ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究

目的 通过对ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究，为下一步研究打下基础。方法利用细胞集落形成实验研究肺癌细胞株A549、NCI—H446的放射敏感性差异，并结合免疫荧光实验和激光共聚焦扫描（LSCM）技术来探讨两细胞株中ATM蛋白的表达差异与放射敏感性之间的关系。结果集落形成实验中，在接受2、4、6、8Gy剂量照射时，A549和NCI—H446两肺癌细胞株的存活分数分别为81．0％、32．4％、12．0％、3．5％和52．4％、17．0％、3．2％、0．7％。ATM蛋白定位于细胞浆和胞核；利用LSCM分析两细胞株中ATM蛋白的表达差异，A549细胞ATM蛋白荧光强度（71．188＋13．379）较NCI-H446细胞（47．478±19．032）明显增强（P〈0．0001），有统计学意义。结论两肺癌细胞株A549和NCI-H446具有放射敏感性差异，ATM蛋白在两细胞株中的表达亦有差异显著性，表明其表达量可能与放射敏感性呈负相关。     

X射线对人肺癌A549细胞Bmi-1表达的影响

目的：研究X射线照射对人肺癌A549细胞株中Bmi-1 mRNA和蛋白表达的影响。方法：用不同剂量（0、2、4、6Gy）的X射线照射体外培养的人肺癌A549细胞株,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测照射0、6、12、24、48和72 h后Bmi-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：与对照组比较,2、4、6 Gy X射线照射A549细胞后48 h内Bmi-1 mRNA表达升高,差异均有统计学意义（P〈0.05）;（2 Gy 48 h组除外）,2 Gy组照射后6 h、4 Gy组12 h、6 Gy组24 h升高最显著（P〈0.05）。照射后48 h内蛋白表达升高（4Gy除外）,48 h后蛋白表达逐渐下降,至72 h时接近未照射组水平。各时间点（除4 Gy 48 h和72 h外）的蛋白表达与对照组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：在本实验条件下,2～6 Gy剂量X射线照射48 h内可使人肺癌A549细胞Bmi-1表达升高,之后表达逐渐降低。     

EGFR酪氨酸激酶区域突变对NSCLC放疗敏感性影响的初步研究

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶区域突变能否影响放射治疗疗效。方法:选取野生型EGFR和突变型EGFR细胞株A549和H1975,分别进行不同剂量的X射线照射后,用克隆细胞计数的方法计算细胞生存分数(SF),并采用SPSS 13.0软件按线性二次模型拟合细胞存活曲线,计算α/β值。免疫荧光技术观察磷酸化H2AX(γH2AX)焦点数的变化,推测DNA双链断裂后修复动力学。结果:H1975及A549细胞SF2值分别为0.62和0.89,α/β分别为4.00和0.19。H1975细胞SF2较A549小,差异有统计学意义,P<0.05;但α/β值较大,差异有统计学意义,P<0.05。2种细胞株在照射4Gy后15min开始出现γH2AX焦点数增多,但是H1975细胞株较A549多,于3h时保持约70%,24h时仍有约25%,而A549细胞株在照射后3h消失接近90%。结论:NSCLCEGFR酪氨酸激酶区域突变能增加放射敏感性,可成为预测放射治疗疗效的一个指标。     

高表达HMGB1肺癌细胞系的筛选及意义

背景与目的 在人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446中筛选高表达HMGB1的细胞株,作为人肺癌细胞HMGB1基因研究的理想材料.方法 采用实时荧光定量PCR和Western blot方法对人肺癌细胞HMGB1基因在4株细胞中的mRNA和蛋白水平的表达进行检测,筛选出高表达HMGB1基因的人肺癌细胞株.结果 人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446中均有HMGB1基因表达,其中人大细胞肺癌细胞株L9981表达水平最高,mRNA是表达量最低的人肺腺癌细胞株A549mRNA表达量的10.3倍;人大细胞肺癌细胞株L9981 HMGB1蛋白表达水平最高,与其它3种人肺癌细胞株相比有统计学差异(P<0.001).结论 人大细胞肺癌L9981细胞株为HMGB1高表达细胞株,可作为进行肺癌细胞中研究HMGB1的实验材料.     

