人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定

目的构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体。方法针对ERRαmRNA设计了4条si RNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定。用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelp-er1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果。结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml。转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低。结论成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础。     

黄瓜花叶病毒2b蛋白在大肠杆菌中的表达及抗血清制备

从黄瓜花叶病毒（CMV）中提取总RNA，通过反转录-PCR（RTPCR）扩增得到其运动蛋白2b基因，将扩增产物克隆到pMD-18T载体上。DNA序列分析表明，所得到2b基因全长为303bp与已发表CMV序列相同。将目的片段亚克隆到表达载体pET30a上，并在大肠杆菌JM109诱导表达，诱导9h后。融合蛋白表达量最大。经SDS-PAGE检测，融合蛋白以可溶形式存在。制备的抗血清，效价为1：4000。     

大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。     

siRNA干扰对SKBr3细胞株HER2表达的影响

目的 探讨siRNA干扰对人乳腺癌细胞株SKBr3表皮生长因子受体2(HER2)表达的影响.方法 构建2个针对HER2基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体(psiRNA-HER2),并转染人乳腺癌细胞株SKBr3,采用RT-PCR法和流式细胞仪检测转染后48h HER2 mRNA和蛋白表达,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点.同时构建针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的短发夹状siRNA的真核表达载体psiRNA-GFP作为阳性对照.结果 psiRNA-HER2-1、psiRNA-HER2-2转染后均能抑制人乳腺癌细胞株SKBr3 HER2 mRNA和蛋白表达,抑制率分别为32.0%和65.5%.荧光显微镜下见psiRNA-GFP转染后明显抑制GFP的表达.结论 HER2 siRNA真核表达载体可在人乳腺癌细胞株SKBr3中产生RNA干扰效应,不同的siRNA下调mRNA和蛋白表达的效率不同.作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗乳腺癌的一种新方法.     

慢病毒介导的siRNA沉默结肠癌HCT116细胞中Slug基因表达的影响

目的探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体在结肠癌HCT116细胞中的沉默效应。方法构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及Slug siRNA三组,应用qRT-PRC和Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果。结果转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05)。结论 Slug siRNA能明显沉默靶基因Slug的表达,并且可能成为潜在治疗肿瘤的新靶点。     

表达生存素相关microRNA-494基因腺病毒载体的构建

目的构建表达生存素(survivin)相关microRNA-494基因的重组腺病毒载体。方法应用生物学软件Targetscan 5.2对microRNA-494基因与survivin mRNA作相关性分析。RT-PCR调取目的基因,将其连接线性化后的穿梭质粒载体,联合骨架质粒转染入293细胞后同源重组产生重组腺病毒载体。PCR及测序验证重组质粒,荧光显微镜下观察腺病毒荧光蛋白表达。结果重组腺病毒载体构建成功。结论成功构建了重组腺病毒载体,可用于研究其在前列腺癌PC-3细胞中对survivin基因表达的影响。     

The construction of recombinat adenovirus vector expressing survivin-related microRNA-494 gene

目的 构建表达生存索(survivin)相关rnicroRNA-494基因的重组腺病毒载体.方法 应用生物学软件Targetscan 5.2对microRNA-494基因与survivin mRNA作相关性分析.RT-PCR调取目的基因,将其连接线性化后的穿梭质粒载体,联合骨架质粒转染入293细胞后同源重组产生重组腺病毒载体.PCR及测序验证重组质粒,荧光显微镜下观察腺病毒荧光蛋白表达.结果 重组腺病毒载体构建成功.结论 成功构建了重组腺病毒载体,可用于研究其在前列腺癌PC-3细胞中对survivin基因表达的影响.     

