兔侧后方入路髓核内注射TGF-β1预防软骨终板退变实验研究

目的探讨经侧后方入路髓核内注射转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)预防椎间失稳后软骨终板退变的作用。方法选择6月龄日本大耳白兔36只,随机分为对照组和观察组各18只。两组均通过椎间失稳手术制备成腰5~6、腰6~7椎间失稳模型。观察组在术后立即经侧后方入路髓核内注射TGF-β1 25~30μl。于术后3个月、6个月各取8只动物,分别切取腰5~6、腰6~7椎间盘的软骨终板,对标本进行HE染色组织形态学观察及Mankin评分,测定Ⅱ型胶原,进行组间比较。结果术后3个月、6个月组织形态学显示观察组较对照组软骨终板退变明显减缓,Mankin评分显著低于对照组(P<0.01);观察组软骨终板内Ⅱ型胶原表达灰度值显著低于对照组(P<0.01)。结论髓核内注射TGF-β1对椎间失稳手术后软骨终板退变具有明显的预防作用。     

转化生长因子β1注射退变椎间盘内软骨终板的组织形态变化

背景：椎间失稳能导致软骨终板的退变,是椎间盘退变发病机制中的基础环节。目的：观察退变椎间盘内注射转化生长因子β1后,椎间盘软骨终板的组织形态学变化。方法：将日本大耳白兔随机分为对照组、预防组和治疗组。所有兔均建立L5～6,L6～7椎间失稳模型。预防组在完成椎间失稳建模后立即于损伤侧L5～6,L6～7椎间盘内注射转化生长因子β1,治疗组于椎间失稳建模后3个月行相同方法注射转化生长因子β1。结果与结论：建模后3,6个月,预防组较对照组软骨终板软骨细胞分布均匀,潮线清晰。Mankin评分降低（P〈0.05）。建模后第6个月治疗组较对照组软骨终板表层光滑,细胞排列均匀,潮线清晰,染色均匀,Mankin评分降低（P〈0.05）。结果证实,在兔椎间盘内注射转化生长因子β1可延缓椎间盘软骨终板的退变。     

转化生长因子β1注射退变椎间盘内软骨终板的组织形态变化

背景:椎间失稳能导致软骨终板的退变,是椎间盘退变发病机制中的基础环节.目的:观察退变椎间盘内注射转化生长因子β1后,椎间盘软骨终板的组织形态学变化.方法:将日本大耳白兔随机分为对照组、预防组和治疗组.所有兔均建立L5～6,L6～7椎间失稳模型.预防组在完成椎间失稳建模后立即于损伤侧L5～6,L6～7椎间盘内注射转化生长因子β1,治疗组于椎间失稳建模后3个月行相同方法注射转化生长因子β1.结果与结论:建模后3,6个月,预防组较对照组软骨终板软骨细胞分布均匀,潮线清晰.Mankin评分降低(P < 0.05).建模后第6个月治疗组较对照组软骨终板表层光滑,细胞排列均匀,潮线清晰,染色均匀,Mankin评分降低(P < 0.05).结果证实,在兔椎间盘内注射转化生长因子β1可延缓椎间盘软骨终板的退变.     

