C57BL/6小鼠微小残留白血病模型的建立

目的 探讨构建C57BL/6小鼠FBL-3微小残留白血病(MRL)模型的方法.方法 将5×106个FBL-3红白血病细胞经尾静脉接种至C57 BL/6小鼠,接种后第3天经尾静脉注射不同剂量环磷酰胺(CTX),观察小鼠生存时间与药物剂量间的关系;根据白血病小鼠生存时间与CTX剂量和与接种FBL-3细胞数量的关系,确定构建小鼠MRL模型所需的化疗药物剂量.结果 C57BL/6白血病小鼠对CTX敏感,随CTX剂量增加白血病小鼠的生存时间逐渐延长,药物剂量与生存时间有较好的回归关系.移植生物试验显示,接种500个FBL-3细胞的小鼠生存时间与接受100 mg·kg-1 CTX化疗白血病小鼠相当.结论每只C57BL/6小鼠经尾静脉接种5×106个FBL-3细胞3d后给予100 mg·kg-1 CTX化疗可以建立MRL动物模型.     

IL-2基因与自杀基因联合转移对小鼠红白血病的治疗作用

用腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因体外转染小鼠红白血病FBL-3细胞,结果CD基因转移后该细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性提高了近1000倍,FBL-3细胞有明显的凋亡发生,且观察到明显的旁观者效应.小鼠体内接种FBL-3红白血病细胞后3天,肿瘤局部注射小鼠白细胞介素2(IL-2)基因的表达载体(Ad-IL-2)和Ad-CD腺病毒载体,然后连续10天给予5-FC 300mg/kg行治疗.结果FBL-3皮下肿瘤的生长明显受到抑制,部分小鼠肿瘤消失.联合治疗小鼠的存活期明显大于单用Ad-IL-2治疗组和单用自杀基因CD与5-FC治疗组.体内免疫功能检测表明,经小鼠自杀基因与IL-2联合基因治疗后小鼠脾细胞的CTL杀伤     

小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞对特异性CTL的体内外诱导作用

目的 探讨白细胞介素-12(IL-12)诱导小鼠红白血病细胞产生的树突状细胞,对白血病特异性CTL细胞的诱导作用,及体内免疫后对抗肿瘤免疫应答的诱导效果.方法:采用4/小时~(51)Cr释放法,检测CTL杀伤活性;观察小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞体内免疫冶疗后对肿瘤的抑制作用,采用了HE染色和电镜等技术,分析肿瘤组织的病理学变化.结果:IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC,在体外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL.采用IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC免疫C57 BL/6小鼠.体内诱导出的CTL杀伤活性明显高于对照组.实验组小鼠能够有效的抵抗野生型FBL-3细胞的再攻击;肿瘤生长受到明显的抑制,组织学观察显示,肿瘤局部有较多炎性细胞浸润和细胞坏死;透射电镜可观察到典型的凋亡征象,结论:IL-12诱导小鼠FBL-3红白血病细胞产生的树突状细胞,在体内外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL,体内免疫后可增强抗肿瘤免疫应答,该结果为白血病的免疫治疗提供了新的途径.     

移植性C57BL/6小鼠FBL-3红白血病模型的建立及其生物学特性

目的探讨利用国内传代培养的FBL-3细胞建立H-2相合C57BL/6小鼠FBL-3红白血病模型的可行性,并观察模型的生物学特性。方法把FBL-3小鼠红白血病细胞经尾静脉接种C57BL/6小鼠,观察小鼠的生存时间和染色体变化,并对濒死小鼠的肝、脾、肺和肾进行病理检查,部分进行电镜检查。结果静脉接种1×10^3-1×10^7个白血病细胞,C57BL/6小鼠发病率分别为100%;接种细胞的数量与存活时间呈线性关系;白血病细胞主要侵及肝、脾、骨髓、肺和肾组织,糖原染色阳性、氯醋酸染色部分阳性,过氧化物酶、碱性磷酸酶、丁酸染色均阴性。电镜下观察到细胞内病毒样颗粒。脾脏和骨髓细胞染色体多数为非二倍体,只表达H-2b。结论经尾静脉接种FBL-3细胞可建立C57BL/6小鼠红白血病模型。     

