乙型肝炎病毒基因免疫影响因素及对策

近年，国内外广泛开展了乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因免疫（又称ＤＮＡ免疫或核酸免疫）的实验研究，本文就最近几年此方面的一些进展，尤其是抗原基因的选择，质粒载体的构成元件，实验动物的差异等对ＨＢＶＤＮＡ疫苗的影响作了较为详细的介绍，最后对可增强其免疫效果的一些措施进行了初步的探讨，相信不久的将来，此方面的研究奖获更大的进步。     

不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检测及其临床意义

目的探讨乙型肝炎病毒ＤＮＡ含量的临床意义。了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫标志不同状态的慢性肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度及其临床意义。方法应用建立的竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法定量检测慢性肝炎（ＣＨ）５１例、肝硬化（ＬＣ）３６例、原发性肝癌（ＰＨＣ）３８例的血清ＨＢＶＤＮＡ浓度。结果ＨＢＶＤＮＡ阳性的ＣＨ患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度为４．３６ｌｏｇ１０ＨＢＶＤＮＡ拷贝５０μｌ（下同），ＬＣ为４．５５，ＰＨＣ为４．４３，三组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；血清ＨＢＶ五项免疫标志均阴性或抗－ＨＢｓ阳性的慢性肝病患者中，有３７．５％患者存在低水平ＨＢＶ复制；ＨＢｅＡｇ阳性患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度总体上明显高于抗－ＨＢｅ阳性组，但其中部分患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度也很高。结论提示ＨＢＶ的复制状态与慢性肝病的病期无明显关系；在抗－ＨＢｅ阳性的患者中存在个体差异，故不能仅依据抗－ＨＢｅ阳转来判断ＨＢＶ复制减少或停止。     

不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检？…

目的 探讨乙型肝炎病毒ＤＮＡ含量的临床意义。了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫标志不同状态的慢性肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度及共临床意义。方法 应用建立的竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法定量检测慢性肝炎（ＣＨ）５１例、肝硬化（ＬＣ）３６例、原发性肝癌（ＰＨＣ）３８例的血清ＨＢＶ ＤＮＡ浓度。结果 ＨＢＶＤＮＡ阳性的ＣＨ患者血清ＨＢＶ ＤＮＡ浓度为４．３６ｌｏｇ１０ＨＢＶＤＮＡ拷贝／５０μｌ，ＬＣ为４．     

肝细胞刺激物质对感染鸭乙型肝炎病毒的争论鸭体…

以感染鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）的北京雏鸭为体内实验动物模型，观察了肝细胞刺激物质（ＨＳＳ）对鸭乙型肝炎病毒的抗病毒作用，１日龄北京鸭实验感染ＤＨＢＶ，７天后血清ＤＨＢＶＤＮＡ阳性，给予药物治疗１０天，用斑点杂交方法检测用药前后血清ＤＨＢＶＤＮＡ，分析药物对血清ＤＨＢＶＤＮＡ有抑制作用，大剂量量组出现ＤＨＢＶＤＮＡ抑制作用时间早小剂量组，用药５天，１０天及停药３天血清ＤＨＢＶＤＮＡ中位抑制率显著高     

乙型肝炎病毒(HBV)相关性肾炎患者肾活检组织中HBV DNA分布的分子生物学检测

为探讨乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）相关性肾炎的发病机理，应用地高辛素标记ＨＢＶＤＮＡ探针原位分子杂交（ＩＳＨ）和直接原位聚合酶链反应（ＩＳ－ＰＣＲ）技术，对２０例临床诊断为ＨＢＶ相关性肾炎患者肾活检石蜡包埋组织切片检查。在ＩＳＨ中采用ＨＢＶＤＮＡ两种探针：用全长段探针，８５％（１７／２０）ＨＢＶＤＮＡ阳性，这１７例阳性肾组织切片再用ＨＢＶＤＮＡＳ加Ｃ段探针检测，１４例阳性（８２．３５％）。在ＩＳ－ＰＣＲ中本组病例８５％（１７／２０）亦阳性。发现ＨＢＶＤＮＡ阳性颗粒弥漫沉积于肾小球毛细血管袢、系膜区、肾小管，表现形式以浆核型、核型为主。同组病例肾组织免疫组化染色法（ＬＳＡＢ）显示，ＨＢｓＡｇ与ＨＢＶＤＮＡ的存在部位基本一致。提示ＨＢＶ引起的肾脏病变不仅是免疫介导的损害，亦可能有病毒侵犯参加免疫反应。     