软骨终板通透性对兔退变腰椎间盘Ⅱ型胶原表达的影响

目的探讨软骨终板通透性对兔退变腰椎间盘Ⅱ型胶原表达的影响。方法 6月龄新西兰大白兔14只,建立退变腰椎间盘模型后饲养8周。8周后处死并手术切取腰段椎间盘每只6个,随机分为A组和B组,其中A组为对照组,B组骨蜡封闭上下软骨终板。两组兔退变椎间盘在体外进行整体器官培养。在培养前以及培养7 d和14 d时分别用Mitotracker Green荧光探针、免疫组化SP法和RT-PCR方法对椎间盘中髓核的细胞活力、Ⅱ型胶原及Ⅱ型胶原mRNA的表达情况进行评估。结果经过7 d的体外培养之后,两组的荧光强度、Ⅱ型胶原的灰度值与培养前比较降低不显著(P0.05),而椎间盘髓核Ⅱ型胶原的mRNA表达与与培养前比较差异显著(P0.05),两组间荧光强度、Ⅱ型胶原的灰度值及椎间盘髓核Ⅱ型胶原的mRNA表达对比差异均无统计学意义(P0.05)。经过14 d的培养,两组的荧光强度分别降低了18.6%与31.3%,与培养之前的荧光强度相比以及两组之间相比差异均具有统计学意义(P0.05);两组的Ⅱ型胶原的灰度值均有提升,与培养之前的Ⅱ型胶原的灰度值相比差异具有统计学意义(P0.01),两组间Ⅱ型胶原的灰度值经比较差异显著,具有统计学意义(P0.01);两组Ⅱ型胶原mRNA的表达比培养前以及培养7 d时明显下降(P0.05),两组之间比较差异显著具有统计学意义(P0.05)。结论降低软骨终板的通透性可以在短时间内(14 d)降低细胞活力和Ⅱ型胶原及其mRNA的表达,加速兔腰椎间盘的退变。     

针刺损伤免椎间盘退变模型组织病理变化及软骨样细胞的迁移规律

背景：兔椎间盘退变模型间盘退变表现为随时间进展脊索细胞将被软骨样细胞逐渐替代,但兔针刺纤维环间盘退变模型中软骨样细胞的来源和移行规律尚不明确。目的：观察针刺兔纤维环间盘退变模型椎间盘病理变化过程,并初步探讨软骨样细胞来源及移行规律。方法：将24只新西兰大白兔随机分为手术组与假手术组。手术组使用16G穿刺针针刺L2/L3、L3/L4、L4/L5及L5/L6椎间盘纤维环,假手术组暴露至相同椎间盘前方后冲洗闭合伤口。结果与结论：针刺损伤椎间盘退变过程中的软骨样细胞来源于终板。在髓核与上下终板交界处,软骨细胞脱离终板成串向髓核中心迁移;在髓核与内层纤维环交界处,软骨细胞沿纤维走行迁移并随之向皱缩的髓核边缘迁移。椎间盘退变过程中非钙化层逐渐变薄,非钙化层/钙化层比值逐渐降低。     

针刺损伤兔椎间盘退变模型组织病理变化及软骨样细胞的迁移规律

背景:兔椎间盘退变模型间盘退变表现为随时间进展脊索细胞将被软骨样细胞逐渐替代,但兔针刺纤维环间盘退变模型中软骨样细胞的来源和移行规律尚不明确.目的:观察针刺兔纤维环间盘退变模型椎间盘病理变化过程,并初步探讨软骨样细胞来源及移行规律.方法:将24只新西兰大白兔随机分为手术组与假手术组.手术组使用16 G穿刺针针刺L2/L3、L3/L4、L4/L5及L5/L6椎间盘纤维环,假手术组暴露至相同椎间盘前方后冲洗闭合伤口.结果与结论:针刺损伤椎间盘退变过程中的软骨样细胞来源于终板.在髓核与上下终板交界处,软骨细胞脱离终板成串向髓核中心迁移;在髓核与内层纤维环交界处,软骨细胞沿纤维走行迁移并随之向皱缩的髓核边缘迁移.椎间盘退变过程中非钙化层逐渐变薄,非钙化层/钙化层比值逐渐降低.     

