间充质干细胞源性外泌体提取鉴定方法研究

目的:探讨间充质干细胞源性外泌体的成功提取方法。方法:应用试剂盒二次提取huc-MSCs外泌体,凝胶电泳法及BCA蛋白定量法检测两次提取外泌体蛋白纯度与含量的不同;电镜及流式细胞仪鉴定外泌体。结果:凝胶电泳法及BCA蛋白定量法证实二次提取后外泌体蛋白纯度提高,形态特征明显,并高表达CD63及CD81蛋白。结论:间充质干细胞外泌体经过二次提取纯化后,纯度提高,可以更准确的开展后续实验。     

比较两种方法提取人脐带间充质干细胞外泌体的效果

目的 比较两种方法提取人脐带间充质干细胞来源外泌体的效果。方法 分别采用超速离心法和组合优化法提取人脐带间充质干细胞上清液中外泌体，获得的外泌体设为外泌体A和外泌体B,采用透射电镜观察外泌体形态，纳米颗粒跟踪分析法检测外泌体浓度和粒径，BCA法测定外泌体蛋白含量以及Western blot法检测外泌体表面标志物的蛋白表达。结果 两种方法提取的外泌体均具有茶托形或椭圆形的双膜性结构，且边界清晰，但是外泌体B背景中存在其他聚合物。外泌体A浓度与外泌体B相仿(P>0.05)。外泌体A、B粒径峰值分别为128、101 nm。外泌体A蛋白含量高于外泌体B,且外泌体A表面特异性标志物CD9、CD63、CD81和TSG101蛋白表达高于外泌体B(P<0.05)。结论 两种方法均可以提取人脐带间充质干细胞来源的外泌体，但超速离心法提取的外泌体纯度更高。     

脐带间充质干细胞外泌体提取方法的比较研究

目的 比较脐带间充质干细胞来源外泌体的2种提取方法:超速离心及聚乙二醇沉淀法,测定不同方法提取的外泌体浓度并鉴定其形态及生物学功能,为外泌体的后续应用研究奠定基础.方法 采用超速离心法及聚乙二醇沉淀法提取脐带间充质干细胞外泌体,通过BCA法测定蛋白浓度,透射电镜、纳米颗粒示踪分析技术及Western blot等鉴定不同...     

脂肪干细胞外泌体对人牙髓干细胞增殖与成骨分化的影响北大核心CSCD

目的观察人脂肪间充质干细胞来源外泌体对人牙髓干细胞增殖与成骨分化的影响。方法制备人脂肪来源的间充质干细胞和外泌体。将人牙髓干细胞随机分为3组,正常组进行常规培养,对照组进行成骨诱导分化,实验组在成骨诱导分化时添加5μg·mL^(-1)外泌体。用CCK-8法检测细胞增殖活性,用酶联免疫吸附实验法检测碱性磷酸酶活性,用Western blot法检测骨钙素和骨桥蛋白的表达情况。结果实验组、对照组和正常组的细胞相对增殖活性(光密度值)分别为0.54±0.02,0.34±0.01和0.32±0.01,碱性磷酸酶相对活性(光密度值)分别为10.37±1.26,4.89±0.94和0.71±0.03,骨钙素蛋白相对表达量分别为0.59±0.10,0.23±0.05和0,骨桥蛋白相对表达量分别为0.63±0.12,0.61±0.04和0,实验组的上述指标与对照组和正常组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论人脂肪间充质干细胞来源的外泌体可促进人牙髓干细胞的增殖和成骨分化。     

间充质干细胞来源外泌体的分离及贮存方法研究进展

间充质干细胞来源外泌体(MSCs-Exo)近年来成为替代间充质干细胞发挥治疗作用的研究热点,良好的外泌体分离和贮存方法是保障获得的外泌体具有稳定的质量和可重复的关键,也是临床转化的前提。外泌体具有多种分离方式,包括国际金标准的超速离心法,改良后的蔗糖密度梯度离心法、超滤法以及微流控技术等。贮存温度和贮存介质是影响外泌体生物学完整性的主要因素。结合当下MSCs-Exo的研究现状及其分离和贮存条件的研究进展进行综述,以期为临床转化研究提供参考。     