肝细胞刺激物质对感染鸭乙型肝炎病毒的雏鸭体内抗病毒作用的实验研究

以感染鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）的北京雏鸭为体内实验动物模型，观察了肝细胞刺激物质（ＨＳＳ）对鸭乙型肝炎病毒的抗病毒作用。１日龄北京鸭实验感染ＤＨＢＶ，７天后血清ＤＨＢＶＤＮＡ阳性，给予药物治疗１０天，用斑点杂交方法检测用药前后血清ＤＨＢＶＤＮＡ，分析药物对血清ＤＨＢＶＤＮＡ是否有抑制作用，结果显示：ＨＳＳ大、小两个剂量组（分别为５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ和２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）均对ＤＨＢＶＤＮＡ有抑制作用，大剂量组出现ＤＨＢＶＤＮＡ抑制作用时间早于小剂量组，用药５天、１０天及停药３天血清ＤＨＢＶＤＮＡ中位抑制率显著高于生理盐水对照组（Ｐ＜０．０５）；两个剂量组均无停药反跳；生理盐水组用药前后ＤＨＢＶＤＮＡ的Ａ值比较差异无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。停药后３天肝组织病理光镜及电镜均显示ＨＳＳ组病变较生理盐水组轻。结论：肝细胞刺激物质有一定的保肝和抑制ＤＨＢＶＤＮＡ复制的作用     

原位杂交法检测肝组织中丁型和乙型肝炎病毒核酸

利用国外引进的重组质粒获得纯化基因片段，分别以随机引物法和ＰＣＲ法制备地高辛素标记的ＨＢＶＤＮＡ探针和ＨＤＶｃＤＮＡ探针。用原位杂交法检测了石蜡包埋的肝组织切片ＢＶＤＮＡ和ＨＤＶＲＮＡ。４９例感染肝组织分为两组：丁肝组２３例；单纯乙肝组２６例，ＨＢＶＤＮＡ的检出率丁肝组（７８．２６％）与乙肝组（７６．９２％）无统计学差异；而ＨＤＶＮＡ的检出率丁肝组（６０．８７％）明显高于乙肝组（１５．３８％）。ＨＢＶＤＮＡ可见于受染肝细胞的胞核或胞浆内，而ＨＤＶＲＮＡ绝大部分见于肝细胞胞核。两种病毒核酸阳性细胞在肝组织中的分布特点大致相同：弥漫或散在地分布于肝小叶或假小叶内，或局灶性分布于小叶周边。ＨＤＶＲＮＡ阳性的肝组织都或多或少地同时存在ＨＢＶＤＮＡ。同一例肝组织中，ＨＢＶＤＮＡ阳性细胞从数量和颗粒密度上似略高于ＨＤＶＲＮＡ。将乙肝组和丁肝组两组病人肝内ＨＢ－ｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ及血清ＨＢｅＡｇ作了比较，各指标阳性率虽有差异，但均无统计学意义。因此，未发现ＨＤＶ感染对ＨＢＶ的复制有明显抑制作用。此结果对以往用血清学或免疫组化方法对ＨＤＶ的研究有所补充和深入，亦可为研究其它类型病毒性肝炎之间的重叠感染所借鉴。     

丙肝病毒(HCV)基因免疫实验研究

目的：探讨ＨＣＶ核心区基因疫苗在Ｂａｌｂ／ｃ小鼠的免疫应答。方法：将与ＨＣＶ核心区基因互补的ｃＤＮＡ定向克隆于真核表达载体ｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ－ＨＣＶ）,免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,观测小因清抗－ＨＣＶ抗体及小鼠脾细胞对ＨＣＶ核心抗原的特异性增殖反应。结果：５只经皮下注射的免疫鼠中有４只出现抗－ＨＣＶ抗体,经肌肉注射的免疫鼠全部出现抗体阳转,而对照组全阴性,肌肉注射的免疫组抗体水平高于皮下注射的免疫     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

新生儿乙型肝炎疫苗免疫失败同孕妇血清乙型肝炎病毒DNA含量的关系

以ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ阳性孕妇作为研究对象，用病例。对照研究方法，比较婴儿乙型肝炎疫苗免疫失败和婴儿疫苗免疫成功两组孕妇分娩时血清乙型肝炎病毒ＨＢＶ－ＤＮＡ含量，进一步用定群方法研究母亲ＨＢＶ－ＤＮＡ含量与其婴儿免疫后ＨＢｓＡｇ持续携带率的关系，证实孕妇血清ＨＢＶ－ＤＮＡ高含量是婴儿免疫失败的主要原因。根据孕妇血清ＨＢＶＤＮＡ含量可预测婴儿常规疫苗免疫失败的危险度。为改进乙型肝炎免疫减少免疫失败比例提供指针。     

