应用X线照射后的Balb／c小鼠制备白血病模型的方法学研究

目的：探索用SPF级Balb／c小鼠经x线照射后,尾静脉注射转染GFP及NeoR基因的K562细胞株以制备白血病模型的方法。方法：实验组小鼠分别经x线照射2Gy和3Gy,24小时后取对数生长期的K562（GFP＋／Neo＋）细胞尾静脉注射2×10 6个／只。对照组不予特殊处理。结果：实验组在接种5—7天时发病,分别于30、24天内全部死亡;生存天数显著短于对照组（P〈0．01）。体重较对照组显著下降（p〈0．05）。小鼠的白血病发病率为100％,无自发缓解。随照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中自血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP＋细胞和NeoR基因在外周血、骨髓、肝、脾中的存在。结论：Balb／c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以获得白血病模型。     

增强子结合蛋白C/EBPα对白血病BALB/c裸鼠的肿瘤抑制作用

  目的　探讨增强子结合蛋白C／EBPα在白血病裸鼠体内的肿瘤抑制作用。方法　将30只BALB／c裸鼠随机分转染组（10只）、空载组（10只）、对照组（10只）,建立皮下瘤模型,并将30只BALB／c裸鼠如上分组建立白血病模型,将C／EBPα稳定表达细胞株pEGFP-C／EBPα-K562、空载细胞株pEGFP-K562及白血病细胞株K562分别经皮下和尾静脉注射到相应组裸鼠体内,形成皮下瘤和血液病模型。观测皮下肿瘤的变化,应用TUNEL检测细胞的凋亡,瑞特-吉姆萨染色观察血液病模型裸鼠外周血和骨髓中白血病细胞增殖能力,RT-PCR检测增殖相关基因的表达。结果　皮下瘤模型中pEGFP-C／EBPα-K562组肿瘤质量及最大直径为（2.4±0.1）g和（11±2）mm,空载组和对照组分别为（5.1±0.3）g、（19±3）mm和（5.7±0.4）g、（23±3）mm（均P＜0.05）,TUNEL检测发现pEGFP-C／EBPα-K562组肿瘤细胞凋亡明显增加（P＜0.05）;血液病模型鼠外周血可见白血病细胞,pEGFP-C／EBPα-K562组白血病细胞增殖能力明显低于空载组和对照组,可见明显细胞分化现象,RT-PCR检测发现p53基因上调和c-myc基因下调。结论　增强子结合蛋白C／EBPα在白血病小鼠体内具有促进肿瘤细胞凋亡和抑制白血病细胞增殖的能力,并能促进白血病细胞分化。C／EBPα的白血病抑制作用可能是通过对相应基因的调控来实现。     

人白血病-NOD／SCID小鼠髓外浸润模型的建立

目的:通过给NOD/SCID小鼠尾静脉注射白血病人骨髓单个核细胞(BMMNC)或CEM细胞株的方式,建立人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型,并进行模型鉴定.方法: 将36只NOD/SCID小鼠经137Cs全身照射270cGy后,随机分为4组,每组9只,24h内尾静脉注射接种白血病人BMMNC或CEM细胞系.实验Ⅰ组: BMMNC1×107/只;实验Ⅱ组: BMMNC2×107/只;实验Ⅲ组: CEM细胞1×107/只;对照组:生理盐水0.2ml/只.持续观察其一般情况和生存时间,监测外周血白细胞计数和涂片,并应用组织病理、流式细胞术等监测白血病细胞髓外浸润表现.结果: 注射4-8周后,三组实验组均发生髓外浸润,成功建立人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型.实验Ⅰ组有5只成功建立模型;实验Ⅱ组7只成功建立模型;实验Ⅲ组9只均成功建立模型. 结论: 应用尾静脉注射白血病人BMMNC或CEM细胞株的方法,可成功建立人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型,且尾静脉注射白血病人BMMNC成模率高,生存时间长,为白血病髓外浸润机制的研究和抗白血病髓外浸润药物的筛选提供了良好的实验模型.     