60Co-γ照射对肺癌A549细胞VEGF表达的影响

目的:探讨60Co -γ射线照射肺癌A549细胞后血管内皮生长因子(vascula endothelial growth factor ,VEGF)表达变化.方法:2 Gy剂量60 Co-γ射线照射肺癌A549细胞,以荧光定量PCR法检测照射后4、12、24、48、72 h VEGF mRNA表达改变, 以ELISA法检测各组培养液上清中VEGF蛋白表达量变化.结果:以对照组(未照射组)VEGF mRNA表达量为1,照射后4 h VEGF mRNA表达开始升高,12、24小时达到高峰(8.83±3.01,P＜0.05 ;14.67±7.18,P＜0.01),48-72 h随后降至接近对照组水平.ELISA检测培养液上清中VEGF蛋白表达量,在照射后4 h 降低,随后开始升高,24、48 h达到高峰(600.86±20.87,P＜0.05;594.75± 2.52,P＜0.05),72 h降至对照组水平.结论:2 Gy剂量60Co-γ射线照射肺癌A549细胞后早期VEGF表达升高,我们推测此时可能是联合抗VEGF药物抑制肺癌转移的最佳时机.     

不同肺癌细胞株中VEGFR-2 mRNA表达的实验研究

目的 研究不同非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株中血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2） mRNA的表达情况。方法 采用实时荧光定量PCR法检测人肺黏液表皮样癌NCI-H292细胞株、人肺腺癌NCI-H1299细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人肺巨细胞癌95D细胞株和人肺鳞癌Calu-1细胞株中VEGFR-2 mRNA的表达。结果 Calu-1、NCI-H292、95D、NCI-H1299和A549细胞株中VEGFR-2 mRNA表达依次为1.213±0.134、1.008±0.164、0.754±0.088、0.582±0.171和0.121±0.026,差异有统计学意义（F=31.875, P=0.000）。Calu-1与NCI-H292细胞株间VEGFR-2 mRNA表达无统计学差异（P=0.080）,NCI-H1299与95D细胞株间VEGFR-2 mRNA表达亦无统计学差异（P=0.137）,其余细胞株间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 不同NSCLC细胞株中VEGFR 2 mRNA表达量不同,可能与不同肿瘤细胞的生物学行为有关。     

CD40信号通过TNFRⅠ途径抑制肺癌细胞增殖的研究

背景与目的:CD40活化信号可抑制多种肿瘤细胞体外生长,但其分子机制尚不明确,本研究旨在探讨激发CD40信号对肺癌细胞株NC1-H460、A549的增殖及肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)、膜型TNF-α(mTNF-α)表达的影响及相关机制.方法:免疫荧光标记和流式细胞术检测肺癌细胞表面CD40的表达以及激发CD40对细胞表面TNFR和mTNF-α表达谱的影响;Western blot检测激发CD40对细胞TNFR和mTNF-α蛋白含量表达的影响;采用四氮唑盐(MTTr)比色法抗体中和实验分析阻断TNFR I及TNF-α对CD40激发效应的影响:酶联免疫吸附(ELISA)法检测激发CD40对肺癌细胞培养上清中可溶性TNF-α(sTNF-α)含量的影响.结果:(1)肺癌细胞株NCI-H460、A549表面CD40表达分别为(89.0±3.2)%、(62.2±4.5)%.(2)免疫荧光和流式细胞术示,激发NCI-H460和A549细胞表面CD40分子48 h后.其表面TNFRI表达率分别为(36.2±4.6)%、(38.5±5.9)%,较对照组分别为(7.2±1.9)%、(15.2±3.1)%明显升高(P＜0.05);而其表面TNFRⅡ表达率分别为(5.8±1.2)%、(18.0±1.6)%,较对照组分别为(38.8±4.3)%、(58.1±3.6)%明显降低(P＜0.05);其表面TNF-α表达率分别为(7.0±0.9)%、(8.7±1.1)%,较对照组分别为(15.0±2.1)%、(26.5±3.2)%也明显降低(P＜0.05).(3)Western blot示,激发CD40可使NCI-H460和A549细胞TNFR I蛋白表达增强,TNFRⅡ蛋白表达减弱,而mTNF-α 蛋白表达无明显变化.(4)CD40激发前后肺癌细胞培养上清中未检测到sTNF-α的存在.(5)激发CD40能明显抑制NCI-H460、A549细胞的增殖(P＜0.05).而阻断TNFR I后CIM0信号的细胞增殖抑制效应消失.(6)阻断TNF-α亦可明显抑制两肺癌细胞株增殖(P＜0.05).而同时激发CD40未见两者存在协同效应.结论:CD40信号是通过mTNF-α/TNFR I途径抑制CD40表达阳性肺癌细胞株的体外增殖.     