用聚合酶链反应检测人肝细胞癌乙型肝炎病毒DNA和丙型肝炎病毒RNA

为研究乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）和丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＤＮＡ）与肝细胞癌的关系，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和巢式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）分别检测４２例肝肿瘤组织中ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ。结果：１例胆管细胞癌组织ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ均阳性，１例胆管囊腺瘤ＨＢＶＤＮＡ阳性。４０例肝细胞癌组织中，单纯ＨＢＶＤＮＡ阳性１９例，单纯ＨＣＶＲＮＡ阳性３例，二者均阳性１０例。ＨＢＶＤＮＡ阳性率７２．５％，ＨＣＶＲＮＡ阳性率３２．５％。ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ感染与肝癌组织学分型无关；且肝细胞癌中ＨＣＶ感染与ＨＢＶ未见相关。结果提示，我国ＨＢＶ感染仍是引起肝细胞癌的主要原因。但由于肝细胞癌患者中ＨＣＶ的感染率也较高，且有上升趋势，因此ＨＣＶ可能也是肝细胞癌发生的重要原因之一。     

HBV感染与IgA肾病肾小管间质病变的关系

目的探讨ＩｇＡ肾病ＨＢＶ感染与肾小管间质病变的关系。方法利用原位分子杂交（ＨＢＶＤＮＡ）、免疫组化（ＨＢＡｇ、ＣＤ３、ＣＤ８）以及ＨＢＶＤＮＡＨＢＡｇ和ＨＢＡｇＣＤ４３双标记技术，对９１例ＩｇＡ肾病肾穿刺标本进行研究。结果肾组织内ＨＢＡｇ阳性率为６９．２％。ＨＢＶＤＮＡ原位杂交阳性率为４２９％。ＨＢＶＤＮＡ阳性的病例，双重标记染色发现ＨＢＶＤＮＡ阳性的肾小管上皮细胞可表达ＨＢｃＡｇ或／和ＨＢｓＡｇ。ＨＢＶ感染标记（ＨＢＶＤＮＡ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ）阳性组ＣＤ３阳性细胞和ＣＤ８阳性细胞数明显高于阴性组（Ｐ＜００１），并可见数量不等的Ｔ淋巴细胞入侵ＨＢｃＡｇ及ＨＢｓＡｇ阳性肾小管管壁或围绕其周围。结论感染ＨＢＶ的肾组织细胞能够表达ＨＢＡｇ，并诱导ＣＤ３阳性细胞和ＣＤ８阳性细胞浸润，从而加重肾小管、间质损害。ＨＢＶ感染对ＩｇＡ肾病的发生发展可能起着重要作用     

反义寡脱氧核苷酸在鸭体内抑制鸭乙型肝炎病毒复制与 …

目的 研究反义核酸的抗病毒作用。方法 设计合成了针对鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）前Ｓ（ＰｒｅＳ）基因区第９５１－９６８位核苷酸的硫代反义寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＯＤＮ），以２０μｇ／ｇ体重／日剂量对３只腹腔感染ＤＨＢＶ５．２毒株后，血清ＤＨＢｓＡｇ及ＤＨＢＶ ＤＮＡ阳性鸭连续静脉注射１０天，同时以等体积生理盐水注射另３只感染鸭作为对照。结果 对照鸭注射生理盐水后，血清ＤＨＢｓＡｇ及ＤＨＢＶ ＤＮＡ阳性未     

套叠式（Nested）PCR检测乳汁中HBV－DNA

本文应用Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ技术，检测了５２例血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性（ＰＣＲ检测）产妇和１５例血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性（ＰＣＲ检测）产妇乳汁中的ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果表明：５２例阳性产妇乳汁中ＨＢＶ－ＤＮＡ经第一次扩增后，１２例ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性。经第二次扩增后，４０例阳性（阳性率７６．９％）；１５例阴性产妇乳汁中ＨＢＶ－ＤＮＡ经两次扩增后均为阴性。作者认为，Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ技术是检测血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性产妇乳汁是否排泌ＨＢＶ的简便、灵敏、特异的方法。乳汁中含有ＨＢＶ应停止哺乳。     

聚合酶链反应检测乙型肝炎患者肾组织中的HBV DNA

应用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对１１例乙型肝炎患者石蜡包埋的肾、肝组织中的ＨＢＶＤＮＡ进行了检测，并与其免疫组化及原位杂交结果作了比较。二组引物检测的结果表明：在肝组织中均有ＨＢＶ的感染，其中５例存有ＨＢＶ的复制；倚组织中ＨＢＶＤＮＡ的检出率为８／１１（７２．７％），未检测出有ＨＢＶ的复制，包括２例有膜性肾炎和膜增生性肾炎病变的病例。ＨＢＶ可以感染肾组织但并不在肾组织中复制。这一实验结果较为支持乙型肝炎患者肾脏出现的病变可能系沉积于肾小球内的免疫复合物介导损伤的结果。     

