血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建及其对创面愈合作用的实验研究

目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接...     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建及其对创面愈合作用的实验研究

目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于SD大鼠深度创面(实验组),对动物创面愈合情况进行观察.单纯脱细胞异种真皮替代物移植大鼠作为对照组.结果:构建的真核表达载体pcDNA31(+)-VEGF165可成功转染至鼠成纤维细胞,移植后实验组皮片成活率(9376±340)%,对照组皮片成活率(8501±174)%,两者差异有显著性(t=8873,P＜001).组织学观察显示,移植第4周实验组毛细血管数量明显多于对照组.结论:成功构建了经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,且其具有明显的促进动物创面愈合作用.     

VEGF-C基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达的影响

目的探讨将真核表达载体pcDNA3．1-VEGF—C重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞后VEGF-C表达的变化。方法通过脂质体介导方法，将构建好含有VEGF—C的重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞中，新霉素（G418）筛选得到稳定转染细胞系，RT—PCR和Western blot方法检测稳定转染后细胞中VEGF—C mRNA和蛋白的表达。结果成功转染并获得稳定高表达VEGF—C的乳腺癌MCF-7细胞系，其转染组VEGF—C mRNA相对吸光度值（12．382±2．183）较空载组（6．039±1．950）显著上调（P〈0．01）。Western blot检测转染组VEGF-C蛋白相对灰度值（0．971±0．186）较空载组（0．594±0．196）明显上调（P〈0．05）。结论脂质体介导重组质粒pcDNA3．1-VEGF-C转染入人乳腺癌MCF7细胞中可显著增加VEGF—C表达水平。     

pcDNA3.1(-)-hTGFβ3成纤维细胞稳定表达系统的构建与生长增殖活性研究

目的构建人转化生长因子β3的真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统,研究转基因TGFβ3对成纤维细胞生长增殖活性的影响。方法通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3质粒导入NIH3T3成纤维细胞,应用RTPCR与Westernblot检测hTGFβ3在真核细胞中的表达。经相差显微镜形态观察及四唑蓝比色实验法(MTT)检测细胞增殖活性。结果在10株转染和经G418反复筛选的NIH3T3成纤维细胞系中,有7株hTGFβ3mRNA及其蛋白的表达明显增强,其余3株细胞相对较弱或者没有表达。TGFβ3转基因稳定表达的NIH3T3成纤维细胞系的生长增殖明显减缓(P<0.05)。结论pcDNA3.1(-)TGFβ3真核表达载体转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统构建成功,转基因hTGFβ3在体外培养条件下可抑制成纤维细胞的增殖。     

hVEGF165基因克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人血管内皮生长因子(hVEGF)基因VEGF165片段,构建pcDNA3.1/hVEGF165,观察其在COS-7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。方法从合法引产的胎儿心肌组织中提取总核糖核酸(RNA),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,聚合酶链反应(PCR)法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his-B中,构建pcDNA3.1/hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS-7细胞,蛋白印迹(Westernblotting)法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果用RT-PCR方法从胎儿心肌组织中获得了正确的hVEGF165基因序列,并成功构建pcDNA3.1/hVEGF165,且实现转染COS-7细胞的瞬时表达。结论构建的pcDNA3.1/hVEGF165转染真核细胞COS-7能够表达rhVEGF蛋白。     

转染血管内皮生长因子基因的小鼠NIH3T3细胞移植促进皮瓣早期血运重建的研究

目的探讨转染血管内皮生长因子（VEGF）基因的小鼠NIH3T3细胞移植对缺血皮瓣的血管新生和皮瓣存活率的影响。方法体外PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染小鼠NIH3T3细胞,免疫组化方法检测小鼠NIH3T3细胞体外表达VEGF的情况,CM-DiI标记小鼠NIH3T3细胞。将小鼠随机分为3组：A组[PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的NIH3T3细胞移植]、B组（单纯NIH3T3细胞移植）、C组（单纯DMEM培养基注射）。每只小鼠背侧皮下按组分别注射细胞悬液和培养基,注射后酶联免疫吸附（ELISA）法连续检测大鼠血浆VEGF浓度,注射后第4天掀起一个蒂在尾侧的4．0cm×1．5cm的随意皮瓣。术后第7天分别观察皮瓣的存活率、血流灌注、皮瓣毛细血管密度、NIH3T3细胞在皮瓣内的分布和存活情况。结果转染VEGF165基因的小鼠NIH3T3细胞体外和体内检测均高表达VEGF165蛋白。A组的皮瓣存活率、毛细血管密度、血流灌注比值均显著高于另外两组（P〈0．05）。结论转染VEGF基因的小鼠NIH3T3细胞皮下移植可促进缺血皮瓣的血管新生,提高存活率。     

