TGF-β1对脐血体外扩增中造血祖细胞生物学特性影响

为了了解TGF-β1对扩增中脐血(UCB)造血祖细胞(HPC)增殖和分化等生物学特性的影响，探讨利用其进行UCB-HPC体外扩增的可行性，在含有若干细胞因子的UCB CD133^ 细胞体外扩增体系中加入不同浓度的TGF-β1，对扩增细胞的有核细胞(NC)数、免疫表型、细胞周期、祖细胞集落及粘附分子表达等进行了动态观察。结果显示，TGF-β1各组NC总数及其扩增倍数均低于对照组，且呈明显的剂量负相关性。扩增中TGF-β1各组的CD34^ 、CD133^ 、CD34^ CD38^-细胞的比例、细胞总数及其扩增倍数均明显高于对照组。在扩增早期，TGF—β1各组的CFU—GM，CFU—mix和HPP-CFC集落的产率均高于对照组。高浓度TGF—β1组的S期细胞比例明显减少，而G1／G0期的细胞明显增加。对粘附分子表达的检测表明，TGF—β1能够上调CD49d，CD11a和CD54的表达；TGF-β1各组表达CD49d，CD11a和CD54细胞的比例明显高于对照组，而表达这些粘附分子的CD34^ 细胞的比例也明显高于对照组。结论：适当剂量的TGF-β1能够促进CD133^ 细胞的扩增，延缓和减少扩增中HPC的过度分化，提高扩增细胞中造血祖细胞的含量，同时还能上调扩增细胞的部分粘附分子的表达，从而提高扩增细胞的植入能力，对提高UCB体外扩增的质量具有重要意义。     

体外扩增的脐血单个核细胞植入NOD/SCID小鼠的研究

为了探讨在无血清、无基质培养条件下SCF、FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞(MNC)的最佳移植时机及植入潜能,将SCF,FL和TPO 3种因子组合体外扩增的脐血单个核细胞培养14天,在0、7、10和14天检测有核细胞数(TNC),CD34 细胞数,CD34 CXCR4 细胞数,CD34 CD49d 的细胞数及集落形成单位(CFU)数,并将SCF FL TPO 3种因子组合的无血清无基质条件下扩增培养7天前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠,6周后用流式细胞术,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果表明,经过14天的培养,脐血细胞得到了有效的扩增,TNC数,CD34 细胞数,CD34 CD49d 的细胞数于7天达高峰,其后开始下降,而CFU数,CD34 CXCR4 细胞数于第10天达高峰.在移植6周后,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠的存活率和人源性CD45 细胞的检出率分别为56.25%和(1.39±0.63)%,高于新鲜脐血移植组31.25%和(0.73±0.16)%,亦高于生理盐水移植组(0和0),差异有显著性(p＜0.05),扩增脐血移植组有6只NOD/SCID小鼠骨髓细胞中可检测到人特异ALU序列的表达.结论体外培养7-10天可能是收获细胞的最佳时机;SCF FL TPO 3种因子组合扩增7天的脐血单个核细胞能够植入NOD/SCID小鼠,其植入水平优于未扩增的脐血;上调脐血造血细胞上CXCR4,CD49d的表达可能会增加脐血造血细胞的植入能力.     

体外扩增对脐带血CD34~+细胞归巢相关分子影响的研究

目的体外探讨脐带血CD34+细胞经细胞因子刺激后的增殖、分化以及表面归巢相关分子的表达。方法磁珠分选出脐血CD34+细胞,无血清培养基培养14d。实验分组:A组:培养基对照组;B组:SCF+TPO+Flt3;C组:SCF+TPO+Flt3+IL-3;应用流式细胞仪检测扩增前后CD34+细胞CD33、CD41、CD71、CD62L、CD162、CLA、CD44、CD11a、CD18、CD184、CD26表达;用半固体培养基培养集落形成单位(CFU)。结果 B、C两组有核细胞、CD34+细胞和CFU都得到有效扩增,C组的有核细胞、CFU扩增倍数明显高于B组(P<0.01),但CD34+细胞扩增倍数低于B组(P<0.01);扩增后的CD34+细胞表达CD33、CD41、CD71的比例增加,其中C组的增加尤为显著;扩增后CD62L、CD162、CD44的表达减低,其中C组CD62L、CD44减低更明显;而CLA、CD11a、CD18、CD184、CD26表达均上调,C组的CLA、CD11a、CD18、CD184上调更为明显。结论脐血CD34+细胞经过细胞因子的扩增,虽然有核细胞及祖细胞的量增加了,但细胞发生分化,分化因子的作用更为明显。扩增的CD34+细胞表面部分与归巢相关的分子表达上调,有促进细胞归巢的作用。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响

背景:体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞.目的:观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响.方法:将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养:对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组.培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.结果与结论:单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达.而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差.提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力.     