巨噬细胞来源的外泌体不同提取方法的比较

目的根据聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀原理,结合超高速离心改进一种简便、快速的细胞外泌体分离方法。方法采用超高速离心法、PEG6000沉淀结合超高速离心和EXO Quick试剂盒,分别提取巨噬细胞外泌体。通过透射电镜、NanoSight ZS及Nanoparticle tracker(NTA)分析外泌体的形态和粒径;蛋白印迹法鉴定细胞外泌体标志物Alix、TSG101的表达情况。结果 PEG6000沉淀结合超高速离心法获得的外泌体,其粒径分布和差速离心法相当,小于商品化的EXO Quick试剂盒。而外泌体表面蛋白Alix、TSG101在3种方法提取的沉淀物中都有表达。透射电镜结果显示,3种方法均获得典型的盘状囊泡。结论实验改进的细胞外泌体提取方法操作简洁、效率高,并且成本较低。     

人骨髓间充质干细胞来源外泌体分离、鉴定及卵巢摄取

目的 提取及鉴定人骨髓间充质干细胞(hBMSC)来源外泌体，探讨颗粒细胞及自身免疫性早发性卵巢功能不全(POI)小鼠卵巢摄取外泌体的情况。方法 取P3至P9代hBMSC培养上清液，倒置显微镜下观察P4代hBMSC细胞形态，超高速离心法提取外泌体；纳米流式仪测外泌体粒径；透射电镜观察外泌体形态；Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD9、肿瘤易感基因(TSG)101表达。外泌体采用DiR进行荧光标记；共聚焦显微镜观察人卵巢颗粒细胞(KGN)共孵育24 h和48 h摄取外泌体的情况；用ZP3蛋白多肽构建自身免疫性POI小鼠模型，在建模成功后的第1、7天腹腔注射150μg DiR标记的外泌体。在第2次注射外泌体后的第14天通过活体成像仪监测小鼠卵巢摄取情况。结果 h BMSC呈纺锤状，大小均一，提取出的外泌体平均直径为(81.12±17.23)nm。透射电镜显示外泌体结构为双层膜状；外泌体表面相关特异性蛋白CD63、CD9和TSG101呈阳性。共聚焦显微镜下观察到KGN细胞能够摄取外泌体，并与共孵育24 h比，48 h摄取的外泌体量更多。在自身免疫性POI小鼠模型中观察到小鼠...     

基于骨髓间充质干细胞与外泌体的胃癌研究进展

幽门螺杆菌(Helicobcter pylori,H.pylori)感染、胃癌干细胞及骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是胃癌发生的主要因素。胃癌细胞与MSCs在胃癌微环境中相互作用,通过调节相关因子、信号通路、基因及蛋白的表达发挥促瘤作用。近年来研究发现外泌体是胃癌微环境中细胞与细胞间交流的信使,MSCs外泌体及胃癌外泌体都具有促瘤作用,胃癌外泌体还可通过影响MSCs生物学功能发挥促瘤作用。随着外泌体研究的不断深入,其有可能发现胃癌发生的具体机制及胃癌药物治疗靶标。     

大鼠脂肪间充质干细胞体外诱导成骨分化的实验性研究

目的探讨大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养和成骨诱导分化的可行性。方法取6周龄大鼠双侧腹股沟处脂肪，酶鹪法分离培养原代脂肪间充质干细胞，成骨诱导培养18d，检测细胞成骨表型转化：碱性磷酸酶、骨钙素的表达以及细胞矿化细胞外基质的能力。结果大鼠脂肪中能分离培养出一定量的脂肪间充质干细胞，在成骨诱导培养液作用下，可特异性表达成骨分化的标志：碱性磷酸酶、骨钙素，同时也具有矿化细胞外基质的能力。结论大鼠脂肪间充质干细胞可能是一种理想的骨组织工程种子细胞的来源。     