低氧诱导因子1α基因敲除小鼠椎间盘退变与益气化瘀方的干预

背景：低氧诱导因子1α与椎间盘软骨的正常生理及病理情况存在密切的关系,能够维持软骨组织在低氧环境中的正常活性,低氧诱导因子1α基因敲除后,软骨组织无法维持其正常低氧状态,导致软骨组织营养供应障碍,使软骨细胞处于异常缺血缺氧状态,长此以往,软骨组织会发生退变。目的：观察低氧诱导因子1α条件性基因敲除小鼠椎间盘软骨退变情况,以及中药复方益气化瘀方对减缓低氧诱导因子1α基因敲除小鼠椎间盘软骨退变的作用。方法：①将杂交繁殖获得同窝的低氧诱导因子1α＋/＋对照小鼠和低氧诱导因子1α基因敲除小鼠,分别分为为2．5月龄组和4．5月龄组（n=6）。分别在2．5、4．5月龄处死相应小鼠,取L4-6腰椎进行藏红固绿、苏木精-伊红染色及免疫组化相关指标染色及分析。②取12只0．5月龄低氧诱导因子1α基因敲除小鼠随机均分为生理盐水组和益气化瘀方组。灌胃给药2个月后,取两组小鼠的L4-6椎间盘进行藏红固绿、苏木精-伊红染色及免疫组化相关指标染色及分析。结果与结论：①低氧诱导因子1α-/-小鼠：2．5月龄组椎间盘软骨组织出现破损和骨化,细胞分布不均匀,软骨细胞减少,椎间盘软骨中Ⅱ型胶原和Sox9表达降低,X型胶原、基质金属蛋白酶13表达增加;4．5月龄组椎间盘软骨损伤更加严重,Ⅱ型胶原蛋白与Sox9表达进一步降低,X型胶原、基质金属蛋白酶13表达进一步上升。②与生理盐水组比较,益气化瘀方干预后苏木精-伊红染色和藏红固绿染色显示软骨骨化和缺损减轻,软骨细胞数目较多,分布较均匀。与生理盐水组比较,益气化瘀方组椎间盘软骨中Ⅱ型胶原和Sox9的表达升高,X型胶原、基质金属蛋白酶13表达减少。说明低氧诱导因子1α基因敲除小鼠出现了椎间盘软骨退变,并且这种退变随着小鼠增龄而加重;益气化瘀方可以减轻低氧诱导因子1α基因敲除小鼠的椎间盘软骨退变。     

血管内皮生长因子及其受体在颈椎病椎体软骨终板中的表达变化

目的： 研究VEGF和VEGFR在终板软骨细胞中的表达，进一步探讨椎间盘退变的发病机理。方法: 应用免疫组化SP染色法检测VEGF和VEGFR在37例颈椎病及11例正常椎体软骨终板中的表达，并对其阳性表达结果进行比较。结果：VEGF在正常终板软骨细胞表达的阳性率为90.9％，与颈椎病终板软骨细胞表达的阳性率（40.5％）相比，差异有显著性 (P<0.05) 。VEGF在正常的终板软骨细胞的表达明显高于退变的终板软骨。VEGFR在正常的终板软骨细胞表达的阳性细胞率为72.7％，与颈椎病终板软骨细胞表达阳性细胞率（37.8％）相比，差异有显著性（P<0.05）。结论：椎体软骨终板的退变过程中VEGF和VEGFR的表达发生明显的变化，终板软骨细胞VEGF分泌的减少导致终板血管芽的维持不足。VEGF参与了椎间盘退变的形成和发展，表明细胞因子在椎间盘退变的发病中可能起非常重要的作用。调节细胞因子VEGF在终板软骨细胞中的表达，可能为椎间盘退变的治疗提供一种新的途径。     

软骨终板形态与椎间盘退变的相关性

背景:以往研究证明多种内环境因素共同作用引发椎间盘退变,最重要的机制为椎间盘软骨终板的退变。目的:分析椎间盘退变与终板形态的关系。方法:回顾性分析62例因椎间盘源性慢性下腰痛和79例因髓核脱出致神经根性症状患者的腰椎MRI正中矢状位图像资料。根据腰椎MRI正中矢状位T1W1图像确定终板形态,T2W1图像确定椎间盘退变程度分级。结果与结论:平坦型和不规则型终板最常见于椎间盘退变人群下腰椎,L5/S1平坦型最多见。髓核脱出组与椎间盘源性慢性下腰痛组中凹陷型终板椎间盘退变程度均较平坦型、不规则型低,平坦型终板椎间盘退变程度较不规则型低(P<0.01)。两组间凹陷型与不规则型终板椎间盘退变程度差异无显著性意义,髓核脱出组平坦型椎间盘退变程度较椎间盘源性慢性下腰痛组高(P<0.05)。提示随着椎间盘退变程度的加重,软骨终板形态有由凹陷型向平坦型、不规则型依次转变的趋势。     