小干涉RNA导入哺乳动物体内的方法与策略研究进展

小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)是目前研究的比较活跃的一种小RNA。利用siRNA使基因沉寂从而调节目的蛋白的功能,在疾病的基因治疗中有巨大的应用潜力。该文从siRNA在哺乳动物整体水平研究的角度,对近年来siRNA的载体策略以及siRNA导入体内的方法和途径等方面的研究进展作一综述,并讨论了siRNA在体内应用的优势和可能存在的问题。     

重组腺相关病毒载体的免疫性研究及其解决策略

重组腺相关病毒载体（rAAV）作为一种高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗的临床前和临床研究中具有极广泛的应用前景。目前在全球范围内已有71项临床研究在进行之中或已经完成。其中有相当部分在血友病、视网膜疾病、帕金森、囊性纤维化以及癌症等疾病的治疗中都取得了显著疗效。随着临床上的成功,人们对rAAV所引起的免疫性及其应对策略也进行了更为广泛而深入的研究。本文将就rAAV的外壳蛋白以及目的基因产物所引起的免疫性进行综合探讨,并结合我们的部分研究工作从改变外壳蛋白、给药方式以及消除内源性外壳蛋白的表达等方面对消除外壳蛋白所引起的免疫性的一些策略加以详述。     

N末端Strep蛋白标签表达载体的构建和应用

目的构建携带N末端Strep(NS)蛋白标签的表达载体;在表达载体中构建衣原体RNA聚合酶亚基重组蛋白并表达。方法采用PCR的方法,通过引物引入NS蛋白标签和新的多克隆位点替代p ET21c-DH质粒中原有的T7蛋白标签和多克隆位点,选择新引入的Not I酶切位点进行PCR产物的环化自连,转化DH-5α细菌后筛选阳性菌株,PCR法和基因测序法鉴定新构建的表达载体;在新构建表达载体的Bam H I和Sal I位点之间分别插入衣原体RNA聚合酶核心酶的α、β、β'亚基,获得表达NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表达载体,转化表达菌株Arctic Express,筛选阳性表达菌株,并用考马斯亮蓝染色、Western blot等法鉴定融合蛋白的表达情况。结果成功构建了携带NS蛋白标签的p ET21c-NSMCS载体,并成功将其应用于衣原体RNA聚合酶核心酶亚基融合蛋白的构建及表达。结论获得稳定表达NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表达载体,为研究衣原体基因转录调控奠定了良好的基础。     

含IL-24基因重组慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨白细胞介素(IL)24基因表达目的蛋白IL-24的方法,检测IL-24对肝癌细胞生长的影响.方法 自经5μg/ml植物血凝素(PHA)刺激的正常人单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,RT-PCR扩增出IL-24 cDNA,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒转移载体pHAGE-IL-24,转染HEK 293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达;梯度稀释法测定病毒滴度,感染HEK 293T细胞48 h后进行RT-PCR和Western blot检测IL-24的基因和蛋白表达;MTT法检测细胞的增殖.结果 限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带IL-24基因的慢病毒表达载体,滴度为5×106TU/ml.以MOI为5.0的重组慢病毒感染靶细胞HepG2 48 h后,能够检测到外源基因IL-24的蛋白表达.IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.结论 成功构建了含IL-24基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染HepG2细胞,并在其中大量表达目的蛋白;IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.     

Im人成熟型TGF-β1重组表达载体的构建

目的构建人类成熟型TGF-β1（hTGF-β1）基因的表达载体,探索TGF-β1在大肠埃希菌中的表达,获得重组表达载体pET32a-hTGFβ1。方法Trizol法抽提人新鲜胎盘组织的总RNA,RT-PCR法扩增人成熟型TGF-β1基因,PCR产物纯化后经BglⅡ和HindⅢ双酶切后与相同酶切的pET32a（＋）载体连接,构建重组载体pET32a-hTGF-β1。结果成功构建了hTGF-β1重组表达载体pET32a-hTGFβ。结论hTGF-β1基因的原核表达载体的成功构建,为下一步表达、纯化该基因的蛋白产物以及hTGF-β1多克隆抗体的制备提供了依据。     

大鼠PPARγ shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)基因RNA干扰慢病毒载体并鉴定。方法设计针对PPARγ的小发夹RNA(shRNA)序列,应用基因重组技术插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒载体中,XbaⅠ和XhoⅠ双酶切和DNA测序鉴定重组克隆。将pLL3.7空载体(NC组)、pLL-PPAR-γsh1RNA(S1组)、pLL-PPAR-γsh2RNA(S2组)三组质粒分别与辅助包装质粒共转染人胚肾293T细胞,并测定病毒滴度;病毒感染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞和大鼠海马神经干细胞后,分别用RT-PCR和Western blot检测PPARγmRNA和蛋白表达。结果 PPARγshRNA成功插入慢病毒载体。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为5×106IU/ml。与NC组相比,S1、S2组PPARγmRNA水平下降(P<0.05),且S1组PPARγ蛋白表达亦明显下降(P<0.05)。结论成功构建PPARγ基因RNA干扰慢病毒载体。     