人脐血CD133+细胞体外短期培养中生物学特性的变化

为了解脐血CD133+细胞的生物学特性及其在体外短期扩增培养中的变化 ,探讨其体外扩增的可行性 ,初步观察了脐血CD133+细胞的免疫表型、细胞周期、端粒酶活性以及粘附分子的表达等生物学特性及其在体外扩增中的动态变化并与CD34+细胞进行比较。结果显示 ,新鲜脐血CD133+和CD34+细胞的含量分别为 ( 1.0 5±0 73) %和 ( 1.4 0± 0 .5 6 ) % ,CD34+细胞中 79.6 2 %为CD133+CD34+细胞 ,而CD133+细胞中 97%以上为CD133+CD34+细胞。短期扩增培养结果显示 ,CD133+细胞组扩增第 10天 ,CD133+,CD133+CD34+和CD34+CD38-细胞以及第 6天的CFU mix ,HPP CFC和CD34+CD38-细胞的扩增倍数要高于CD34+细胞组 ( P <0 .0 5 ) ;扩增中 ,CD133+CD34+细胞的比例逐渐下降 ,而CD133-CD34+和CD133-CD34-细胞的比例则逐渐上升。新鲜脐血CD133+和CD34+细胞的端粒酶活性较低 ,但高于CD34-细胞。扩增 1周后 ,端粒酶活性明显上调 ,15天以后又逐渐下降 ;90 %以上脐血CD133+细胞表达CD11a ,CD4 9d和CD5 4 ,约 5 0 %表达CD6 2L。扩增早期 ,CD4 9d表达上调 ,CD11a表达无明显变化 ,而CD5 4和CD6 2L则有下调趋势 ,随着扩增时间的延长 ,各种粘附分子的表达均有不同程度的下调。在整个扩增过程中 ,大部分CD34+细胞仍然表达CD11a,CD4 9d和CD5 4     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体对人脐血单个核细胞扩增及归巢能力的影响

目的:体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,并重建受体的造血功能,而这和脐血造血干/祖细胞的细胞数和体外扩增后细胞的归巢能力密切相关.实验拟观察白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体对人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后对归巢有关的CD49d和CXCR4表达的影响.方法:实验于2005-06/2006-03在广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成.①实验材料:10份足月顺产健康新生儿脐血标本由广州市第一人民医院妇产科提供,产妇对实验知情同意,实验经医院伦理委员会批准.②实验方法:将由新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d.根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组、干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子组(简称SFT组)、干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子 白细胞介素6组(简称SFT6组)、干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子 白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体组(简称SFT6s组).SFT6s组根据可溶性白细胞介素6受体浓度又分为50,100, 500, 1 000 μg/L组.③实验评估:在0,7 d检测有核细胞数, CD34 细胞数及CD34 CXCR4 ,CD34 CD49d 的细胞数.结果:①培养7 d后,SFT、SFT6、SFT6s组有核细胞数及CD34 细胞数扩增效果优于对照组(P < 0.05), SFT、SFT6、 SFT6s3组间差异不显著(P > 0.05).②与对照组比较,SFT、SFT6、SFT6s组细胞因子组合均可提高脐血CD34 细胞上CD49d, CXCR4表达,3组间差异不显著(P > 0.05).③500,1 000 μg/L SFT6s组脐血单个核细胞扩增效果和CD49d和CXCR4表达均优于SFT, SFT6s组和100 μg/L SFT6s组(P < 0.05), 500,1 000 μg/L SFT6s组比较差异不显著(P > 0.05) .结论:在干细胞因子 FLT3配基 促聚核细胞生成因子组合的基础上,加入白细胞介素6/可溶性白细胞介素6受体后可有效地扩增脐血细胞,并促进CD49d和CXCR4表达,对可溶性白细胞介素6受体浓度有一定的依赖性.     