抗骨增生胶囊与葡立胶囊联用对兔颈椎间盘退变的影响

目的：了解家兔退变颈椎间盘内细胞因子、蛋白多糖及软骨终板变化情况,观察抗骨增生胶囊与葡立胶囊联合应用对其产生的影响.方法：新西兰大白兔随机分为5组：正常对照组、模型浅层组、模型全层组、药物治疗浅层组、药物治疗全层组,每组10只.通过切除家兔颈背部浅层、全层肌肉,造成颈动力失衡,诱导颈椎间盘退变,建立颈椎退变模型,给予抗骨增生胶囊与葡立胶囊联用冶疗1个月,测定退变颈椎间盘中细胞因子、蛋白多糖、软骨终板变化.结果：模型组与正常对照组相比较,颈椎间盘中IL-1α（P＜0.01）、TNFα（P＜0.05）含量均明显升高,颈椎软骨终板钙化层明显增厚（P＜0.01）,蛋白多糖明显降低（P＜0.05）,中西药冶疗组IL-1α（P＜0.05）、TNFα（P＜0.05）含量明显降低、蛋白多糖明显升高（P＜0.05）,软骨终板钙化有明显抑制（P＜0.05）.结论：抗骨增生胶囊与葡立胶囊联合应用对退变颈椎间盘多种细胞因子和炎症介质以及软骨终板钙化有明显的抑制作用,可明显恢复颈椎间盘蛋白多糖含量.     

椎间注射转化生长因子β1对免退变腰椎间盘蛋白多糖表达的影响

背景：体外研究证实转化生长因子β1可以促进蛋白多糖合成,延缓椎间盘退变,但体内实验鲜见报道。目的：观察局部应用转化生长凶子β1对兔退变腰卡傩间盘髓核蛋白多糖表达的影响。方法：取30只新西兰人白兔建立兔腰椎间盘退变模型,造模12周,经x射线证实退变后,随机选择6只模型兔及6只未造模正常兔,处死取材。分刖向剩余24只模型兔L4．5椎间隙注射转化生子因子β1和生理盐水。末次给药2,4周取材,间苯三酚法测定兔椎间盘髓核内蛋白多糖的水平。结果与结论：造模12周,兔退变椎间盘髓核中蛋白多糖水甲明显降低（P〈0.01）。绎局部注射转化生子因子β1后,兔退变椎间盘髓核中蛋白多精表达明显增多（P〈0.01）。说明在兔椎间注射转化生子因子β1可以促进髓核蛋白多糖的合成,延缓椎间盘退变。     

白介素—1α在退变腰椎间盘中的分布与神经根性疼痛的相关性

目的：研究白介素－1α（IL－1α）在退变腰椎间盘中的表达与分布，探讨其在坐骨神经痛发生机制中的作用。方法：收集30例腰椎间盘突出症手术切除的椎间盘组织，每例在3个部位取材：（1）凸椎管内与神经根紧贴的椎间盘组织（A组）；（2）软骨终板间的椎间盘（B组）；（3）软骨终板（C组）。6份正常髓核取自4例急性腰椎外伤骨折患。应用IL－1α单克隆技术，采用SP免疫组化染色技术，对标本中IL－1α表达水平进行检测。结果：IL－1α表达水平A组明显高于B组及C组（P＜0．05）。结论：IL－1α在退变腰椎间盘3个部位均有表达，但分别不一致；腰椎间盘突出症术后坐骨神经痛不能缓解，可能与残留椎间盘中IL－1α有关。     