血管内皮生长因子165基因转染的骨髓基质细胞异位成骨的初步研究

目的：将血管内皮生长因子165（VEGF165）基因转染的大鼠骨髓基质细胞（MSCs）和β-磷酸三钙复合后,植入原大鼠肌肉中,探索转染外源基因的MSCs异位成骨能力。方法：SD大鼠12只,在全麻及无菌条件下取其左侧股骨的骨髓基质细胞,并用矿化液诱导培养。在脂质体介导下将构建成功的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165转染到诱导培养的MSCs,G-418筛选阳性细胞克隆,将阳性克隆细胞和未转染的MSCs共同接种于β-磷酸三钙上,体外培养7天后,植入原大鼠肌肉内。分别于4周、8周和12周处死动物,观察异位成骨情况。结果：骨髓基质细胞-β-磷酸三钙复合体植入肌肉后,材料周围血管生长较多,随着植入时间的延长,小的骨岛逐渐融合为大的骨块,并有骨髓腔样结构,表现出较好的异位成骨能力。结论：应用VEGF165基因转染MSCs作为种子细胞植入体内后,有利于发挥VEGF165的血管化作用,同时促进组织工程骨的成骨速度,将会成为组织工程骨血管化探索的方向。     

人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。     

新型非病毒纳米微囊-VEGF复合体转染鼠成纤维细胞的体外试验研究

探讨新型纳米微囊载体应用于基因治疗的可行性，安全性、转染效率，转移方法并与阳离子脂质体、质粒DNA进行比较。方法：以血管内皮细胞生长因子(VEGF165)为目的基因，构建真核表达载体pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF165,分别利用纳米微囊、阳离子脂质体介导VEGF。转染鼠成纤维细胞(3Y1)，转染4h后镜下观察细胞转染后表型变化，24、48h后通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率，通过免疫组织化学、Western Blot检测基因表达水平及定位。MTT法检测对转基因细胞的毒性。ELIsA检测经G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况。结果：经G418筛选后的阳性细胞克隆，为高表达VEGF的鼠成纤维细胞模型。免疫组织化学证实pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF165在转基因的细胞中呈高表达，定位于胞浆。Western Bldt结果显示纳米微囊转染3Y1细胞48h后细胞胞浆及培养上清中均有VEGF蛋白表达。免疫荧光显示纳米微囊转染效率明显高于相应浓度的阳离子脂质体，转染4h后镜下观察细胞表型显示10mM浓度纳米微囊有较高的毒性。MTT测定示纳米微囊对3Y1细胞有显著的抑制增殖作用并随浓度梯度变化，ELISA检测发现纳米微囊、脂质体组培养上清中VEGF蛋白表达水平可维持4周，但纳米微囊组随时间变化而下降，瞬时表达水平高于脂质体组。结论：纳米微囊转基因载体作为一种新型非病毒载体，具备基因治疗应用潜能，可能为血管重建基因治疗提供了一种新的模式。     

人肝细胞生长因子转染L02细胞的锌指基因差异表达筛选

目的构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达载体,在L02细胞中表达hHGF并筛选其中的差异表达基因。方法构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定;其转染L02细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染L02细胞后,提取总mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的hHGF真核表达载体pcDNA3.1(-)-hHGF经酶切和测序鉴定正确;转染L02细胞后经蛋白免疫印迹证实hHGF存在明确表达;pcDNA3.1(-)及pcDNA3.1(-)-hHGF分别转染L02细胞后提取总RNA,经基因表达谱芯片分析发现,表达水平显著上调和下调的基因分别有404个和145个,在表达显著上调的基因中包含7种锌指基因。结论筛选出了hHGF转染L02细胞后的差异表达基因,为其作用机制及与锌指蛋白相关性的研究提供了重要依据。     

