猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定猪带绦虫重组双歧杆菌(Bb)(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗。方法用疏水甘氨酸接头连接TSO45W-4B和TSOL18编码基因,通过全基因合成方法合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因。将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18。电穿孔法将该质粒导入Bb,构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果全基因合成789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段。从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切得到4 944bp的pGEX-1λT载体片段和789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,与预期结果相符;以该重组质粒为模板进行PCR扩增得到789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,经测序基因片段为789bp,与预期大小相符。结论成功构建了猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,为该疫苗的表达及免疫原性研究奠定了基础。     

猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗不同保存条件下的稳定性研究

目的 研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组双歧杆菌(Bb)疫苗在不同保存条件下的稳定性。方法 分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转入长双歧杆菌(B.longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum,分别置于不同条件下保存,取出菌液,抽提质粒,电泳检测,进行稳定性分析。结果 阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分别在常温下、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃(液氮中)分别保存48 h、1周、1月、2月,抽提质粒,电泳发现阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在液氮中、-80 ℃、-20 ℃中比较稳定,而在普通的室温环境下,很快发生质粒丢失现象。结论 猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组Bb疫苗低温保存最稳定,常温最差,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。     

猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗不同保存条件下的稳定性研究北大核心CSCD

目的研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组双歧杆菌(Bb)疫苗在不同保存条件下的稳定性。方法分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4BTSOL18电转入长双歧杆菌(B.longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEXTSO45W-4B-TSOL18/B.longum,分别置于不同条件下保存,取出菌液,抽提质粒,电泳检测,进行稳定性分析。结果阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分别在常温下、4℃、-20℃、-80℃、-196℃(液氮中)分别保存48h、1周、1月、2月,抽提质粒,电泳发现阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在液氮中、-80℃、-20℃中比较稳定,而在普通的室温环境下,很快发生质粒丢失现象。结论猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组Bb疫苗低温保存最稳定,常温最差,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。     

猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗人工传代后的稳定性研究

目的研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌(Bb)疫苗人工传代后的稳定性。方法分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转入长双歧杆菌(Bifidobacteria longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/Bl、pGEX-TSOL18/Bl和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl,分别经人工传代10次后抽提质粒,进行PCR鉴定和稳定性分析。结果经PCR鉴定,从第7代开始,pGEX-TSOL18/Bl菌株出现质粒丢失的现象,随着培养时间的延长,质粒丢失现象越来越严重,第8代,第9代均出现丢失现象。而pGEX-TSO45W-4B/Bl菌株从第8代开始出现质粒丢失现象,随后的第9代,第10代也陆续出现丢失现象。pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl菌株相对稳定,但从第10代开始,开始出现了质粒丢失现象。结论重组质粒转化菌pGEX-TSO45W-4B/Bl、pGEX-TSOL18/Bl和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl人工培养时分别从人工传代培养第8代、第7代和第10代开始出现质粒丢失现象,可稳定遗传7代、6代和9代,显示具有不同程度的遗传稳定性,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。     

猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建及其表达

目的 构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,研究TSOL18基因在BCG中的表达情况。方法 通过酶切的方法 从重组质粒pGEX-TSOL18获取猪带绦虫TSOL18基因,将其定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261中,构建猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18,进行酶切、PCR和测序鉴定;再将其电穿孔转化入BCG,构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,进行PCR鉴定;SDS-PAGE和Western blot分析TSOL18基因在BCG中的表达情况。结果 通过酶切成功获得了393 bp的TSOL18基因片段;酶切、PCR和测序鉴定证明成功构建了猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18;PCR鉴定证实猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18成功转入BCG中,提示猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建成功;SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约为14.7 kD处有明显的TSOL18目的蛋白条带,Western blot证实表达的TSOL18目的蛋白能被兔抗血清和囊虫病猪血清所识别。结论 成功构建了猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,TSOL18基因能够在BCG中成功表达,表达的TSOL18重组蛋白具有特异的抗原性,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。     

猪带绦虫TSO45W-4BX与猪CD58分子在大肠埃希菌中的联合表达

目的 以猪CD58为分子佐剂，将CD58基因与猪带绦虫疫苗候选抗原基因TSO45W-4BX联合表达，寻找新型抗猪囊尾蚴疫苗。 方法 分别以重组质粒pGEM-4B和pGEM-CD58为模板，PCR扩增猪带绦虫TSO45W-4BX基因和猪CD58基因，将TSO45W-4BX与酶切处理的pGEX-4T-1定向连接，转化大肠埃希菌JM109，重组质粒经鉴定正确后，在其下游酶切插入CD58基因，PCR扩增和测序证明阅读框正确后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE））和蛋白质印迹法（Western blotting）分析表达产物的免疫活性。 结果 pGEX-4BX和pGEX-4BX/CD58分别表达Mr 41 000和Mr 69 000的融合蛋白，pGEX-4BX表达产物主要以可溶性形式存在，而pGEX-4BX/CD58却以包涵体形式存在，但两者都能被囊尾蚴病患者血清识别。 结论 TSO45W-4BX与CD58基因联合表达，TSO45W-4BX仍具有免疫活性。     