抗TGF-β1单克隆抗体对脐血CD34^＋细胞体外扩增作用的研究

为了探讨TGF—β1单克隆抗体对脐血CD34^＋细胞的扩增作用,本研究将分离纯化的脐血CD34＋细胞分为3组：①空白对照组：当天分选的新鲜脐血CD34＋细胞;②对照组：含SCF、FLT3-L、IL-3、IL-6四种因子组合的无血清液体培养体系中培养3天的脐血CD34＋细胞;③实验组：条件同对照组,但加入了TGF—β1单克隆抗体。3组均检测单个核细胞（MNC）计数,流式细胞术检测CD34和c—kit,计数混合集落（CFU—GEMM）、红系爆式集落（BFU—E）、粒系集落（CFU—GM）。结果显示：实验组MNC、CD34＋细胞、CD34＋c—kit＋细胞计数分别为[（2．35±0．25）×10^5、（1．16±0．29）×10^5、（1．09±0．26）×10^5],明显高于对照组[（1．25±0．13）×10^5、（0．55±0．19）×10^5、（0．51±0．2）×10^5],（P均〈0．01）。实验组CD34＋c—kit -亚群计数为（12．95±3．17）×10^3,明显高于对照组（1．71±0．83）×10^3,二者相比有显著性差异（P〈0．01）。实验组中早期集落CFU—GEMM、BFU—E的产率[（16．3±4．72）×10^3,（65．0±20．96）×10^3]明显高于对照组[（5．0±2．58）×10^3,（16．25±7．93）×10^3]（P〈0．01）,相对较晚期集落CFU—GM的产率在对照纽[（4．0±2．28）×10^3]和实验组[（6．33±2.85）×10^3]均高于空白组[（0．75±0．29）×10^3],但在对照组和实验组之间无显著性差异（P〉0．05）。此结果表明,TGF—β1单克隆抗体促进了脐血MNC和CD34＋细胞的扩增,且早期细胞CD34＋c—kit -细胞扩增更为突出;提高了早期集落CFU—GEMM和BFU—E的产量,而对相对较晚期的髓系集落CFU—GM的产量无明显影响。结论：TGF—β1单克隆抗体能协同其它生长因子有效扩增脐血CD34＋细胞,并保留一定量更早期的造血祖细胞,减轻了造血祖细胞分化的压力。     

对脐血CD34~ CD38~-细胞的研究揭示脐血移植成人的可能性

通过在生长因子依赖的长期培养体系中加入转化生长因子β1(TGF-β1)的反义核酸或抗TGF-β1抗体以阻断TGF-β1的抑制作用,比较了脐血和骨髓的CD34~ CD38~-及CD34~ CD38~ 亚群在长期培养中的增殖反应以及产生早期造血前体细胞的能力。结果显示:脐血中CD34~ CD38~-细胞占CD34~ 的比例为4％,比骨髓多4倍;和成人骨髓移植平均所需的骨髓标本相比,一份常规脐血标本含有的CD34~ CD38~-细胞所产生的CFU-GEMM和骨髓相当,CFU-GM为骨髓的2倍,BFU-E为骨髓的3倍;由脐血产生的集落明显大于由骨髓产生的集落。提示脐血更富含造血干细胞并具有较高的增殖潜能。脐血中晚期祖细胞量低于骨髓。以上研究结果提示脐血可用于成人进行造血细胞移植。     

脐血间充质干细胞支持下脐血单个核细胞扩增的研究

目的 探讨脐血源间充质干细胞联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用.方法 从脐血中分离、培养出间充质干细胞并检测其细胞表面抗原;以此间充质干细胞作为细胞滋养层.将脐血单个核细胞接种于无血清培养体系中培养18天,在第0、7、10、14及18天检测有核细胞总数、CD34+、CDl33+细胞数、集落形成单位数和(G2+M+S)期细胞含量变化.结果 ①从脐血中分离、培养出的间充质干细胞能稳定表达CD29、CD105和CD44,但不表达CD34和CD133;②外源性细胞因子及脐血源间充质下细胞均支持脐血间充质干细胞扩增,但以细胞因子联合脐血源间充质干细胞组效果最好,在第10天上述榆测指标达到峰值,分别为第0天的(6.91±1.91)、(7.75±1.24)、(6.49±1.33)、(15.62±1.29)和(28.26±6.58)倍,且维持造血至少18天.结论 ①从脐血巾能成功分离、培养出间充质下细胞,并完成细胞表型的初步鉴定;②外源性细胞因子联合脐血源间允质干细胞可有效扩增脐血单个核细胞.     