建立椎间盘退变动物模型的方法学回顾

目的：对国内外近年来建立椎间盘退变动物模型的方法及原理进行回顾，并对比各种方法的优缺点及临床相关性，探讨具有操作方法简便，可重复性强的椎间盘退变动物模型建立方法。 资料来源：应用计算机检索Medline1998-01／2004-08的与椎间盘退变动物模型相关的文献，检索词“animal model，intervertebral disc degeneration”，并限定文献语种为英文。 资料选择：对资料进行初审，然后筛除非随机临床试验的研究，对剩余的文献开始查找全文，以是否为随机对照临床试验作为纳入标准。 资料提炼：共收集到15篇关于建立椎间盘退变动物模型的随机和非随机试验研究，14篇文献为随机对照临床试验，纳入综述，排除1篇为非随机试验研究。14篇文献包括448个实验对象，通过对不同的建模方法进行分类，并对不同分组模型优缺点及临床相关性进行评定。 资料综合：椎间盘退变模型可以划分为实验诱发和自发性模型，实验诱发的动物模型又可以细分为机械型（应力型、脊柱不稳致椎间盘退变模型）和结构型（手术直接损伤型、化学损伤型）。①应力动物模型：外部压力作用于椎间盘，导致内部应力的重新分配，随后在局部出现生物学效应。②脊柱不稳致椎间盘退变动物模型：通过手术间接破坏关节面或棘突等支撑组织，反复刺激脊柱肌肉或进行脊柱相邻节段融合等方法间接对脊柱施加过度运动而实现。③手术直接损伤型动物模型：通过外科手术的方法干扰纤维环或终板引发间盘的退变是目前广泛应用的一种建模方法。④化学损伤型动物模型：旨在通过选择性的降解蛋白多糖减少间盘容积从而达到减轻受累神经根压力的作用。通过注入木瓜凝乳蛋白酶的治疗方法已经在兔和狗的动物实验中得以证实。⑤自发性模型：一些特殊的动物种系中，随着年龄的增加，椎间盘的水分、固定电荷密度和膨胀压逐渐降低，而在脊柱周围肌肉和椎体松质骨中无此变化。自发间盘退变的动物模型主要是间盘形态功能之间不稳定的平衡，遗传因素的影响可以改变这种平衡而加速退变。 结论：椎间盘退变动物模型具有一定的局限性，表现在观察时间相对较短，部分观察指标无法监测。小动物椎间盘退变模型与人椎间盘退变之间存在差距，但通过大鼠和兔的椎间盘退变模型仍可对人椎间盘进行很好的研究。     

转化生长因子β2在兔退行性变椎间盘纤维环中的表达

目的：观察转化生长因子β2在兔椎间盘退行性变过程中的表达情况并探讨其意义。 方法：实验于2005-03／2006-01在协和医院骨科实验室进行，手术后动物饲养于协和医院实验动物房。标本的免疫组织化学及蛋白免疫印迹检测在同济医学院免疫学教研组实验室完成。①健康4个月龄雌性日本大白兔12只，采用随机数字法分为假手术组3只、椎间盘退变模型组9只。构建前路纤维环损伤致兔椎间盘退变模型。②于造模的第1，2，4周采用Thompson评分评价椎间盘退变程度。③采用免疫组织化学法检测纤维环内转化生长因子β2分布情况。④采用反转录-聚合酶链反应检测转化生长因子β2基因表达情况。 结果：12只兔均进入结果分析。①兔椎间盘退行性变程度评价：根据Thompson分级法，假手术组3只均为Ⅰ级，模型组第1周2只为Ⅱ级，1只为Ⅲ级，第2周3只均为Ⅲ，第4周3只均为Ⅳ级。椎间盘退行性变程度随着造模时间的延长而加重。②各组大鼠椎间盘标本免疫组织化学结果：假手术组及造模1，2及4周纤维环内转化生长因子β2染色阳性细胞率分别为73．2％，35．7％，19．6％及3．7％，造模第4周组明显低于假手术组（P〈0．01）。③各组大鼠转化生长因子β2反转录-聚合酶链反应检测结果：转化生长因子β2基因的表达随着造模时间的延长而逐渐减弱，造模第4周组较假手术组下降最为明显。 结论：转化生长因子β2在椎间盘内的含量及表达随着椎间盘退行性变程度的加剧而下降，这种下降可能是椎间盘的退行性变机制之一。     