GLA对肺癌细胞株E-CD表达及侵袭能力的影响

目的:观察GLA对肺癌细胞株体外生长抑制,E-CD表达及侵袭能力的影响。方法:采用细胞计数、SP免疫组织化学、图像分析及侵袭小室等方法,观察人肺腺癌细胞株A549、小细胞肺癌细胞株NC-H446在GLA、ARTA处理不同时间后细胞生长、E-CD表达及侵袭能力的影响。结果:在GLA干预下,NC-H446、A549两细胞株生长受到抑制,E-CD阳性表达率分别由原来的12%±8%、23%±11%提高到34%±9%、39%±13%,IOD分别由78.5%±16.9%、109.8%±13.2%增加到200.3%±21.7%、229.7%±11.0%,前后相比具有显著差异(P<0.01);穿过基质胶的细胞数分别为126.5±43.61、106.9±55.48,与对照组相比有显著差异(P<0.01);上述情况与ARTA相比,无明显差异(P>0.05)。结论:GLA能明显抑制两细胞株生长,促进E-CD的正常表达,减弱肿瘤细胞的侵袭转移能力。     

凋亡抑制基因survivin在多种肺癌细胞株中的表达及其意义

目的:探讨凋亡抑制基因survivin在多种肺癌细胞株中的表达及其意义.方法:分别采用Real-time PCR与Western blot的方法,检测人肺腺癌细胞株A549、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、大细胞肺癌细胞株NCI-H460、小细胞肺癌细胞株NCI-H446中survivin mRNA与蛋白的表达水平.结果:Real-time PCR检测发现四种肺癌细胞株中survivin mRNA均呈强阳性表达,且Western blot检测结果亦与 RT-PCR基本一致.结论:Survivin基因与肺癌发生、发展紧密相关,值得进一步深入研究.     

PKC抑制剂对人肺腺癌细胞的放射增敏作用

 目的　探讨PKC抑制剂对肺癌放射敏感性的影响; 方法　采用MTT法检测了人肺腺癌细胞株A549在PKC抑制剂白屈莱红碱(CH)处 理前后,2Gy照射的细胞存活分数(SF2),并采用流式细胞术,对其凋亡率以及p53、Bcl -2蛋白表达进行了检测;结果　CH处理后A549凋亡 率增高,SF2下降。p53在X线照射后表达增强,而CH处理组p53表达 呈相对抑制状态。Bcl-2在处理前后变化温和。结论　PKC抑制剂对A 549细胞株的放射敏感性有增强作用,这种作用可能与凋亡率升高有关,而p53可能与 PKC抑制剂诱导的凋亡无关。     