白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响

背景:体外扩增脐血造血细胞对增加脐血造血细胞数量及植入能力至关重要,合适的细胞因子组合介导的体外扩增不仅能使造血细胞数鼙增加,而且能够上调和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体4的表达.目的:实验拟观察白细胞介素3和白细胞介素6在人脐血单个核细胞体外扩增中的作用及对扩增后黏附分子和趋化因子受体4表达的影响.设计、时间及地点:随机区组开放性实验,于2007-03/12在广西壮族自治区人民医院及广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成.材料:10份足月顺产健康新生儿脐血标本.方法:将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7d,根据不同细胞因子组合实验分组为:对照组(无细胞因了组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3(C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+自细胞介素6组+白细胞介素3(D组).主要观察指标:在0,7 d检测有核细胞数,CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数.结果:与对照组相比,A,B,C,D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P<0.05),C,D两组扩增效果均优于A,B组,差异显著(P<0.05),但A,B两组之间无明显区别(P>0.05),D组能有效的扩增脐血细胞,并优于C组(P<0.05).A,B,C,D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d,CD62L和趋化因子受体4的表达, A,B两组之间差异不显著(P>0.05),但均优于C组(P<0.05),D组CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A,B,C组(P<0.05).结论:白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞,并能促进和归巢有关的CD49d,CD62L及趋化因子受体4表达.     

脐血CD34＋细胞体外扩增前后生物学特征及 HOXB4基因表达变化的研究

目的比较脐血 CD34＋细胞体外扩增前后生物学特征及 HOXB4基因表达的变化。方法分离新鲜人脐血单个核细胞（MNC）,应用免疫磁珠分选系统（MiniMACS）分选CD34＋细胞,在含细胞因子组合FL＋SCF＋TPO＋IL-3的IMDM＋10％FBS培养基中体外培养2周,分别于培养第0、7、14天计数有核细胞（ nucleated cells ,NC）数,流式细胞仪分析CD34＋细胞比例,RT-PCR检测HOXB4基因的表达变化。并取第0天与第7天的细胞于甲基纤维素半固体培养基中培养14 d,光镜下计数造血干/祖细胞集落形成数目。结果经MiniMACS分选,CD34＋细胞比例由分选前的（1.1±0.25）％升至（83.17±8.67）％,CD34＋细胞回收率为（72.90±8.75）％。体外培养第7天与第14天CD34＋细胞的比例分别降至（4.8±0.64）％与（0.6±0.27）％（P＜0.05）;NC和CD34＋细胞均有不同程度的增加,扩增7 d与14 d的NC数、CD34＋细胞数分别较第0天扩增（76.2±14.9）倍、（254.0±48.85）倍与（3.9±0.69）倍、（1.8±0.64）倍,不同时间点差异有统计学意义（ P＜0.05）。经过14 d半固体培养,扩增7 d的造血干/祖细胞集落形成数目是未扩增的3.75倍（ P＜0.05）。 RT-PCR检测HOXB4基因在第0天的CD34＋细胞中高表达,但其表达量随着体外培养时间的延长而下降（ P＜0.05）。结论细胞因子组合FL＋SCF＋TPO＋IL-3可有效扩增造血干/祖细胞,培养第7天较第14天的CD34＋细胞扩增倍数高,但CD34＋细胞表型在体外培养过程中迅速下降,与CD34＋细胞自我更新能力相关的HOXB4基因的表达水平也随体外培养时间的延长而下降。     

脐血CD34^＋细胞体外扩增脐血巨核祖细胞的研究

本研究探讨人脐血CD34^＋细胞体外扩增的巨核祖细胞的生物学特性及其免疫原性变化，为体外扩增脐血巨核祖细胞的临床应用提供实验依据。采用Ficoll-Hapaque分离法分离人脐血单个核细胞，应用免疫磁珠法（MACS）再分离富集CD34^＋细胞，在含血小板生成素（TPO，50ng／ml）、白介素-1]（IL—11，50ng／ml）和肝素（25U／ml）的无血清液体培养体系中培养14天。用流式细胞术检测扩增产物免疫表型（CD34^＋、CD41a^＋、CD61^＋、CD34^＋CD41a^＋及CD34^＋CD61^＋）、巨核细胞凋亡率及其表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达，并进行巨核细胞集落形成单位（CFU—Mk）的检测。结果显示：脐血CD34^＋细胞能够有效地向巨核细胞分化，CD41a^＋和CD61^＋细胞比例在培养第14天达到峰值，CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例在扩增第7天达到最高峰[分别为（3．41±2．80）％和（1．89±1．43）％]；CFU—Mk大集落在扩增第7天达到高峰（（20．66±32．79）倍]，小集落在扩增第10天达到高峰[（435．62±482．65）倍]；在培养7、10和14天时巨核细胞的凋亡率分别为（19．48±9．64）％、（26．87±9．03）％和（52．46±11．74）％，其中培养7天和10天的凋亡率无显著性差异（P〉0．05），培养14天的凋亡率显著高于7天和10天（P均〈0．05）；巨核细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达随着扩增天数的延长逐渐降低，其中培养0到10天阶段下降明显．结论：采用TPO＋IL 11＋肝素组合．可以有效地扩增脐血巨核祖细胞；培养7天，CFU—Mk大集落扩增倍数、CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例均达高峰，这是巨核祖细胞体外扩增的较佳培养时间。     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景:细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题.目的:实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响.方法:将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠.在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果与结论:移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组(P<0.05).扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达.结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能.     

