关转运体结构与功能的研究进展

内源性抗原通过MHCⅠ类分子提呈给细胞毒性T细胞(CTL)是机体细胞免疫识别的重要阶段。抗原处理相关转运体(transporter associated with antigen processing,TAP)负责抗原肽从胞浆到内质网的转运，在MHCⅠ类分子的抗原处理及提呈过程中发挥重要作用。TAP结构和功能障碍将导致细胞表面MHCⅠ类分子表达缺陷，这成为肿瘤细胞、病毒感染细胞逃逸免疫监视的重要机制。     

人γδT细胞能够识别肿瘤相关蛋白AGR2

目的筛选人外周血γδT细胞识别的肿瘤相关蛋白配体,为阐明γδT细胞的抗原识别机制及抗肿瘤免疫效应机制奠定基础。方法以3种特异性结合肿瘤的CDR3δ序列合成肽为探针,通过人类全蛋白质组芯片筛选CDR3δ合成肽相互作用的蛋白;流式细胞术检测蛋白在肿瘤细胞系的表达;原核表达纯化肿瘤相关蛋白AGR2(前梯度2蛋白),ELISA验证其与探针肽的结合;固相化包被蛋白,检测人外周血单个核细胞中γδT细胞的活化相关分子的表达;乳酸脱氢酶释放法检测蛋白对γδT细胞体外细胞毒活性的作用。结果生物素标记的CDR3δ肽,共筛选到与蛋白质组芯片结合的候选蛋白配体共6种,分别是PHF21A、LDB3、SYF2、PPP1R14A、AGR2和SYAP1;流式结果显示AGR2在几种肿瘤细胞系细胞中均有表达,但表达水平不一致;ELISA结果显示GST-AGR2能特异性地结合CDR3δ肽OT3;固相包被GST-AGR2,能显著促进γδT细胞活化相关分子CD69、CD25的表达;与GST-AGR2预孵育能在体外显著促进γδT细胞对MDA-MB-231和MCF-7细胞的细胞毒作用。结论肿瘤相关蛋白AGR2能够在体外促进γδT细胞的活化,增强γδT细胞对乳腺癌细胞的细胞毒活性,可能是γδT细胞识别的肿瘤相关蛋白配体。     

Ⅰ型IFN体外增强人γδT细胞对骨肉瘤的杀伤作用

目的:探讨Ⅰ型干扰素(IFN)对人来源γδT细胞杀伤骨肉瘤作用的影响。方法:取健康人和骨肉瘤患者外周血来源的单个核细胞,分别使用唑来膦酸(Zol)、Zol和Ⅰ型IFN体外刺激扩增,流式细胞技术检测γδT细胞的纯度,计算扩增倍数。以Zol刺激体外扩增的γδT细胞为对照组,Zol联合Ⅰ型IFN刺激体外扩增的γδT细胞为实验组,LDH法检测不同方法扩增的γδT细胞的细胞毒活性,ELISA法检测γδT细胞分泌的IFN-γ。结果:Zol、Zol联合Ⅰ型IFN均可高度选择性扩增健康人和骨肉瘤患者外周血单核细胞中的γδT细胞,扩增后γδT细胞具有杀伤骨肉瘤细胞的能力。Ⅰ型IFN预处理γδT细胞后可显著增强γδT细胞的杀伤活性。结论:Ⅰ型IFN能够促进人γδT细胞的抗骨肉瘤作用。     

抗原处理相关转运体结构与功能的研究进展

内源性抗原通过MHCⅠ类分子提呈给细胞毒性T细胞 (CTL)是机体细胞免疫识别的重要阶段。抗原处理相关转运体 (transporterassociatedwithantigenprocessing ,TAP)负责抗原肽从胞浆到内质网的转运 ,在MHCⅠ类分子的抗原处理及提呈过程中发挥重要作用。TAP结构和功能障碍将导致细胞表面MHCⅠ类分子表达缺陷 ,这成为肿瘤细胞、病毒感染细胞逃逸免疫监视的重要机制。     

057 抗原处理相关转运体结构与功能的研究进展

内源性抗原通过MHCⅠ类分子提呈给细胞毒性T细胞(CTL)是机体细胞免疫识别的重要阶段.抗原处理相关转运体(transporter associated with antigen processing,TAP)负责抗原肽从胞浆到内质网的转运,在MHCⅠ类分子的抗原处理及提呈过程中发挥重要作用.TAP结构和功能障碍将导致细胞表面MHC Ⅰ类分子表达缺陷,这成为肿瘤细胞、病毒感染细胞逃逸免疫监视的重要机制.     