抑癌基因p16INK4a与p53抑制白血病细胞株生长作用的比较

目的比较野生型p16INK4a、p53抑癌基因的表达对白血病细胞株K562和HL60的生长抑制。方法采用脂质体介导野生型p16INK4a、p53抑癌基因转染K562、HL60细胞并进行G418筛选,免疫印渍检测p16INK4a、p53基因的表达,通过细胞生长曲线检测细胞活力,流式细胞仪进行细胞DNA周期分析及细胞凋亡分析,采用联苯胺氧化试验检测K562细胞的分化。结果转染后p53、p16INK4a在K562及HL60细胞中表达;与对照细胞相比,实验组细胞生长受到明显的抑制,G1期细胞数增加,S期细胞减少。与p16INK4a相比,抑癌基因p53使细胞表达Annexin V增加,显示出更强的致凋亡现象,尤其在HL60细胞株。结论抑癌基因p16INK4a、p53能有效抑制白血病细胞株的生长,可能更适合复发、难治性白血病的基因治疗。     

MDR1基因下调逆转人白血病阿霉素耐药细胞株K562/ADM的耐药性

目的：探讨RNA干扰（RNAi）人MDR1基因对人白血病阿霉素耐药细胞株K562/ADM耐药性的影响。方法：应用针对人MDR1基因的RNAi质粒pENTRTM/U6-MDR1转染人白血病阿霉素耐药细胞株K562/ADM和亲本细胞株K562,48 h后实时荧光定量PCR检测MDR1 mRNA表达,流式细胞术检测P-gp蛋白表达和P-gp功能,MTT法检测细胞对ADM的耐药性。结果：与未转染细胞相比,K562/ADM耐药细胞pENTRTM/U6-MDR1组的MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达和功能均显著下降（ P <0.05）,对阿霉素的耐药性显著降低（ P <0.05）。结论：MDR1基因下调可逆转人白血病阿霉素耐药细胞株对阿霉素的耐药性。     

CD19基因过表达K562细胞株及NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立

目的 建立人CD19基因过表达的K562细胞株(CD19-K562)NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型.方法 克隆人CD19基因构建MigR1-CD19反转录病毒载体,转入Plat-A包装细胞,病毒上清转染K562细胞,反转录聚合酶链反应(PCR)及流式细胞术检测转染细胞CD19基因和蛋白表达,体外反复传代获得CD19-K562稳定转染细胞株,锥虫蓝染色,细胞计数检测细胞增殖,Annexin V/碘化丙啶(PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡.CD19-K562细胞株皮下接种NOD-SCID小鼠并经体内外传代后建立移植瘤亚系CD19-K562-a,建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型.应用反转录PCR、瑞特染色、免疫组织化学等方法验证CD19-K562-a细胞性质.结果 成功建立了人CD19-K562细胞稳定株,CD19阳性率(99.80±0.17)％.CD19-K562细胞增殖、凋亡未受转染及传代影响.CD19-K562细胞稳定株皮下接种NOD-SCID小鼠后经体外结合体内传代建立移植瘤亚系CD19-K562-a,其CD19阳性率为(99.78±0.04)％,CD19-K562-a和CD19-K562细胞均呈未分化形态.CD19-K562-a皮下接种NOD-SCID小鼠成功建立移植瘤模型,CD19-K562-a瘤体CD19基因表达强阳性.结论 通过构建MigR1-CD19重组载体获得CD19基因过表达的K562稳定转染细胞株(CD19-K562),同时采用体外结合体内传代建立稳定成瘤的NOD-SCID小鼠移植瘤亚系CD 19-K562-a并成功建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型.     

抑癌基因p16INK4a与p53抑制白血病细胞株生长作用的比较

 目的 比较野生型p16INK4a、p53抑癌基因的表达对白血病细胞株K562和HL60的生长抑制。方法 采用脂质体介导野生型p16INK4a、p53抑癌基因转染K562、HL60细胞并进行G418筛选，免疫印渍检测p16INK4a、p53基因的表达，通过细胞生长曲线检测细胞活力，流式细胞仪进行细胞DNA周期分析及细胞凋亡分析，采用联苯胺氧化试验检测K562细胞的分化。结果 转染后p53、p16INK4a在K562及HL60细胞中表达；与对照细胞相比，实验组细胞生长受到明显的抑制，G1期细胞数增加，S期细胞减少。与p16INK4a相比，抑癌基因p53使细胞表达Annexin V增加，显示出更强的致凋亡现象，尤其在HL60细胞株。结论 抑癌基因p16INK4a、p53能有效抑制白血病细胞株的生长，可能更适合复发、难治性白血病的基因治疗。     

辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Smad 7基因在体表达的实验研究

目的研究辐射诱导下Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达与放射剂量及放射后时相间的关系。方法将Egr1基因启动子的放射敏感元件和Smad7cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内,制备成AD.EgrSmad7。小鼠气管内给AD.EgrSmad7,24h后单次全胸照射。324只小鼠随机分组进入实验,γ线8Gy照射后不同时间取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究照射后Smad7基因肺内表达的时效关系。108只小鼠随机分组进入实验,以不同剂量照射后5h取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究Smad7基因肺内表达与放射剂量的关系。采用Westernblot印迹法检测小鼠肺组织Smad7蛋白表达。结果γ线照射可明显诱导Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Smad7基因表达量与照射剂量和照射后间隔时间有关,单次照射0～12Gy间Smad7蛋白表达量随剂量升高而增加,15Gy时下降。照射后2～9hSmad7蛋白表达量最高(P<0.05),而后降低,15h降至接近正常水平。结论以腺病毒为载体,经射线诱导Egr1基因启动子能够调控Smad7基因体内表达,Smad7基因表达量与放射剂量及放射后间隔时间有关。     

X线照射对鼻咽癌细胞hMSH2和hMLH1表达的影响

目的研究X线照射对鼻咽癌细胞中错配修复基因hMSH2和hMLH1表达的影响,探讨放射损伤后肿瘤细胞的DNA错配修复机制。方法将鼻咽癌CNE-1细胞分为实验组和对照组,对2组细胞进行X线分次外照射。实验组每次照射剂量为2Gy,总剂量为10Gy。对照组每次照射剂量为0Gy。应用RT-PCR、免疫细胞化学及Western blot方法,检测照射终止后不同时间点细胞hMSH2和hMLH1的表达。结果实验组细胞在照射后hMSH2mRNA和蛋白的表达均显著强于对照组(P<0.01);hMLH1mRNA及蛋白表达与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论放射可以诱导鼻咽癌细胞hMSH2表达;hMSH2对放射造成的DNA损伤可能有修复作用,这可能是临床上鼻咽癌放疗敏感性降低的原因之一。     

益康唑体外净化后自体骨髓移植治疗白血病小鼠的实验研究

 目的　建立一个小鼠急性髓系白血病（AML）净化后骨髓移植的模型并探讨益康唑（Econazole, Ec）药物净化的效果。方法　利用小鼠P815 AML细胞转染新霉素抗性基因，即NeoR基因后与小鼠骨髓细胞混合，体外短期培养净化；通过移植后血液系统恢复，白血病微小残留病变和小鼠的存活进行评估。结果　接受放射治疗后经尾静脉注射P815/NeoR细胞而未经净化的小鼠100 %可检测到白血病细胞；Ec体外净化后骨髓移植小鼠造血恢复没有延迟，而残留白血病细胞阳性率明显降低且小鼠的总生存明显改善。结论　实验所设计的P815/NeoR小鼠AML净化后骨髓移植模型简单易行、重复性好；Ec可用于AML的净化后骨髓移植。     

The severe combined immunodeficient (SCID) mouse as a model for human myeloid leukemias.

Recent work has demonstrated the ability of lymphoblastic leukemias of pre-B- and T-cell origin to grow in severe combined immunodeficient (SCID) mice with a pattern reminiscent of the human clinical disease. Here, we investigated the possibility of engrafting human myeloid leukemias using both established cell lines and primary patient material. Whereas the two growth factor-independent cell lines K562 and U937 grew aggressively and induced leukemia in these animals, three other myeloid cell lines which require interleukin 3 or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor for continuous growth in vitro failed to induce disease. Primary bone marrow and peripheral blood cells from five out of seven patients with different types of myeloid leukemias (undifferentiated, megakaryoblastic, monoblastic and chronic myelogenous leukemia in blast crisis) induced patterns of leukemic infiltration that were distinct for each leukemia subtype. The diagnosis of leukemia in SCID mice was established by microscopic detection of myeloblasts in the bone marrow, peripheral blood and, in some instances, in extramedullary sites, including the central nervous system and gonads. The karyotype and phenotype of the blasts recovered from mouse tissues were identical to those of the original patient cells. Moreover, human specific ALU sequences were amplified from the bone marrow DNA by polymerase chain reaction. Despite their ability to grow in vivo by serial transfers in SCID mice, the leukemic cells recovered from mouse tissues could not be maintained in vitro, even in the presence of recombinant cytokines. Overall, these data indicate that the SCID mouse may represent a useful animal model for human myeloid leukemias and for the development of new pharmacological and molecular approaches to therapy.     