间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增和黏附分子表达的影响

目的研究间充质干细胞(MSC)对脐血CD34+细胞体外扩增能力和黏附分子表达的影响.方法从正常人骨髓中分离扩增MSC,通过免疫表型和向成骨细胞及脂肪细胞分化能力对其鉴定;将脐血CD34+细胞接种到MSC或其他培养液中,比较不同培养条件对造血细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响.结果MSC表达Thy-1、SH2、SB10、CD44、CD13、CD49e和CD29,不表达CD34、CD45、HLA-DR、CD14和CD31,经过诱导可以向成骨细胞和脂肪细胞分化;实验组在MSC和细胞因子作用下,扩增8 d后有核细胞、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD62L+细胞和CFU-Cs分别扩增145.57±17.89,37.47±13.78,69.78±50.07,10.74±5.89和20.73±5.54倍,均显著高于对照组;扩增后CD34+细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无明显变化,虽然ICAM-1和L-选择素表达下降,但实验组CD34+CD62L+和CD34+CD54+细胞的绝对数显著增加.结论MSC可为造血干细胞体外扩增提供适宜的微环境,有助于抑制HSC分化并保持其造血重建潜能和归巢能力.     

胎儿骨髓基质细胞与细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的研究

为了探讨胎儿骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)体外扩增作用的影响及比较扩增前后脐血(CB)CD34 细胞上细胞表面趋化因子受体CXCR4和黏附分子CD49d (VLA4)的表达情况,将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立的无血清培养体系,该体系分4组:A组为培养过程中不加细胞因子和基质细胞;B组为单用胚胎骨髓基质细胞支持;C组为单用细胞因子支持;D组为细胞因子和胚胎骨髓基质细胞联合支持。在0、6、10及14天检测细胞总数、CD34 细胞数及集落形成单位(CFU)数,同时检测CD34 细胞上CD49d 及CXCR4的表达数。结果表明:在体外14天培养过程中,各时间点D组CD34 细胞、CFU数及CD34 CXCR4 细胞和CD34 CD49d 细胞扩增数均高于A、B、C组(P<0.05);B、C和D组在各时间点各测量指标与A组比较具显著性差异(P<0.05);6天后,B组各测量指标与C组比较具显著性差异(P<0.05)。结论:胚胎骨髓基质细胞联合外源性细胞因子不仅可以支持脐血MNC的有效扩增,而且扩增后与趋化作用和与粘附作用相关的造血细胞亦较扩增前明显增加。单用细胞因子扩增会造成造血细胞的耗竭,单用基质细胞支持可扩增或维持造血细胞的量,但难以实现造血细胞的大量扩增,FBMSC联合外源性细胞因子可能是扩增造血干祖细胞的较理想方案。     