猪带绦虫TSO45W-4BX与猪CD58分子在大肠埃希菌中的联合表达

目的以猪CD58为分子佐剂,将CD58基因与猪带绦虫疫苗候选抗原基因TSO45W-4BX联合表达,寻找新型抗猪囊尾蚴疫苗。方法分别以重组质粒pGEM-4B和pGEM-CD58为模板,PCR扩增猪带绦虫TSO45W-4BX基因和猪CD58基因,将TSO45W-4BX与酶切处理的pGEX-4T-1定向连接,转化大肠埃希菌JM109,重组质粒经鉴定正确后,在其下游酶切插入CD58基因,PCR扩增和测序证明阅读框正确后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE))和蛋白质印迹法(Westernblotting)分析表达产物的免疫活性。结果pGEX-4BX和pGEX-4BX/CD58分别表达Mr41000和Mr69000的融合蛋白,pGEX-4BX表达产物主要以可溶性形式存在,而pGEX-4BX/CD58却以包涵体形式存在,但两者都能被囊尾蚴病患者血清识别。结论TSO45W-4BX与CD58基因联合表达,TSO45W-4BX仍具有免疫活性。     

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。     

猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗诱导仔猪免疫应答的动态观察

目的 研究猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗免疫仔猪后诱导免疫应答的动态变化。方法 将16头40 d龄健康仔猪均分为4组:重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗组、重组Bb-TSO45W-4B疫苗组、重组Bb-TSOL18疫苗组和双歧杆菌液体培养基(MRS)对照组。各疫苗组均以1011CFU灌胃免疫,间隔2周免疫1次,共免疫2次。在免疫后0、2、4、6、8周采集仔猪前腔静脉血,分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC)。采用ELISA法检测仔猪血清IgG、IgG1及IgG2a水平和PBMC培养上清液IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10水平;MTT比色法检测PBMC增殖水平;FCM检测CD₄⁺和CD₈⁺T细胞亚群。结果 　各疫苗组血清IgG、IgG1、IgG2a水平均在免疫后2~8周升高,均在免疫后4周、6周、4周达较高水平;PBMC增殖水平均在免疫后2~8周升高,均在免疫后6周达较高水平CD₄⁺和CD₈⁺T细胞水平均在免疫后2~8周升高,均在免疫后8周和6周达较高水平;PBMC培养上清液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平分别在免疫后2~6周、2~8周、4~6周和2~8周升高,分别在免疫后4周、6周、4周和8周达较高水平。各疫苗组上述指标与MRS对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗组与重组Bb-TSO45W-4B疫苗组和重组Bb-TSOL18疫苗组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗免疫仔猪可诱导产生特异性的免疫应答,且TSO45W-4B-TSOL18融合抗原疫苗组优于TSO45W-4B或TSOL18单一抗原疫苗组。     

猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及其表达

目的构建猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,分析猪带绦虫TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。方法采用PCR方法从重组质粒pGEX-TSOL18中扩增TSOL18基因,克隆入pMV361载体,构建pMV361-TSOL18穿梭质粒,经酶切和测序鉴定后电穿孔法转化入耻垢分枝杆菌,进行单克隆菌落筛选及PCR鉴定。构建的猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗经热诱导后,以SDS-PAGE分析及Western blot分析TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。结果成功扩增出TSOL18目的基因,大小约为393 bp,与预期值相符;经酶切验证,pMV361-TSOL18穿梭质粒构建成功;PCR鉴定猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗构建成功。SDS-PAGE电泳检测重组菌表达的目的蛋白TSOL18,相对分子质量为15×10~3与预期相符;Western blot分析该蛋白能被TSOL18兔抗血清识别。结论成功构建了猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,猪带绦虫TSOL18基因在耻垢分枝杆菌中成功表达,表达蛋白具有反应原性,其免疫原性有待进一步研究。     

Genetic variability of the 45W gene family between Chinese and Mexican Taenia solium

Taenia solium 45W proteins are good candidates for development of anti-cysticercosis vaccines. However, the genetic characteristics of the 45 gene family are still unclear between different isolates. We investigated the polymorphism of the 45 gene family between Chinese and Mexican T. solium. Alignment showed that TSO45-4B and TSO45-1C antigens were conserved absolutely, whereas other TSO45 proteins varied between these two isolates. It is informative to guide using of recombinant 45W vaccines to control porcine cysticercosis caused by Asiatic or African/Latin American T. solium.     

猪带绦虫六钩蚴TSO45W基因工程疫苗研究进展

囊虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。研制有保护性作用的疫苗将是控制和消灭该病的有效方法,猪带绦虫保护性抗原的研究是猪囊虫病免疫的基础。45W蛋白是猪带绦虫六钩蚴时期的重要抗原,但天然45W抗原来源有限,限制了其应用,而基因工程重组抗原的应用可解决质量控制和抗原来源的问题。本文就近年来国内外对猪带绦虫六钩蚴TSO45W基因工程疫苗的研究进展作一综述。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。