树突状细胞在体外诱导FBL-3细胞分化为单核细胞的研究

目的 探讨树突状细胞(DC)对白血病细胞的诱导分化作用机制.方法 应用不同浓度的DC培养上清作用于小鼠红白血病细胞(FBL-3细胞),作用72 h后用瑞氏染色观察分化后细胞的大体形态,透射电镜观察分化后细胞的超微结构,流式细胞术观察分化后细胞表面分子CD14的表达情况.结果 瑞氏染色、透射电镜、流式细胞术结果均显示,DC培养上清能诱导白血病细胞分化为单核细胞,其作用强度与DC培养上清中IL-12浓度呈正相关.结论 DC培养上清可诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞,分化后的细胞在大体形态、超微结构、细胞表型分子标志方面符合单核细胞的特点.且DC培养上清诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞的能力与培养上清中IL-12的浓度呈正相关.     

树突状细胞在体外诱导FBL-3细胞分化为单核细胞的研究

目的 探讨树突状细胞(DC)对白血病细胞的诱导分化作用机制.方法 应用不同浓度的DC培养上清作用于小鼠红白血病细胞(FBL-3细胞),作用72 h后用瑞氏染色观察分化后细胞的大体形态,透射电镜观察分化后细胞的超微结构,流式细胞术观察分化后细胞表面分子CD14的表达情况.结果 瑞氏染色、透射电镜、流式细胞术结果均显示,DC培养上清能诱导白血病细胞分化为单核细胞,其作用强度与DC培养上清中IL-12浓度呈正相关.结论 DC培养上清可诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞,分化后的细胞在大体形态、超微结构、细胞表型分子标志方面符合单核细胞的特点.且DC培养上清诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞的能力与培养上清中IL-12的浓度呈正相关.     

过继转输的肿瘤特异性T杀伤细胞在同系小鼠体内维持杀伤功能的研究

本实验采用Friend病毒在C56BL/6(B6)小鼠诱发的FBL-3红白血病细胞,按10~7细胞/ml加丝裂霉素C(MMC)100μg处理,用MMC灭活的FBL-3细胞经腹腔免疫B6小鼠(1×10~7/ml/只),两周后加强一次,2至6周内取脾脏。用这种免疫脾细胞在体外经肿瘤抗原刺激及低剂量rIL-2(5u/ml)作用,诱导和扩增以Lyt-2~ T细胞为主体的、抗FBL-3细胞的特异性Tc细胞。转输Tc细胞(2×10~7/每只鼠)到Cy预处理的同系正常小鼠或荷FBL-3白血病小鼠体内,观察不同因素对维持体内肿瘤特异性Tc细胞活性的影响。实验发现:(1)经肿瘤抗原刺激(转输T细胞时,即0天)和连续短程rIL-2(0.6天,3000U/天)处理正常同系转输小鼠,可使受鼠脾细胞对FBL-3细胞具有杀伤活性,以处理后第七天活性最高,而执行这一功能的是转输入体内的Lyt-2~ T细胞。对照组结果显示,转输正常脾细胞后经同样处理未诱导出对FBL-3细胞有明显杀伤活性的Tc细胞,说明受鼠脾细胞的杀伤活性主要是由转输入体内的供者T细胞所致,而非由于处理因素导致受鼠自身淋巴细胞被诱导激活所致;(2)单独给予rIL-2,即使延长使用时间(0-21天)也不能维持转输的Tc细胞在体内的活性。(3)间断抗原再刺激,联合应用7天rIL-2,以14天为一周期,可长期维持Tc细胞在体内的特异性杀伤功能,若间断单独使用     

GM-CSF/IL-4基因修饰的瘤苗不同的免疫途径诱导不同免疫反应的观察

对细胞因子基因修饰瘤苗的研究表明,IL-2、IL-4、IFN-γ、GM-CSF等一系列细胞因子基因以不同载体转入肿瘤细胞制成瘤苗后皮下免疫小鼠,均可增强机体抗肿瘤免疫力,其机制可能是由于瘤苗分泌的细胞因子促进了免疫细胞对肿瘤抗原的识别、提呈及对肿瘤细胞的杀伤能力.有文献报道,逆转录病毒介导的GM-CSF和IL-4共同转染瘤苗可以有效激发机体抗肿瘤免疫力,为探讨不同途径瘤苗免疫后机体的免疫反应,我们采用皮下、腹腔、脾内、静脉四种途径接种GM-CSF、IL-4基因双重转染的小鼠红白血病细胞FBL-3瘤苗,发现免疫途径不同,所激发的免疫应答类型不同,诱导机体生成的免疫力不同,提示某些瘤苗应用时应选择适当的免疫途径.     