P2X家族受体在急性T淋巴细胞白血病小鼠中表达的特点

摘 要 目的：探讨不同P2X家族受体在小鼠急性T淋巴细胞白血病发展中的表达变化规律。方法：制备Notch1过表达小鼠GFP+T细胞急性淋巴细胞白血病移植模型,流式术分选CD45.2+GFP+白血病细胞,实时定量PCR检测P2X受体家族的表达变化,荧光分光光度计检测P2X7受体介导的钙离子浓度的变化。结果：对照组和白血病组小鼠骨髓细胞表达除P2X5外的其他6种P2X家族受体。Notch1过表达导致的小鼠白血病发展过程中,P2X7的表达水平逐渐升高,P2X1和P2X3的表达水平逐渐降低,而P2X2、P2X4和P2X6表达水平没有显著变化;分选后的CD45.2+GFP+白血病细胞中,P2X家族受体的表达呈现相同的规律。对照组和白血病组小鼠骨髓细胞中P2X7受体在激动剂苯甲酰-苯甲酸ATP（BzATP）的刺激下都能介导细胞内钙离子浓度升高,但白血病组小鼠骨髓细胞内钙离子处于持续高浓度状态,而对照组小鼠细胞内钙离子浓度短暂升高后逐渐下降;P2X7介导的这种钙离子反应可被其特异的拮抗剂KN62所阻断。结论：P2X受体家族中P2X1、P2X3和P2X7的表达变化与小鼠急性T淋巴细胞白血病的发展相关,提示其介导的细胞间通讯可能在白血病发展中发挥重要作用。     

Lipocalin 2 is required for BCR-ABL-induced tumorigenesis

Our previous studies indicate that reduction of lipocalin 2 (mouse 24p3) expression by either anti-sense or siRNA approaches strongly reduces the overgrowth of BCR-ABL+ mouse myeloid 32D in marrow and spleen of NOD/SCID mice. In this study, we used the mouse bone marrow transplant model to further explore the role of 24p3 in BCR-ABL-induced leukemia. Consistent with our previous findings, when using non-irradiated mice as recipient, donor marrow cells expressing BCR-ABL but lacking 24p3 did not cause leukemia or any disease after 75 days, whereas all mice receiving wild type BCR-ABL donor cells died with CML-like disease. An agar clone of the BCR-ABL+ human CML cell line K562 (C5) that secretes relatively high levels of lipocalin 2 (human NGAL) induced suppression of hematopoiesis in spleen and marrow of mice, leading to early death in contrast to parental K562 or K562 clone (C6) expressing low amounts of NGAL. Compared with K562 cells, overexpressing NGAL in K562 led to a higher apoptosis rate and an atrophy phenotype in the spleen of the inoculated mice. Plasma from both leukemic mice and CML patients showed elevated lipocalin 2 levels compared with healthy individuals. Moreover, we found that a primary stable cell line from wild-type mouse marrow cells expressing BCR-ABL caused solid tumors in nude mice whereas a similar BCR-ABL+ cell line from 24p3 null mice did not. These findings demonstrate that lipocalin 2 has at least two functions related to tumorigenesis, one involving apoptosis induction of normal hematopoietic cells and the other being tissue invasion by leukemia cells.     

