多聚酶链反应技术及其在临床血液学上的应用

多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外由引物(primers)介导的特定DNA序列的酶扩增,又称基因扩增.这种技术能在数小时内合成一百多万个特定DNA序列考贝,既敏感,又快速、方便.因此,虽然PCR于1985年底首见报道,但其应用日趋广泛.本文就PCR原理、基本过程及其在临床血液学上的应用作一综述.PCR原理PCR扩增的DNA片段的特异性基于两个寡核苷酸引物,这两个引物位于待扩增的DNA片段的两侧,并与相应的DNA链互补.该过程包括:DNA热变性使之成为单链状,然后退火,使引物连接于与引物互补的特定DNA链上,再在DNA多聚酶的作用     

PCR技术在HLA配型中的应用

聚合酶链式反应（PolmeraseChainReaction，PCR）是一种特异性DNA片段体外快速酶扩增技术，它采用一对与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，在DNA聚合酶作用下，经过变性、退火、延伸三个步骤约30个循环后，使少至1ng的DNA扩增至106～108倍。PCR技术目前已广泛应用于病源学检查，基因序列分析及遗传病的诊断等诸多方面。人类白细胞抗原（HLA）作为个体组织细胞的遗传标志，在抗原识别、提呈、免疫应答与调控、破坏外来抗原靶细胞等方面起重要作用，是导致移植排斥反应和移植物抗宿主反应（GVHR）的主要抗原。HLA基因位于人体第6号…     

引物二聚体在目的基因克隆中的应用初探

目的 根据引物二聚体形成原理，建立一种新的克隆目的基因的方法。方法 人工合成两条或两条以上3′端互补配对的寡核苷酸链，寡核苷酸链、Taq酶和dNTP按一定比例混合，PCR扩增延伸，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。结果 PCR产物经电泳鉴定，可见一条清晰的特异条带。结论 此方法能合成500bp以下的短片段目的基因。     

AP—PCR技术若干研究进展

业已证明，新近发展的AP—PCR方法（Arbitrari．lyPrimedPCR）在分离差异基因方面无疑是一种全新的技术，用此法可以在极短的时间内获得差异基因克隆。现就有关AP－PCR技术研究作一综述。IM—PCR概述AP—PCR技术是在对所扩增基因顺序一无所知的情况下通过主观武断地随意设计或选择一个非特异引物，在PCR反应体系中，首先在不严格条件下使引物与膜板DNA中许多序列通过错配而复性。在理论上，并不一定要求整个引物都与模板复性，而只要引物的一部分特别是3′端有3～4个以上减基与模板互补复性即可使引物延伸。如果在两条单链上相…     

荧光定量PCR检测鼻咽部脱落细胞内EBV-DNA

目的 建立荧光定量PCR（FQ－PCR）检测鼻咽部脱落细胞中EBV－DNA的方法。方法 以患者鼻咽部脱落细胞内DNA作为样本，以EB病毒基因序列中EBNA1（核抗原1）基因片段作为扩增的靶DNA，同时从人β－珠蛋白DNA片段作为内参照，合成了两对引物，并设计了两个特异的荧光探针，优化了FQ－PCR反应体系，同时对这两个片段进行扩增，每一标本得到两个Ct值；CtE和Ctβ，得到单位细胞EB病毒的相对量。结果 临床标本29例中，阳性22例，阴性7例，临床资料证实阳性者全部为鼻咽癌（NPC），阴性者全部为非鼻咽癌。结论 建立的FQ－PCR检测鼻咽部脱落细胞中EBV－DNA的方法，能反映单位细胞病毒的复制情况，可用于NPC的筛查，并可能应用于该病的风险评估和疗效观察。     

基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血基因突变

目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血。方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS2-654区域序列,分别设计突变序列扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸反应,将其PCR产物克隆到pMD19-T载体,得到β地中海贫血常见的两个突变位点的基因突变克隆:CD41-42、IVS2-654,然后以这两个突变位点为检测靶点,分别设计3′末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物,硫化磷酸修饰3′末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析。结果:当引物与模板完全配对时,引物被延伸,有PCR产物;当引物与模板不完全配对时,引物不被延伸,无PCR产物。结论:高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关能准确、快速筛查β地中海贫血CD41-42、IVS2-654突变,提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景。     

反向斑点杂交法快速检测肺炎支原体

目的:探讨早期、快速检测肺炎支原体的方法。方法:根据肺炎支原体特异的P1基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的162bp长链DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记支原体DNA,并应用于痰标本的检测。结果:所合成的162bpDNA探针具有高度特异性,只和肺炎支原体杂交,与其它细菌、真菌、病毒无交叉反应,该探针最低可检测出1ng的DNA。杂交法和培养法分别检测100份痰标本,两者的阳性率分别为12%和2%。结论:该方法快速、特异,对肺炎支原体的早期诊断具有较高的应用价值。     