磁力搅拌悬浮培养大规模扩增脐血造血祖细胞

为了利用磁力搅拌悬浮培养装置大规模体外扩增脐血造血祖细胞，从脐血分离单个核细胞，以无血清培养基stemspan添加干细胞因子、FLT-3配基及血小板生成素为培养体系进行培养。先研究磁场（25和50mT）对静态扩增培养的造血祖细胞生长和集落形成能力的影响，再研究磁力搅拌悬浮大规模培养对造血细胞总数扩增、造血集落形成和表面分子标志表达变化。结果表明，在0，25和50mT磁场组和磁转子组，细胞总数扩增倍数和造血集落形成数在各组间均无明显区别（P〉0．05）。经过7天的扩增培养，磁力搅拌悬浮大规模培养细胞总数扩增倍数为2．8±0．45，高于静态培养细胞总数扩增倍数（2．1±0．48）（P〈0．01）；磁力搅拌悬浮培养组形成的红系集落数（1983．5±582．6）、粒-巨噬细胞集落数（186．4±62．7）明显高于静态培养形成的相应的造血集落数（分别为1396．2±425．7和136．5±40．8）（P均〈0．05）：磁力搅拌悬浮扩增后造血干细胞（CD34^＋、CD34^＋／CD38^-或CD133^＋）比例分别为（0.9±0．34）％、（0．7±0．21）％和（1．1±0．35）％，低于静态培养的干细胞比例[分别为（1．4±0．35）％、（1．2±0．34）％和（1．6±0．68％）]（P均〈0．05）；但是，归巢相关分子CD184和CD62L高于静态扩增培养．．结论：磁力搅拌悬浮装置可能有利于脐血造血祖细胞规模扩增，本研究结果还有待于动物实验及临床移植试验进一步验证.     

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控的实验研究

目的探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。方法构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34 细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34 细胞。转导后的CD34 细胞在SCF、FL、TPO、IL-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。定期检测CD34 细胞基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养和裸鼠致瘤试验。结果分选的CD34 细胞纯度为91%以上,基因转移率为49．3%±6．2%;实验组AP20187 SCF FL TPO IL-6(ASFTI)与对照组SCF FL TPO IL-6(SFTI)组均可获得CD34 细胞大量扩增。随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34 细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组GFP阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。在培养6周左右,实验组CD34 CD38-、CD34 CD38 细胞亚群扩增倍数分别为(228．26±32．31)、(321．48±40．52),分别与对照组相比,差异有显著性。ASFTI组转基因CD34 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix)。扩增后CD34 细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性。结论转染JAK2基因的人脐血CD34 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。     

Flt3和c-kit在脐血CD34+干/祖细胞中功能性表达及意义

为了解作用于早期造血的细胞因子受体Flt3和c-kit在脐血CD34~+造血干/祖细胞中的表达及功能,从蛋白和基因水平对其进行了研究。采用常规双色直接免疫荧光标记法,使用流式细胞术测定新鲜分离的和体外不同培养时间的脐血CD34~+造血干/祖细胞中Flt3和c-kit蛋白水平的表达,用RT-PCR法测定Flt3和c-kit的mRNA水平表达,并在体外对受体功能进行了探讨。研究结果显示,新鲜脐血CD34~+细胞中(68.8±15.4)％为Flt3~+,(50.6±12.7)％为c-kit~+,随着体外培养时间的延长,二者表达逐渐下降。结论:脐血CD34~+造血干/祖细胞在体外液体培养条件下Flt3和c-kit阳性表达可维持2-3周,其配体FL和SCF在培养的第1周内对细胞扩增效果最显著。     

血小板第4因子对脐血CD34+细胞黏附功能的影响

目的研究血小板第4因子(PF4)对新鲜脐血CD34+细胞及扩增后脐血CD34+细胞黏附功能的影响;PF4对脐血CD34+细胞上的黏附分子CD49d及基质细胞趋化因子(SDF-1)受体CXCR4的作用.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34+细胞,结晶紫染色测定细胞总黏附性,免疫荧光标记流式细胞仪测定CD49d及CXCR4的表达.结果①PF4 可使新鲜脐血CD34+细胞总黏附性提高,且与剂量相关.②SDF-1 100 ng/ml可使脐血CD34+细胞总黏附性提高.③脐血CD34+细胞扩增10 d后未加PF4刺激的自发以及经SDF-1诱导的黏附功能开始下降,在扩增脐血CD34+细胞不同时间段加入100ng/ml PF4,脐血CD34+细胞对基质层的黏附能力始终保持较高水平,以0天时脐血CD34+细胞黏附性为100%,扩增14 d时脐血CD34+细胞黏附性PF4组为(262.04±64.81)%,同期对照组为(64.35±8.29)%,经SDF-1诱导下扩增14 d的CD34+细胞的总黏附性PF4组为(138.31±32.39)%,同期对照组为(67.66±12.44)%.④PF4 100 ng/ml作用于CD34+细胞时,CD49d表达增长13.02%,CXCR4表达增长17.33%.结论 PF4可使新鲜及扩增后的脐血CD34+细胞黏附功能增强,并促进CD49d及CXCR4的表达,提示PF4可能有助于脐血干细胞的归巢.