逆转录病毒介导高效的白血病细胞基因转移

目的建立安全高效的逆转录病毒介导的基因转移系统,为白血病基因治疗提供实验基础。方法分别用脂质体转染和小鼠逆转录病毒转导方法,将含标志基因ＮｅｏＲ的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ导入双嗜型包装细胞ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２,获得重组逆转录病毒;用含病毒上清感染白血病细胞系（ＮＢ４、Ｕ９３７和ＴＨＰ－１）,并分析对Ｋ５６２细胞的转导效率。结果脂质体ＤＯＳＰＥＲ转染法获得病毒滴度为８．０×１０５ＣＦＵ／ｍｌ,而病毒感染法高达１．６×１０７ＣＦＵ／ｍｌ。经Ｇ４１８选择,ＰＣＲ证实ＮｅｏＲ基因被整合到白血病细胞基因组中,巢式ＰＣＲ与补救分析均未检测到辅助病毒存在。单个集落Ｋ５６２细胞的ＰＣＲ分析证实,基因转移效率可达９３．３％～１００％。结论逆转录病毒介导的基因转移系统是高效、安全的,有助于人类白血病的基因治疗研究。     

急性单核细胞白血病细胞核基质蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的 :制备抗急性单核细胞白血病细胞核基质蛋白的特异性单抗。方法 :SDS- PAGE分析正常骨髓细胞与急性单核细胞白血病细胞核基质蛋白的差异。用急性单核细胞白血病细胞核基质免疫 Balb/ c小鼠 ,利用杂交瘤技术制备了一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 8E7,并对其作了初步鉴定。结果 :免疫组化结果显示 ,8E7单抗与急性单核细胞白血病细胞核仁和胞质反应 ,与正常骨髓单核细胞胞核及红白血病细胞株 K5 6 2细胞胞质反应。Western Blotting结果表明 ,8E7单抗与电泳图谱上急单白血病细胞核基质 94k D的蛋白反应 ,与正常骨髓细胞核基质 2 7k D的蛋白反应。结论 :对 8E7单抗反应蛋白的进一步研究有助于阐明白血病的发病机制。     

FBXW7在小鼠急性T淋巴细胞白血病模型中的表达

目的探讨抑癌基因FBXW7在Notch1诱导的小鼠白血病发展中的表达变化规律。方法采用Notch1过表达小鼠急性T淋巴细胞白血病移植模型,在发病不同阶段分离骨髓单个核细胞,并在发病晚期用流式细胞术分选CD45.2^GFP＋白血病细胞。实时定量PCR方法检测FBXW7的表达变化。结果对照组和白血病组小鼠骨髓细胞均表达FBXW7。Notchl过表达导致的小鼠白血病发展过程中,FBXW7在对照小鼠中表达水平逐渐升高;而在白血病小鼠中,随着白血病发展,表达水平逐渐下降,第12天降至对照组的1／60分选后的CD45.2＋GFP＋白血病细胞低表达FBXW7。结论FBXW7在小鼠白血病模型中低表达,提示FBXW7介导的泛素化降解途径异常可能与Notchl诱导小鼠白血病发生、发展相关。     

Wnt5a修饰的bMSCs对白血病小鼠造血及白血病细胞生长的影响

探讨Wnt5a基因修饰的骨髓间充质干细胞（bMSCs）对急性髓系白血病小鼠体内造血和白血病细胞生长的影响。方法:外周血瑞氏染色、骨髓流式细胞仪鉴定移植性HL60人白血病重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型。造模成功的SCID小鼠,随机分为实验组（A组:Ad5-Wnt5a-bMSCs+模型小鼠）;对照组（B组:Ad5-GFP-bMSC+模型小鼠;C组:bMSC+模型小鼠;D组:模型小鼠）。RT-PCR检测外源性Wnt5a基因经骨髓腔移植入白血病小鼠模型后的定植情况。骨髓MSC及CFU-Mix培养、流式细胞仪、组织细胞化学及组织病理检测白血病小鼠移植前后各组外周血、骨髓、肝、脾、肾中的白血病细胞以及骨髓造血的变化。结果:成功建立急性髓性白血病模型;外源性Wnt5a基因转染人bMSCs,转染率达37.38%。外源性Wnt5a基因成功定植于受体骨髓中。Wnt5a基因修饰bMSCs移植后,与对照组比较,实验组SCID小鼠生存率明显提高,差异有统计学意义（P<0.05）;外周血有核细胞及瘤细胞计数明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;CFU-Mix和MSC集落生长恢复较快,集落数明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）;小鼠骨髓、肺、肝、脾、肾CD33阳性率明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:Wnt5a基因修饰的bMSCs在体内能有效地抑制白血病细胞生长,支持骨髓造血。