HLA—Cw基因测序分型的研究

目的建立HLA-Cw位点测序分型技术,以用于无关供/受者HLA-Cw基因配型等基础应用研究。方法对HLA-Cw位点的第2和第3外显子,设计、合成一对PCR引物和4条测序引物,探索最佳的PCR反应体系和扩增条件,采用PCR引物扩增HLA-Cw基因的第2、第3外显子和第2内含子,扩增产物经纯化后作为测序模板,进行4个测序反应,产物经酒精/EDTA/NaAc法纯化,用ABIPrismTM3100测序仪电泳检测,相关的分析软件分析HLA基因型。检测分型结果的可靠性采用基因型已知的U-CLA国际HLA室间质控的DNA样本进行验证。结果检测6例UCLA国际HLA室间质控的DNA样本,HLA-Cw等位基因型与UCLA公布的结果完全一致。结论本文的HLA-Cw基因测序分型方法准确、可靠,具有广泛的应用前景。     

用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血热点突变

目的用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血基因热点突变。方法选取已知中国人群β珠蛋白基因CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26热点突变位点为检测靶点,分别设计3'末端与野生型基因位点或突变型基因位点完全配对的引物,并用硫化磷酸修饰,进行高保真DNA聚合酶介导的引物延伸反应。用多重PCR反应体系检测临床已知分别含CD26和TATAbox-28突变热点患者的DNA标本。结果对野生模板而言,仅有野生型等位基因相关引物有产物产生,而突变型等位基因位点特异性引物无产物产生。反之,使用突变模板,仅突变型等位基因位点相关引物有产物产生,而野生型等位基因位点特异性引物无产物产生。高保真DNA聚合酶介导的多重引物延伸反应筛查含有CD26或TATAbox-28突变的患者DNA标本时显示,突变引物混合物只有相应突变位点的产物产生,而野生引物混合物则有除突变位点以外的其他5个位点的产物产生。结论建立了基于高保真DNA聚合酶的筛查β地中海贫血基因热点突变的PCR技术。     

HLA-Cw基因测序分型的研究

目的 建立HLA-Cw位点测序分型技术,以用于无关供/受者HLA-Cw基因配型等基础应用研究.方法 对HLA-Cw位点的第2和第3外显子,设计、合成一对PCR引物和4条测序引物,探索最佳的PCR反应体系和扩增条件,采用PCR引物扩增HLA-Cw基因的第2、第3外显子和第2内含子,扩增产物经纯化后作为测序模板,进行4个测序反应,产物经酒精/EDTA/NaAc法纯化,用ABI PrismTM3100测序仪电泳检测,相关的分析软件分析HLA基因型.检测分型结果的可靠性采用基因型已知的U-CLA国际HLA室间质控的DNA样本进行验证.结果 检测6例UCLA国际HLA室间质控的DNA样本,HLA-Cw等位基因型与UCLA公布的结果完全一致.结论 本文的HLA-Cw基因测序分型方法准确、可靠,具有广泛的应用前景.     

乙型肝炎病毒全长基因组的扩增

目的:探讨扩增乙肝病毒全长基因组合适的PCR反应条件。方法:设计针对负链5′末端引物,PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因。改变PCR反应条件,决定最佳退火温度和最佳引物浓度,并观察不同乙肝病毒DNA模板量对PCR扩增效率的影响。结果:最佳退火温度为68℃,最佳引物浓度为0.5μmol/L,模板量在150拷贝以上能扩增出乙肝病毒全长基因,但模板量达到105拷贝抑制扩增效率。结论:退火温度为68℃、引物浓度为0.5μmol/L、乙肝病毒DNA模板量在150～105拷贝为乙肝病毒全长基因扩增的合适PCR反应条件。     

多聚酶链式反应(PCR)鉴别结核杆

作者采用两种人工合成的寡核苷酸序列作为引物,扩增出240个碱基对组成的基因DNA 序列,这一序列所表达的蛋白质(MPB 64蛋白)似为结核杆菌染色体组所特有。在耐热DNA 聚合酶(Taq 酶)作用下,经过30个扩增周期,把扩增产物加在2%琼脂凝胶上,用Southerh 杂交法进一步证实。此外还选用一组真核细胞和原核细胞并包括不同的Runyon 组分枝杆菌在内的DNA 作为模板评价其特异性。检测结果表明扩增产物只与结核杆菌染色体组起反应,     