应用聚合酶链反应技术检测肝组织中的HBV－DNA

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，对４２例肝活切组织石蜡切片中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ进行检测，并与乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的免疫组织化学及血清学检测进行比较，ＨＢＶ－ＰＣＲ阳性率为７３．８％，高于组织及血清ＨＢｓＡｇ阳性率（分别为５９．５％和５０．０％）。３例病理形态呈肝炎改变，而血清ＨＢｓＡｇ（─）的肝组织中有２例检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，提示ＰＣＲ的高度敏感性和准确性。８３．３％的门脉性肝硬变和８７．５％的肝细胞癌组织中ＨＢＶ－ＰＣＲ呈阳性，进一步证实了上述两病与ＨＢＶ的关系密切。我们还发现肝细胞淤胆患者ＨＢＶ感染率较高，ＨＢＶ－ＤＮＡ及组织ＨＢｓＡｇ阳性比例各为６／９和４／８。     

新生儿乙型肝炎疫苗免疫失败同孕妇血清乙型肝炎…

以ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ阳性孕妇作为研究对象，用病例－对照研究方法，比较婴儿乙型肝炎疫苗免疫失败和婴儿疫苗免疫成功两组孕妇分娩时血清乙型肝炎病毒ＨＢＶ－ＤＮＡ含量进一步用定群方法研究母亲ＨＢＶ－ＤＮＡ含量与其婴儿免疫后ＨＢｓＡｇ持续携带 关系，证实孕妇血清ＨＢＶ－ＤＮＡ高含量是婴儿免疫失败的主要原因。     

HBV感染与IgA肾病肾小管-间质病变的关系

目的 探讨ＩｇＡ肾病ＨＢＶ感染与肾小管间质病变的关系。方法 利用原位分子杂交（ＧＨＢＶ ＤＮＡ）、免疫组化（ＨＢＡｇ、ＣＤ３、ＣＤ８）以及ＨＢＶ ＤＮＡ－ＨＢＡｇ和ＨＢＡｇ－ＣＤ４３双标记技术,对９１例ＩｇＡ肾病肾穿刺标本进行研究。结果 肾组织内ＨＢＡｇ阳性率为６９．２％。ＨＢＶ ＤＮＡ原位杂交阳性率为４２．９％。ＨＢＶ ＤＮＡ阳性的病例,双重标记染色发现ＨＢＶ ＤＮＡ阳性肾小管上皮细胞可表达ＨＢ     

肝硬变内HBV DNA及其五种抗原的表达及意义

取２２５例人肝硬变活检组织石蜡切片，检测了ＨＢＶＤＮＡ及其５种抗原。分别用免疫组化ＡＢＣ法检测ＨＢｘＡｇ、ｐｒｅ－Ｓ＿１和ｐｒｅ－Ｓ＿２抗原；用ＰＡＰ法检测ＨＢｓＡｇ和ＨＢｃＡｇ；用原位杂交方法检测ＨＢＶＤＮＡ；用免疫组化、原位杂交双标记方法检测ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｓＡｇ、ＨＢｘＡｇ或ＨＢｃＡｇ。结果显示，阳性检出率ＨＢｓＡｇ为７０．０％（１２８／１８３例），ｐｒｅ－Ｓ＿１抗原为６４．４％（８５／１３２例）、ｐｒｅ－Ｓ＿２抗原为６１．４％（８１／１３２例），ＨＢｘＡｇ为７５．３％（１１３／１５０例），ＨＢｃＡｇ为２２．４％（３９／１７４例），ＨＢＶＤＮＡ为６２．４％（５８／９３例）。双标阳性检出率ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｓＡｇ为３７．３％（１９／５１例），ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｘ－Ａｇ为８６．３％（４４／５１例），ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｃＡｇ为３９．２％（２０／５１例）。ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢＶ５种抗原阳性病例中８０％以上均伴有肝细胞不典型增生。这一结果表明，在我国肝硬变的发生发展与ＨＢＶ慢性感染有密切的关系。     

小鼠口眼HCV基因工程菌产生的细胞和体液免疫

近年来研究表明ＤＮＡ直接接种动物体内可诱导机体产生免疫反应，很可能成为预防感染的新型疫苗，即基因疫苗。含ＨＣＶ基因重组质粒ＤＮＡ的工程菌是否也有可能在预防ＨＣＶ感染中发挥一定的作用？本文初步观察了经口眼途径接种含ＨＣＶ核心基因重组质粒（ＨＣＶ，ｃｏｒｅ／ｐＭＡＬ）的大肠杆菌后，ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体内的细胞和休液免疫反应。研究分为①实验组，分别口服１～３次（Ｈ１－Ｈ３）含ＨＣＶ．ｃｏｒｅ／ｐＭＡＬ的大肠杆菌；②口眼含ＰＭＡＬ质粒的大肠杆菌的对照组（Ｐ）；③不给细菌的对照组（Ｃ）。实验组小鼠淋巴细胞在…