IL-3基因修饰的骨髓基质细胞辅助大剂量化疗后造血功能恢复

为研究基因治疗在造血功能损伤后恢复中的应用,本课题以携带小鼠IL-3基因的复制缺陷型重组腺病毒载体转染骨髓基质细胞,对大剂量化疗后的小鼠进行脾内移植观察造血功能的恢复情况.结果表明,缺陷型腺病毒载体能有效地转染小鼠原代骨髓基质细胞,转染效率在80%以上(MOI=10);基因修饰的骨髓基质细胞体外分泌IL-3的水平可达110U/ml/10~6细胞/24小时;在大剂量环磷酰胺治疗后脾内移植IL-3基因修饰的基质细胞能有效地升高实验小鼠外周血白细胞总数;病理检测发现IL-3基因修饰的基质细胞治疗组小鼠脾脏和骨髓中细胞增生较其它组明显活跃;经IL-3基因修饰的基质细胞治疗组小鼠脾淋巴细胞对ConA反应明显增强.结果提示IL-3基因修饰的骨髓基质细胞体内移植对大剂量化疗后机体造血与免疫功能的恢复都有较好的促进作用.     

联合应用IL-2和IL-7对T细胞体外增殖及功能的增强效应

本文研究了联合应用IL-2和IL-7在体外T细胞培养系统中对小鼠T细胞生长及功能的调节作用。结果表明:单独使用IL-2或IL-7均能增强T细胞对ConA或特异性抗原刺激诱导的增殖反应,但联合使用IL-2和IL-7具有更加显著的协同刺激作用。C57BL/6小鼠抗FBL-3肿瘤特异性T细胞系在IL-2与IL-7联合培养系统中,不但T细胞数量明显增加,且能在保持特异性功能的同时,延长T细胞体外抗原刺激周期。此外,这一细胞因子的组合方案,可大大降低IL-2的应用剂量,避免大剂量IL-2临床应用时所产生的副作用。     

IL-3基因转染的黑色素瘤细胞株的建立及其体外生长性质的观察

为了探讨不同细胞因子基因修饰的肿瘤细胞制备的瘤苗对膀胱癌的治疗作用,作者构建了表达不同细胞因子的逆转录病毒载体N_2/IL-2、N_2/CMV/GM-CSF、DC/TK/IL-1α、N_2/CMV/IL-1β、DC/SV/R/IFN-γ,将其分别转染包装细胞GP env AM12,获得含病毒的细胞上清,再将其分别感染小鼠膀胱癌细胞MBT-2,经筛选获得不同的高分泌株。将这些高分泌株分别接种C3H小鼠后发现分泌IFN、IL-1α、IL-1β或GM-CSF的MBT-2细胞在体内的生长较野生型MBT-2细胞缓慢。而分泌IL-2的MBT细胞在体内的生长受到完全的抑制。在裸鼠体内,仅分泌IL-2的MBT-2细胞的生长受到抑制。免疫组化分析表明,在这些细胞接种处出现CD4~ 及CD8~ T细胞的浸润,在     

EL_4瘤细胞产生的IL-2可诱导NK细胞和T细胞介导免疫

全身应用rIL-2治疗癌症患者,尽管具有明显的抗肿瘤作用,但由于严重的毒副作用,其疗效受到一定限制。为探讨一种避免全身毒副反应的IL-2免疫治疗方法,以逆转录病毒(PLJ)为载体,将IL-2cDNA转染小鼠胸腺瘤EL_4细胞,用IL-2依赖细胞株CTLL2筛选一株高分泌IL-2(500IU/ml/24h/5 ×10~5细胞)细胞株(EL_(4P)IL-2),另外以同样方法构建不分泌IL-2的EL_(4P)细胞株为对照株,体外大量扩增这两种细胞株。将多种剂量的EL_(4P)IL-2或EL_(4P)细胞分别皮下接种于C57BL/ 6小鼠,观察诱发肿瘤的情况,结果发现,小鼠对EL_(4P)IL-     