椎间隙感染后椎间盘组织及生化成分改变与椎间盘弥散功能的相关研究

目的研究兔椎间隙感染后不同时间点,椎体软骨终板及髓核组织学改变、生物化学成分变化与椎间盘弥散功能改变的相关性。方法取新西兰兔60只,制作椎间隙感染模型。在术后1、2、4、8、12周,每次随机取椎间隙感染模型兔各8只、对照组兔4只。采用HE染色观察软骨终板组织形态学,免疫组化测定软骨终板下血管内皮生长因子(VEGF)表达,RT-PCR测定髓核组织中Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan蛋白mRNA表达,连续动态增强MRI检测椎间盘弥散功能。结果椎间隙感染后,软骨终板上出现新生毛细血管,VEGF表达逐渐增多,髓核组织内蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量减少,软骨终板弥散功能逐渐增强;感染后4周时,新生毛细血管达到最多,VEGF表达最多,弥散功能达到最佳,4周后逐渐减少,在感染后4周时,蛋白多糖及Ⅱ型胶原破坏达到最强,4周后基质破坏有所修复。软骨终板VEGF表达与椎间盘弥散功能呈正相关关系(r=0.704,P=0.000);蛋白多糖mRNA表达与椎间盘弥散功能呈负相关关系(r=-0.480,P=0.000)。结论椎间隙感染后椎间盘弥散功能处于一个动态变化中,在感染后4周时弥散功能达到最佳。椎间隙感染后软骨终板VEGF表达与椎间盘弥散功能呈正相关关系,髓核中蛋白多糖mRNA表达与椎间盘弥散功能呈负相关关系。     

下腰痛患者的腰椎终板退变与椎间盘退变相关性的影像学研究

目的：探讨下腰痛患者腰椎终板炎（Modic退变）与椎间盘退变的相关性。方法：对90例（270个椎间盘）下腰痛患者常规行腰椎X线和MR检查。终板退变及椎间盘退变分别按Modic终板退变标准（0～3级）与Pearce椎间盘退变标准（Ⅰ～Ⅴ级）对终板和椎间盘进行评估。采用SPSS 11.5统计学软件分析Modic退变与椎间盘退变的相关性。结果：90例下腰痛患者的腰椎终板Modic分级与椎间盘退变Pearce分级存在较强的相关性（Pearson R=0.452，P=0.000），Modic退变分级高，椎间盘退变分级也高。结论：腰椎终板Modic退变分级与椎间盘退变Pearce分级密切相关，提示Modic退变与椎间盘退变在腰椎退变过程中可能互为因果。两者皆为下腰痛的可能原因之一。     