反义寡核苷酸在肾纤维化中的应用

反义寡核苷酸是指序列与特定mRNA互补的含有15～20个核苷酸的DNA合成片断。其作为一种调控特定基因的手段，主要作用机制是通过与靶序列结合后激活RnaseH降解mRNA来达到抑制靶基因表达的目的。     

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。     

端粒酶测定在肿瘤诊断中的应用

一、端粒 (telomere)端粒是位于真核细胞染色体末端 ,由 DNA和蛋白质组成的特殊结构 ,DNA内含有大量(TTAGGG) n的重复序列。DNA复制沿 5′→ 3′方向进行 ,由 RNA引物起始聚合反应。 DNA合成结束后 RNA引物降解 ,DNA聚合酶有填补缺口的作用 ,但是与模板DNA3′端结合的引物降解后不能被填补 ,因此在DNA复制过程中染色体末端有一段遗传信息得不到复制。随着细胞不断分裂 ,DNA3′端的序列也就不断丢失 ,这就是所谓“末端复制问题”。由于 DNA复制过程中存在“末端复制问题”,在细胞分裂中 ,端粒的长度会逐渐缩短。当端粒缩短到…     

自身引物菌落聚合酶链反应筛选LoxP序列重组阳性克隆

目的 研究LoxP序列小片段重组阳性克隆的筛选和鉴定方法。方法 采用合成的LoxP为上游引物，载体互补的序列为下游引物，直接以菌落为模板进行聚合酶链反应(PCR)，电泳分离出784bp的条带者为阳性；PCR阳性克隆再用酶切法进行对比鉴定及DNA测序分析确证。结果 用菌落PCR法随机筛选的6个菌落中3个为阳性，随机取1个阳性克隆进行DNA序列分析，证实含有LoxP插入序列。用酶切法对此3个阳性克隆进行鉴定，3个克隆和未进行酶切的对照均出现100bp以下模糊带，结果不能判断。结论 自身引物菌落PCR法用于筛选和鉴定LoxP序列重组阳性克隆是一种快速、简便、经济、高效的方法。     

斑点杂交法用于检测烟曲霉菌感染的实验研究

目的:建立一种利用DNA探针快速检测烟曲霉菌的斑点杂交方法。方法:在烟曲霉特异的碱性蛋白酶基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成一段465bp的DNA探针,用地高辛标记探针并与烟曲霉、黄曲霉、念珠菌、隐球菌等真菌以及细菌DNA行斑点杂交,并将该方法应用于临床标本的检测。结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他真菌、细菌间无交叉反应,该方法的敏感性达100fg。100份临床标本曲霉培养阳性者6份,杂交阳性者13份。结论:斑点杂交法具有快速、敏感、特异的优点,对烟曲霉菌感染的快速诊断有重要意义。     

肽核酸压电基因传感器新型生物信号放大系统的研究

目的在构建好的肽核酸压电基因传感器检测系统上引入“RecA蛋白互补单链DNA探针”复合体作为新型生物信号放大系统,提高传感器的检测灵敏度。方法压电基因传感器阵列表面先固定上乙肝病毒(HBV)的bisPNA探针,加入HBV基因组DNA与之反应完全后,加入“RecA蛋白互补单链DNA探针”与bisPNA/dsDNA复合物反应。首先分别优化RecA蛋白及ATPγS的浓度,再观察最佳条件下传感器检测系统的频率下降值和反应时间。结果当RecA蛋白浓度为3mg/ml,ATPγS浓度为12.5μmol/L时,所引起的频率下降值最明显。最佳条件下所引起的频率改变为(112.2±12.7)Hz。结论在检测系统中加入“RecA蛋白互补单链DNA探针”复合体,可有效地提高压电基因传感器的检测灵敏度。     

应用DNA扩增进行血友病乙遗传咨询

对凝血因子Ⅸ基因缺陷所致的血友病乙进行遗传咨询需用DNA分析法检出基因携带者并做出产前诊断.目前已用6种限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)在80%高加索血友病乙家庭中做出基因诊断.其中应用Mnl I RFLP分析中所得DNA片段小,用此RFLP分析有一定技术困难.已证实Mnl I多态性是位于因子Ⅸ基因20422位的单碱基突变(G→A)并造成因子Ⅸ蛋白第148位氨基酸的丙氨酸变为苏氨酸(threonine)作者应用聚合酶链反应(PCR)扩增了基因组DNA多态区,直接检测其DNA片段的RFLP所用的引物为合成的寡核苷酸PCR 5F及PCR 3F2.扩     

反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌

目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法.方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263 bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测.结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他细菌间无交叉反应,该方法能检测出10 ng细菌DNA.50份痰标本肺炎链球菌培养阳性者8份,杂交阳性者12份,PCR阳性者18份.结论:反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点,对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义.