IFN-γ对白血病细胞株FBL-3细胞生物学行为的影响

目的探讨IFN-γ对白血病细胞增殖、细胞周期、凋亡及侵袭等生物学行为的影响。方法用不同剂量的IFN-γ处理小鼠白血病细胞株FBL-3,MTT比色法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测瘤细胞周期分布和凋亡率;根据瘤细胞穿过Matrigel胶的能力,检测瘤细胞体外侵袭力,以未处理组作为对照。结果（1）小剂量IFN-γ（5 ng/ml）对白血病（FBL-3）细胞增殖没有明显作用（P＞0.05）,50~200 ng/ml IFN-γ对白血病细胞株FBL-3细胞作用48小时,存活率均可达到80%左右;但是大剂量IFN-γ（500 ng/ml）则明显抑制细胞的增殖(P＜0.05),存活率不足50%;（2）FBL-3细胞经IFN-γ处理后,G0/G1期细胞明显增多,G₂/M期细胞相对减少,提示细胞被阻滞在G0/G1期;（3）IFN-γ在促白血病细胞的凋亡和抑制其体外侵袭能力上存在明显剂量依赖性(P＜0.05)。结论IFN-γ通过剂量依赖性方式抑制白血病细胞的增殖、促凋亡、降低细胞的侵袭能力,具有抗白血病作用。     

应用X线照射后的Balb／c小鼠制备白血病模型的方法学研究

目的：探索用SPF级Balb／c小鼠经x线照射后,尾静脉注射转染GFP及NeoR基因的K562细胞株以制备白血病模型的方法。方法：实验组小鼠分别经x线照射2Gy和3Gy,24小时后取对数生长期的K562（GFP＋／Neo＋）细胞尾静脉注射2×10 6个／只。对照组不予特殊处理。结果：实验组在接种5—7天时发病,分别于30、24天内全部死亡;生存天数显著短于对照组（P〈0．01）。体重较对照组显著下降（p〈0．05）。小鼠的白血病发病率为100％,无自发缓解。随照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中自血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP＋细胞和NeoR基因在外周血、骨髓、肝、脾中的存在。结论：Balb／c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以获得白血病模型。     

细胞因子-受体介导靶向杀伤白血病细胞的新策略IL-6/IL-6R系统介导重组IL-6-PE40外毒素融合蛋白的特异性杀伤

鉴于白血病细胞异常高地表达IL-6/IL-6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们本研究率先在国际上开展了利用IL-6/IL-6R系统介导重组IL-6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL-6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨.构建并表达及纯化IL-6-PE40;应用核酸及蛋白质序列软件GOLDKEY系统计算机模拟分析IL-6-Linker-PE40及IL-6-PE40的柔性、抗原性、亲水性及表位等分子生物学特性;建立了表达人IL-6R的大鼠急性早幼粒白血病细胞模型;鉴定了人IL-6R基因在LT12中的表达;分析了人IL-6R基因的整合对LT12-IL-6R~ 细胞模型生物学特征的影响及IL-6-PE40对白血病及正常造血细胞的体外作用和IL-6R的白血病及正常大鼠的体内效应.结果发现:①利用     

肿瘤抗原多肽诱导的CD8~+CTL的体内外抗瘤效应

利用海绵移植模型,将Friend小鼠白血病病毒gag编码的二个多肽CCLCLTVFL(gPr80 gag 85-93)和RSPTNLAKV(Pr65 gag P30 131-139)分别注入正常或经FBL-3肿瘤细胞免疫过的C57BL/6小鼠皮下的植入海绵中,10天后,收集海绵中浸润淋巴细胞,在体外用免疫肽周期性刺激培养扩增。实验结果表明:用多肽体内免疫正常或经FBL-3免疫的B6小鼠均能诱导出对免疫多肽特异的CD8~ CTL。其中,P85-93多肽诱导的CD8~ CTL除能杀伤该多肽致敏的同系靶细胞外,还能特异性杀伤FBL-3瘤细胞.抗原多肽诱导的CD8~ CTL在体外经用免疫多肽致敏的同系小鼠脾细胞作周期性刺激并在低浓度IL-2的条件下培养,可长期生长并大量扩增。用体外培养扩增的P85-93多肽特异性CD8~ CTL过继转输治疗FBL-3荷瘤小鼠,能有效治愈FBL-3白血病荷瘤小鼠。上述结果表明,用肿瘤抗原多肽替代肿瘤细胞体内免疫动物可诱导特异性抗瘤效应的CD8~ CTL,并可在体外扩增用于肿瘤过继性免疫治疗。     