烟酰胺对肿瘤坏死因子α诱导纤维环基质降解的抑制作用

目的:观察烟酰胺对肿瘤坏死因子α诱导纤维环基质降解的抑制作用,并分析其作用途径。方法:实验于2005-10/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室及骨科实验室完成。椎间盘组织取自12只清洁级日本大白兔,兔龄4个月,体质量2.5～3.0kg,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。建立兔椎间盘组织凝胶培养模型,将其分为4组,即正常对照组、烟酰胺组、退变组及治疗组。正常对照组不加入药物;烟酰胺组加入0.5g/L烟酰胺;退变组加入10 μg/L肿瘤坏死因子α诱导纤维环基质降解;治疗组加入0.5g/L烟酰胺和10 μg/L肿瘤坏死因子α。培养1周后比较各组标本纤维环结构(藏红O-快绿染色强度)、糖醛酸含量、Ⅰ,Ⅱ型胶原结构及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达情况(染色阳性细胞率)。结果:①各组兔椎间盘标本纤维环结构比较:治疗组纤维环结构的破坏得到较好的抑制,染色浓度高于退变组。②各组兔椎间盘标本纤维环糖醛酸含量比较:治疗组较退变组增高约48%(t=16.93,P=0.000),与烟酰胺组接近(t=0.71,P=0.657)。③各组兔椎间盘标本纤维环Ⅰ,Ⅱ型胶原结构及分布情况:治疗组板层结构完整性和胶原纹路连续性好于退变组,Ⅰ,Ⅱ型胶原含量之比较正常组升高。④各组兔椎间盘标本纤维环半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性染色率比较:治疗组明显低于退变组(10.3%,17.9%,χ2=5.081,P<0.01)。结论:烟酰胺能够减轻肿瘤坏死因子α对纤维环基质的破坏作用,这种作用与烟酰胺减少纤维环半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3依赖的细胞凋亡有关。     

骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ，Ⅱ型胶原的影响

背景：研究表明,退变椎间盘细胞外基质的主要变化是Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量的减少和Ⅰ型胶原含量的增加。目的：观察腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白2基因(AAV-BMP-2)对兔退变腰椎间盘内髓核Ⅰ,Ⅱ型胶原的影响。方法：将12只新西兰大白兔L2-3,L3-4,L4-5,L5-6椎间盘针刺制造退变模型后随机分为3组,每组4只。其中AAV-BMP-2组兔椎间盘注射AAV-BMP-2,AAV组兔椎间盘注射不携带目的基因的空载体,生理盐水组兔椎间盘注射生理盐水,注射后第8周处死动物取其相应的椎间盘常规石蜡包埋,组织切片,以苏木精-伊红染色观察其髓核组织学变化,免疫组织化学法检测髓核组织Ⅰ型、Ⅱ型胶原表达并进行半定量分析。结果与结论：普通苏木精-伊红染色结果显示AAV-BMP-2组椎间盘内髓核细胞数目较多,呈单个或者簇状分布,髓核结构清晰,无纤维样组织填充。而AAV组和生理盐水组的组织结构相似,髓核内细胞数目少,髓核皱缩干瘪,细胞间为纤维样组织填充且排列紊乱。免疫组织化学染色显示：AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅱ型胶原的表达均高于AAV组和生理盐水组(P<0.05);AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅰ型胶原的表达均低于AAV组和生理盐水组(P<0.05)。结果说明,体内转染AAV-BMP-2能抑制椎间盘髓核细胞表达Ⅰ型胶原,促进椎间盘髓核细胞表达合成Ⅱ型胶原,提示维持椎间盘内胶原的含量、种类,可维持椎间盘内组织学的结构和形态,稳定髓核细胞生长环境,延缓椎间盘的退变。     

Notch-1基因敲除兔骨髓间充质干细胞可阻止椎间盘退行性变吗？

背景：前期实验证明退变椎间盘内Notch-1基因高表达,但骨髓间充质干细胞向髓核样细胞转化时Notch-1的作用尚不明确。目的：观测Notch．1基因敲除后的骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘的作用。方法：①4只体质量0．4-0．5kg新西兰兔麻醉后,取股骨骨髓,以密度梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞。②将针对Notch．1的shRNA及无意空质粒shRNA,瞬时转染入骨髓间充质干细胞,转化生长因子B1诱导转染骨髓间充质干细胞分化。⑨体质量1．0-1．5kg新西兰兔10只,对兔脊柱L3小L4昏L5_63个椎间盘行穿刺抽吸髓核组织造模,将细胞分为转化生长因子p1诱导转染空质粒组、转化生长因子p1诱导转染shRNA-Notch-1质粒组、转化生长因子B1诱导无转染组细胞,于造模2周后分别移植入L3-4、I-4-5、L5-6 3个椎间盘。结果与结论：①细胞移植4周后MR1检测发现,L3-4（无转染组）及L5—6（空质粒组）％T2加权像扫描（％ST2W1）值有明显增加,L4-5（shRNA．Notch．1质粒组）％ST2W1值增加最为显著,与其他2组比较差异有显著性意义（P〈0．05）。②甲苯胺蓝染色可见L4-5（shRNA-Notch-1质粒组）椎间盘组织内蛋白多糖的表达显著高于L3-4（无转染组）及Ls-8（空质粒组）。③RT-PCR和Westernblot检测发现L4—5（shRNA-Notch-1质粒组）椎间盘内Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达明显高于L3-4（无转染组）及L5—6（空质粒组）,差异有显著性意义。结果提示兔退变椎间盘内移植Notch．1基因敲除兔骨髓间充质干细胞,有效修复了退变的椎间盘组织。     