TIME- AND DOSE-DEPENDENT UP-REGULATION OF TNF-α mRNA AFTER IRRADIATION OF HUMAN NSCLC CELL LINES IN VITRO

Objective： Even though radiotherapy plays a major role in the local treatment of non-small cell lung cancer （NSCLC）, little is known about the molecular effects of irradiation in this tumor. In the present study, we examined two NSCLC cell lines for their endogenous production of TNF-α after irradiation. To investigate the radiation-induced TNF-α production in NSCLC cell lines. Methods： Two human NSCLC cell lines （A549： squamous; NCI-H596： adenosquamous） were investigated for their TNF-α mRNA （real-time RT-PCR） after exposure to different irradiation doses （2, 5, 10, 20, 30, 40 Gy） and time intervals （1, 3, 6, 12, 24, 48 or 72 h）. The TNF-α mRNA expression was quantified by real-time RT-PCR. The clonogenic survival was evaluated after irradiation with 2, 4, 6 and 8 Gy. Results： Non-irradiated NSCLC cells exhibited no or very low TNF-α expression. For the NCI-H596 cell line, TNF-α expression was significantly elevated 1～12 h （maximum 6h： 568fold increase relative to unirradiated cells） in a time-dependent manner. The radiation-induced increase could be observed after irradiation with 2 Gy reaching maximal at 40 Gy, with 83 times higher than normal controls. The clonogenic survival of these cell lines was nearly identical. Conclusion： NCI-H596 cells produce significant quantities of TNF-α following irradiation in a time- and dose-dependent manner. The pro-inflammatory cytokine TNF-α is a key mediator for the pathogenesis of radiation pneumonitis. Radiation-induced endogenous TNF-α expression in NSCLC cells may affect the normal lung adjacent to the tumor and may be associated with an adverse clinical outcome of the patient.     

X射线对肺癌细胞系p57kip2转录表达的影响

目的:研究X射线对肺癌细胞系NCI-H226和A549的印记基因p57kip2转录表达的影响。方法:对数生长期的肺癌细胞系NCI-H226和A549,分别予以2、4、8和12GyX射线照射,并于照射前和照射后6、12、24、36和48h分别提取RNA,采用RT-PCR技术检测各时相p57kip2mRNA的含量,分析不同剂量X射线照射后对其转录水平的影响。结果:两组肺癌细胞p57的转录表达在不同照射剂量和不同时间水平间差异有统计学意义,P<0·05,A549经过X射线照射后,p57kip2的mRNA含量明显升高,且与照射剂量呈线性依赖关系;NCI-H226虽然未见明显规律,但在X射线照射后的峰值mR-NA含量均明显升高。结论:X射线照射后能够上调肺癌细胞p57kip2的mRNA的表达,预示着p57可能参与了放射线所致细胞周期重新分布和细胞凋亡的过程,并且可能预测肺癌细胞的放射敏感性,但其表达与时间剂量的关系尚需要进一步研究。     

X射线对人肺癌细胞Pokemon表达影响

目的 研究不同剂量X射线照射及照射后不同时间点对体外培养的人肺癌A₅₄₉细胞系Pokemon基因和蛋白表达的影响。方法 用X射线2、4、6、8 Gy吸收剂量照射体外培养的A₅₄₉细胞系,分别采用荧光实时定量PCR技术和蛋白印记法检测A₅₄₉细胞照射后2、4、8、12、24、48 h的Pokemon mRNA和蛋白表达水平,以未照射组为对照。采用二苯基四氮唑溴盐法分别检测2 Gy照射1、2、3、4、5 d后A₅₄₉细胞增殖能力变化,以未照射组为对照。结果 Pokemon mRNA的表达在2、4、6、8 Gy照射后早期呈降低趋势,但晚期呈升高趋势,大部分时间点差异有统计学意义(t=3.40~154.76,P=0.000~0.041);Pokemon 蛋白的表达较对照组均升高,且各剂量组均在照射后8 h达峰值,在大部分时间点实验组与对照组差异有统计学意义(t=4.18~89.64,P=0.000~0.039)。照射组细胞接种后第3~5天细胞增殖能力显著低于对照组(t=2.34~18.19,P=0.000~0.040)。结论 一定剂量X射线在特定条件下可诱导人肺癌A₅₄₉细胞Pokemon mRNA和蛋白表达升高,可能与A₅₄₉细胞辐射抗性有关。     