血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究

目的：利用细菌内同源重组法构建含血管内皮生长因子（VEGF）165基因的重组腺病毒，并观察其在内皮祖细胞（EPCs）中的表达，为进一步研究其在慢性肾脏病中的作用奠定基础。方法：用限制性内切酶XbaⅠ＋HindⅢ从质粒载体中切出VEGFl65基因片段，与KpnⅠ＋HindⅢ双酶切的pAdTrack-CMV形成转移质粒pAdTrack-CMV-VEGFl65，PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，由人胚肾293细胞包装成Ad-VEGFl65，PCR和westem blot法鉴定其表达。贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs，Ad-VEGFl65基因体外转染EPCs，检测转染后目的基因的表达情况。结果：利用CSCI，法由pAdTrack-VEGFl65和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态茵，可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因，病毒滴度1．4×10^10pfu／ml。Ad-VEGFl65转染培养第6天的EPCs后24h开始，培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加。结论：成功制备的重组体腺病毒Ad-VEGFl65转染体外培养的EPCs后，在体外能有效高表达目的基因产物，为今后VEGF在肾脏病中的深入研究奠定了基础。     

基因移植人血管内皮细胞生长因子制备小鼠新生血管模型

目的 探讨血管内皮细胞生长因子基因用重组慢病毒为载体移植制备新生血管动物模型的可行性。方法 构建重组慢病毒介导的人血管内皮细胞生长因子(human vascular endothelial growth factor,hVEGF165)基因,并转染小鼠成纤维细胞(NIH/3T3)。利用流式细胞仪挑选转染成功的细胞,将转染成功的表达人VEGF165的NIH/3T3细胞植入C57小鼠的骨骼肌,建立小鼠的新生血管模型。在新生血管模型上,用ELISA的方法进行小鼠血清VEGF测定。观察瘤体组织形态学。用免疫组化的方法观察是否有表达CD31的细胞。结果 经酶切鉴定、聚合酶链反应(PCR)及基因测序证实Lenti-VEGF165-GFP构建成功,包装后测定滴度为6.19×107 TU/ml。用基因移植的方法成功建立了稳定的小鼠新生血管模型,并证实小鼠外周血中有VEGF的分泌。14d后细胞植入处局部肿胀。44 d后HE染色发现细胞植入部位有血管组织的新生,免疫组化显示有围成规则或不规则管状表达CD31的细胞。结论 将表达人VEGF165的NIH/3T3细胞植入C57小鼠的骨骼肌,可以产生稳定有效的新生血管模型。     

血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞的表达

目的检测兔骨髓间充质干细胞(BMSc)经血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后外源基因的表达，为进一步利用经基因转染的BMSc构建血管化组织工程骨组织打下基础。方法构建VEGF真核细胞表达载体，利用脂质体介导转染兔BMSc，使用原位杂交、免疫组织化学的方法检测VEGF165在BMSc中的表达。结果成功构建VEGF真核细胞表达载体，原位杂交、免疫组化方法显示经基因转染的BMSc中有阳性棕黄色颗粒出现，而未转染组呈现阴性结果。结论采用基因转移技术可以将VEGF转染至．BMSc中，并有外源性基因和蛋白的表达。     

人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响

目的　探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。　方法　采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。　结果　pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。　结论　VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠肾脏的修复作用

目的探讨血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcelis,MSC）对慢性肾衰竭（chronicrenalfailure,CRF）大鼠肾脏的修复作用。方法体外分离、培养大鼠MSC,Ad—VEGF转染MSC。SD大鼠随机分为假手术组（对照组）、慢性肾衰竭模型组（肾衰组）、慢性肾衰竭大鼠MSC移植组（MsC组）、慢性。肾衰竭竭大鼠AdVEGF注射组（VEGF组）和慢性肾衰竭大鼠Ad—VEGF转染的MSC移植组（转染组）。采用分阶段5／6肾切除术制备大鼠CRF动物模型。对照组与肾衰组于切除右肾之前从该侧肾动脉注射不含血清的DMEM培养液,其他3组分别给予MSC、Ad—VEGF和VEGF基因转染的MSC。8周后检测各组大鼠血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）和24h尿蛋白,观察各组大鼠残肾组织病理形态,并用免疫印迹和RT—PCR方法检测各组大鼠残肾组织VEGFmRNA和蛋白的表达。结果MSC组和转染组SCr、BUN和尿蛋白均较。肾衰组降低（P〈0．05）;与MSC组比较,转染组SCr、BUN和尿蛋白降低更明显（P〈0．05）。肾衰组残肾组织VEGFmRNA和蛋白的表达较对照组显著减少（P〈0．05）,MSC组和转染组残肾组织VEGFmRNA和蛋白的表达明显增加（与肾衰组比较,均P〈0．05）,转染组残肾组织VEGFmRNA和蛋白的表达增加更明显（与M9C组比较,P〈0．05）。结论VEGF基因转染的MSC移植对CRF大鼠的肾脏有修复作用,这可能与VEGF在肾组织中高表达有关。