纤维蛋白凝胶基质材料用于组织工程修复兔关节软骨缺损——与Ⅰ型胶原凝胶和混合凝胶性能特征的比较

目的：观察纤维蛋白凝胶、Ⅰ型胶原凝胶、混合凝胶3种不同生物型细胞外基质用于组织工程修复兔关节软骨缺损形态学及性能特征比较。方法：实验于2002-01／2003—12在哈尔滨医科大学附属二院实验中心进行。6月龄日本大耳白兔48只。①人工软骨制备：传代培养兔骨髓基质干细胞，与纤维蛋白原凝胶、Ⅰ型胶原凝胶、纤维蛋白-Ⅰ型胶原混合凝胶混合制成3种人工软骨。②模型制备与动物分组：兔麻醉后取膝关节外侧切口，显露髌股关节面，作直径4．5mm，深3mm转孔获得关节软骨缺损模型。48只兔分为4组，每组12只。纤维蛋白凝胶组，缺损区充填骨髓基质细胞纤维蛋白凝胶；Ⅰ型胶原凝胶组，充填骨髓基质细胞Ⅰ型胶原凝胶；混合凝胶组，充填骨髓基质细胞纤维蛋白-Ⅰ型胶原混合凝胶；空白对照组。不充填材料。术后各组动物膝关节不予外固定，自由活动。③标本观察：分别于4，8，12周每组取3只（6侧膝关节）麻醉后处死，行膝关节大体观察，选择损伤区股骨干切片作苯胺蓝、苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色采用光学显微镜观察，并按改良的Seller评分（0分为正常关节，分数越高表示关节退行性变越严重）进行量化评分。结果：①各组兔膝关节4周及12周时大体形态学观察：4周时：纤维蛋白凝胶组、混合凝胶组为淡粉色半透明的软骨样结构，Ⅰ型胶原凝胶组、空白对照组多数缺损区仍呈暗红色，表面不规则。12周时：纤维蛋白凝胶组、混合凝胶组修复组织与周围软骨平滑过渡高度一致、光泽度较正常软骨略差；Ⅰ型胶原凝胶组、空白对照组修复区多数不平整，中央凹陷且存在龟裂。②各组兔股骨组织切片观察结果：纤维蛋白原凝胶、混合凝胶组各时间点组织化学染色均显著优于Ⅰ型胶原凝胶组和空白对照组；纤维蛋白原凝胶、混合凝胶组无显著差异。③组织切片的Seller评分结果：纤维蛋白凝胶组、混合凝胶组在8，12周均显著低于Ⅰ型胶原凝胶组与空白对照组[8周：（19．7，20．5）分比（27．0，25．1）分，P〈0．05；12周：（7．4，9．1）分比（18．2，20．0）分，P〈0．05]。结论：纤维蛋白凝胶作为支架材料修复缺损软骨，材料成分接近透明软骨，优于Ⅰ型胶原，与纤维蛋白Ⅰ型胶原混合物无显著差异，可作为理想的细胞外基质用于组织工程修复关节软骨缺损。