低剂量照射对细胞周期和修复基因表达的影响

目的观察低剂量照射对A549(肺癌细胞)和2BS细胞(人胚胎肺成纤维细胞)细胞周期及修复基因表达的影响.探讨肿瘤细胞与正常细胞在诱导修复基因表达方面的差异,并结合细胞周期变化,进一步阐明适应性反应形成机制.方法(1)应用流式细胞技术,对不同剂量照射后A549和2BS细胞周期进行分析;(2)应用Northern-blot检测不同照射剂量DNA修复基因hR24L、bRAD6和bRAD52转录水平的变化.结果(1)2BS细胞经75mGy X线照射组,及低剂量加高剂量照射组于照后30分钟即出现明显的G2期阻滞,且细胞周期于24小时内恢复.A549细胞在75mGy X线照射后,细胞周期未发生变化;(2)2BS细胞在75mGy X照射下,hR24L、hRAD6表达增强,bRAD52无变化.A549细胞低剂量照射修复基因表达未见显著变化.结论低剂量照射后2BS细胞与A549细胞周期改变存在差异,且细胞周期的调控与DNA修复基因的表达有着密切的关系.     

Aurora-A激酶在人类不同肺癌细胞株中的表达

背景与目的近年来的研究发现Aurora-A在多种恶性肿瘤中高表达。本研究检测Aurora-A激酶在人类不同肺癌细胞株中的表达及其与DNA含量的关系,旨在寻找肺癌新的分子治疗靶点和肿瘤标记物,为指导肺癌个性化治疗提供一种新的方法。方法应用RT-PCR与Westernblot方法检测PG(高转移的巨细胞肺癌)、A549(肺腺癌)、NCI-H460(大细胞肺癌)3种肺癌细胞株Aurora-A的表达;流式细胞仪检测3种肺癌细胞DNA含量(四倍体及多倍体),分析Aurora-A的表达与DNA含量的相关性。结果半定量RT-PCR电泳结果显示,A549、PG、NCI-H460中Aurora-A/β-actin比值分别为1.16、1.14、0.84;Westernblot结果在A549、PG与NCI-H460中的Aurora-A/β-actin比值分别为21.13、8.96与6.43,提示3种肺癌细胞Aurora-A均呈高表达。A549、PG、NCI-H460细胞含有四倍体的细胞比例分别为14.97%、19.88%和10.60%,三者有显著性差异(P<0.01);其多倍体(>4N)的细胞比例分别为3.59%、2.66%、2.30%。提示Aurora-A表达强弱与肺癌细胞多倍体的比例高低有相关性。结论3种肺癌细胞中Aurora-A基因均高表达,其表达水平在不同肺癌细胞株中存在差异。     

Histone deacetylase inhibitors suppress the inducibility of nuclear factor-kappaB by tumor necrosis factor-alpha receptor-1 down-regulation

Recently, the inhibition of histone deacetylase (HDAC) enzymes has attracted attention in the oncologic community as a new therapeutic opportunity for hematologic and solid tumors including non-small cell lung cancer (NSCLC). In hematologic malignancies, such as diffuse large B-cell lymphoma, the HDAC inhibitor (HDI), suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), has recently entered phase II and III clinical trials. To further advance our understanding of their action on tumor cells, we investigated the possible effect of HDI treatment on the functionality of the nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) pathway in NSCLC. We found that in the NSCLC cell lines, A549 and NCI-H460, the NF-kappaB pathway was strongly inducible, for example, by stimulation with tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). Incubation of several NSCLC cell lines with HDIs resulted in greatly reduced gene expression of TNF-alpha receptor-1. HDI-treated A549 and NCI-H460 cells down-regulated TNF-alpha receptor-1 mRNA and protein levels as well as surface exposure, and consequently responded to TNF-alpha treatment with reduced IKK phosphorylation and activation, delayed IkappaB-alpha phosphorylation, and attenuated NF-kappaB nuclear translocation and DNA binding. Accordingly, stimulation of NF-kappaB target gene expression by TNF-alpha was strongly decreased. In addition, we observed that SAHA displayed antitumor efficacy in vivo against A549 xenografts grown on nude mice. HDIs, therefore, might beneficially contribute to tumor treatment, possibly by reducing the responsiveness of tumor cells to the TNF-alpha-mediated activation of the NF-kappaB pathway. These findings also hint at a possible use of HDIs in inflammatory diseases, which are associated with the overproduction of TNF-alpha, such as rheumatoid arthritis or Crohn's disease.