α-CD4单抗对α-CD3单抗刺激和IL-2诱导的肿瘤特异性T细胞的扩增和杀瘤活性的影响

在用a-CD3单抗和20U/ml rIL-2扩增FBL-3红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞,获取了具有高度杀瘤活性的、FBL-3特异性的T细胞的基础上,观察了a-CD4单抗对FBL-3特异性的T细胞的增殖、杀瘤活性及表型的影响.本研究采用四种不同的培养方案:(1)单独使用a-CD3单抗(CD3组);(2)单独使用20U/ml rIL-2(IL-2组);(3)使用a-CD3单抗48小时后,加入a-CD3单抗和20U/ml rIL-2(CD3 IL-2组);(4)a-CD3单抗和a-CD4单抗同时使用48小时后,加入a-CD3单抗、a-CD4单抗和20U/ml rIL-2(CD3 CD4 IL-2组).实验结果显示,CD3 IL-2组在20天培养过程中细胞扩增为590倍,在培养12天时对FBL-3的最大杀伤活性为83.6%;CD3 CD4 IL-2组在20天培养过程中细胞扩增为950倍,在培养12天时对FBL-3的最大杀伤活性     

应用X线照射后的Balb/c小鼠制备白血病模型的方法学研究

目的:探索用SPF级Balb/c小鼠经X线照射后,尾静脉注射转染GFP及NeoR基因的K562细胞株以制备白血病模型的方法。方法:实验组小鼠分别经X线照射2Gy和3Gy,24小时后取对数生长期的K562(GFP+/Neo+)细胞尾静脉注射2×106个/只。对照组不予特殊处理。结果:实验组在接种5-7天时发病,分别于30、24天内全部死亡;生存天数显著短于对照组(P<0.01)。体重较对照组显著下降(P<0.05)。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP+细胞和NeoR基因在外周血、骨髓、肝、脾中的存在。结论:Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以获得白血病模型。     

TNF-α和IL-6在急性淋巴细胞白血病儿童血清中的水平及其临床意义

目的 探讨急性淋巴细胞白血病患儿血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6水平及其临床意义.方法 选择80例急性淋巴细胞白血病患儿,其中初诊44例、完全缓解24例、难治复发12例,同期收集在我院行体检的健康儿童50例为对照组.检测所有研究对象血清中TNF-α和IL-6水平.分析急性淋巴细胞白血病初诊患儿血清TNF-α和IL-6水平与临床特征的关系.结果 与对照组相比,急性淋巴细胞白血病初诊组患儿血清TNF-α和IL-6水平明显降低(P<0.01).与初诊组相比,急性淋巴细胞白血病完全缓解组患儿血清中TNF-α和IL-6明显升高(P<0.01).与初诊组相比,急性淋巴细胞白血病复发难治组患儿血清中TNF-α和IL-6水平明显降低(P<0.01).急性淋巴细胞白血病初诊患儿血清中TNF-α和IL-6水平与其年龄、性别、FAB分型、肝肿大及淋巴结肿大无明显相关性(P>0.05),与危险度分型呈显著相关(P<0.01).结论 急性淋巴细胞白血病患儿血清中TNF-α和IL-6水平明显降低,与急性淋巴细胞白血病患儿的危险度分型呈显著性相关.     

DBA／2 小鼠微小残留白血病模型的构建

 目的　探讨建立一种细胞系和种鼠传代方便、重复性好的微小残留白血病模型的方法。方法　选用国际标准近交系DBA／2小鼠84只，接种不同数量L1210白血病细胞，观察接种白血病细胞数量与小鼠存活时间之间的关系；每只小鼠接种L1210白血病细胞1×106个后，第3天行不同剂量环磷酰胺（CTX）化疗，观察化疗剂量与小鼠存活时间之间的关系。结果　小鼠存活时间随接种细胞数量增加而逐渐缩短；白血病小鼠存活时间随化疗剂量增加而逐渐延长；观察接种不同数量白血病细胞的小鼠和接受不同剂量CTX化疗的白血病小鼠的生存趋势，显示接种500个白血病细胞小鼠的存活时间相当于用CTX剂量125 mg／kg化疗白血病小鼠生存时间，两者均为28 d左右。结论　DBA／2小鼠接种L1210白血病细胞1×106个／只后第3天采用CTX 125 mg／kg化疗可以成功建立微小残留白血病模型，此时小鼠体内白血病细胞数约为500个。