黑色素为基础的新型纳米基因载体的制备及毒性初步评估

目的探讨黑色素纳米颗粒(MNP)经聚赖氨酸(PLL)改性连接小干扰RNA(si RNA)后的细胞毒性,为其在基因治疗中的应用提供依据。方法制备新型水溶性MNP并经PLL螯合改性,依靠静电作用连接si RNA,分别与4T1乳腺癌细胞和Hep2喉癌细胞进行孵育,采用CCK8检测法观察细胞生长状况,并对材料的细胞毒性进行分级。结果 4T1乳腺癌细胞和Hep2喉癌细胞在1 000μg/ml及其以下的实验分组中均生长良好,形态饱满。CCK8检测法数据表明细胞生存率均大于80%,毒性分级达合格。结论 MNP经PLL改性连接si RNA所形成的复合物是一种生物安全性高,毒性小的新型纳米基因载体。     

Livin shRNA慢病毒载体的成功构建及鉴定

目的构建携带livin基因短片段发卡RNA（livin shRNA）的慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的干扰人livin基因的有效靶序列,设计、合成靶序列的寡聚脱氧核苷酸DNA序列（OligoDNA）,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的携带U6启动子和绿色荧光蛋白的pGCL—GFP载体连接产生短片段发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果PCR鉴定与DNA测序证实合成的含livin shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论成功构建人livin shRNA慢病毒载体。     

应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因

目的：乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白是由HBV—S基因编码的具有多种功能的蛋白质。前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响。为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因，本实验应用基因芯片技术对于pcDNA3．1(-)和pcDNA3．1(-)-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析。方法：以含有HBV全基因组的质粒G．376—7(GenBank号：AF384371)作为模板，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增前-S2蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS2。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总mRNA，逆转录为cDNA．，与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果：构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误，提取高质量的总mR—NA并进行逆转录成为cDNA，进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中，发现有42个基因表达水平显著上调，36个基因表达水平显著下调。结论：HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子，前-S2基因的表达对肝细胞基因表达谱有显著影响。     

DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂（DSB）修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞（HLF）总RNA，逆转录酶-多聚酶链式反应（RT-PCR）扩增hKu70基因cDNA保守序列，经与pGEM-T载体连接，筛选，克隆，抽提质粒和双酶切后，将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中，筛选，克隆，抽提质粒，从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K。结果 经RT-PCR获得467bp含限制性内切酶位点的DNA片段，T载体克隆后经双酶切，测序，确定该片段为hKu70基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，并双酶切，测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为建立该基因低表达细胞株，DNA双链断裂修复缺陷和有关毒理学研究提供工具。     

HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装

目的 构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3'UTR RNA 与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础.方法 根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达.结果 经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体.通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光.嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达.结论 成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株.     

靶向Ccnd1基因的siRNA对大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的探讨靶向Ccnd1基因小干扰RNA(si RNA)对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LECs)Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达及细胞增殖的抑制作用。方法合成3条靶向大鼠Ccnd1基因的siRNA(si-Ccnd1-1,si-Ccnd1-2,si-Ccnd1-3),LipofectamineTM2000转染体外培养的大鼠LECs,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达变化,筛选最有效si RNA序列。MTT法连续测定转染最有效si RNA序列后24、48、72、96和120 h细胞增殖情况。结果与对照组相比,3条si RNA均能不同程度地抑制Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1的表达,以si-Ccnd1-3最为有效(P<0.05)。与对照组比较,si-Ccnd1-3转染后24 h开始明显发挥对细胞增殖的抑制作用,并持续至120 h以后(P<0.05)。结论靶向Ccnd1的si RNA能有效降低大鼠LECsCcnd1 mRNA和周期蛋白D1蛋白表达,抑制LECs增殖。     

反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒

目的构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体。方法在正义和反义引物两端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体。脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响。结果成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右。结论采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法。