子宫内膜异位症患者腹腔液对子宫内膜细胞MHC-Ⅰ类分子表达以及NK细胞功能的调节

目的分析子宫内膜异位症(EM)患者腹腔液对IFN-y诱导异位子宫内膜细胞上MHC-Ⅰ类抗原表达以及对正常人γδT细胞和自然杀伤细胞(NK)功能的影响.方法采用免疫荧光细胞检测及细胞毒活性检测法.结果 EM患者腹腔液对IFN-y诱导异位子宫内膜细胞上MHC-Ⅰ类抗原表达具有下调作用.疾病组的腹腔液对正常人外周血γδT细胞及NK细胞的杀伤功能具有负相调节作用.结论子宫内膜异位症患者腹腔液中存在yδT细胞及自然杀伤细胞功能的抑制因子,对IFN-γ诱导异位子宫内膜细胞上MHC-Ⅰ类抗原表达具有下调作用.     

添加细胞因子优化人外周血γδ T细胞的体外扩增培养体系

目的从添加细胞因子角度,优化用于肿瘤过继免疫治疗的γδ T细胞体外扩增培养方案。方法在固相化抗TCRγδ抗体加IL-2扩增人外周血γδ T细胞的体系基础上,添加其他的γ链受体家族细胞因子,包括IL-7、IL-15或IL-21,单独或联合使用、长期使用或短时添加,通过流式细胞术检测γδ T细胞纯度、细胞增殖及细胞毒活性相关分子的表达,计算γδ T细胞扩增效率;乳酸脱氢酶法检测γδ T细胞对人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi的细胞毒活性。结果单独使用IL-7或IL-21不能有效扩增γδ T细胞,但单独使用IL-15可以使γδ T细胞纯度、扩增效率及细胞毒活性均达到与单独使用IL-2相当的水平;IL-2与IL-15联合使用,可促进γδ T细胞表达CD69,从而显著提高其扩增效率(P0.05);而IL-2与IL-21联合使用,可通过促进γδ T细胞颗粒酶A的表达,增强其对Daudi细胞的细胞毒活性(P0.001);IL-2、IL-15和IL-21联合使用可以显著提高γδ T细胞的细胞毒活性,但是会影响其扩增效率;而仅在效应前短时间添加IL-21,同样可以有效增强γδ T细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性(P0.05)。结论在用固相化TCRγδ抗体加IL-2体外扩增培养γδ T细胞体系中,使用IL-15,而在回输效应前短时间添加IL-21,显著提高γδ T细胞扩增效率及对肿瘤细胞的细胞毒活性,此为目前最优化的γδ T细胞体外扩增培养方案。     

γδT细胞

一小部分T细胞的受体不是由α和β多肽链构成的“常规”T细胞受体(TCRαβ),而是分别由γ和δ链取而代之(TCRγδ)。TCRγδ能够识别抗原。出现在T细胞个体发生的早期。在机体的某些部位,如小鼠的皮肤和肠道TCRγδ占优势,提示γδT细胞可能在抗感染的第一线起着防御作用γδT细胞能分泌淋巴因子,并具有细胞毒活性。由于MHC的非限制性以及CD_4、CD_8两阴性γδT细胞的发现,表明其激活过程可能与已知的αβT细胞不同。结核杆菌抗原能够优先激活γδT细胞,提示γδT细胞可能有一种特异的功能。γδT细胞的数量在许多疾病中稍有增加,但到目前的研究还未能证实γδT细胞有病原性作用。     

腺病毒介导HLA-B7可诱导启动子调控双细胞因子基因在人肝癌细胞中表达

目的：使外源性TNF、IFN基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类(MHCⅠ)分子基因表达呈“正反馈”式放大效应。方法：以腺病毒为载体，以IRES连接TNF和IFN基因，选择HLA-B7可诱导启动子调控其表达。分别用RT-PCR、抗体中和实验和MTT法检测转导基因的转录及蛋白表达，流式细胞仪检测MHCⅠ类分子表达。结果：TNFα和IFNβ基因在人肝癌细胞中可有效转录，转染细胞(SMAdBTI、SMAdCTⅠ)的MHCⅠ类分子表达高于SMAd对照组，且SMAdBTI组明显高于SMAdC-TI组。TWF最高活性：SMAdBT1和SMAd分别为1．059ng/ml、415pg／ml；IFN最高活性分别为298．57U／24h/10^6个细胞和262．26U／24h/10^6个细胞。抗TNFα多抗、抗IFNβ多抗对SMAdBTI、SMAdCTI上清均具有中和活性。结论：腺病毒介导的HLA-B7可诱导启动子调控的人TNFα和IFNβ基因导入人肝癌细胞株SMMC-7721，可明显增加其对TNF、IFN和MHCⅠ类分子的表达。