干扰素γ刺激hUC-MSCs分泌外泌体促进调节性T细胞生成

目的探讨生理和炎性微环境下人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UCMSCs)能否通过外泌体诱导调节性T细胞的生成来发挥免疫抑制功能。方法胶原酶消化法分离h UC-MSCs,应用流式细胞术鉴定h UC-MSCs。IFN-γ模拟体内炎性微环境,以未预处理为对照,分别提取外泌体,得到Nor-h UC-exo和IFN-γ-stimulated h UC-exo,分析其浓度及粒径分布等特征、并鉴定表面标记蛋白CD63的表达。采用h UC-MSCs、Nor-h UCexo、IFN-γpretreated-h UC-MSCs、IFN-γstimulated h UC-exo与人外周血单个核细胞共培养5 d后,流式细胞术检测T细胞的增殖、调节性T细胞的比例变化。结果 h UC-MSCs高表达CD73、CD44等间充质干细胞标志物。IFN-γ刺激前后外泌体粒径无明显变化,但IFN-γ刺激后分泌量和CD63增加(P<0.05)。CFSE染料示踪结果显示,h UC-MSCs来源的外泌体抑制PBMCs增殖(P<0.01),且IFN-γ刺激后明显提高外泌体的免疫抑制能力(P<0.01)。在活化T细胞中,IFN-γ-stimulated h UC-exo组Treg比例(11.53±0.88%)与IFN-γpretreated-h UC-MSCs组(7.54±0.50%)(P<0.05)、Norh UC-exo组(6.60±0.56%)(P<0.01)、对照组(3.87±0.73%)(P<0.01)相比升高。结论 h UC-MSCs可通过分泌外泌体来发挥免疫调节作用,在炎症因子刺激下h UCMSCs分泌的外泌体明显促进调节性T细胞的生成,h UC-exo可能是潜在的免疫抑制载体。     

hUC-MSCs来源的外泌体miR-1260a影响PCOS患者颗粒细胞凋亡的研究

目的 探究人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）来源的外泌体miR-1260a靶向CASP8对多囊卵巢综合征（PCOS）患者颗粒细胞凋亡的影响。方法 取健康足月胎儿的脐带进行组织块贴壁法分离培养获得hUC-MSCs，采用流式细胞仪检测其标志性蛋白CD73和CD90的表达。收集hUC-MSCs培养上清液，提取hUC-MSCs外泌体，透射电镜观察其形态，Western blot检测外泌体膜表面标志物热休克蛋白70(HSP70)和肿瘤易感基因101(TSG101)的表达。PKH67标记外泌体，采用激光共聚焦显微镜观察PCOS颗粒细胞对外泌体的内化作用。Western blot检测hUCMSCs外泌体对PCOS颗粒细胞凋亡的影响。利用GSE69909临床样本进行生物信息学分析，得到hUC-MSCs外泌体中异常高表达的miRNAs，并通过实时荧光定量PCR进行验证。合成miR-1260a模拟物及其对照转染至KGN细胞中，流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。利用Target Scan Human 7.2数据库进行miR-1260a靶基因的预测，采用双荧光素酶报告基因系统检测miR-1260a对靶基因的调...     

间充质干细胞来源外泌体在骨缺损再生中的应用与进展

外泌体是来自细胞旁分泌的一种细胞外囊泡, 因其含有多种生物活性因子, 在细胞间通讯、诱导细胞分化中起重要作用。间充质干细胞来源的外泌体能够影响骨组织细胞增殖、通过信号通路调控诱导成骨、减少免疫炎性反应来促进骨缺损再生。近年来, 外泌体与骨缺损再生之间的关系引起研究者的注意。本文对此方面的研究进展进行综述。     

米非司酮通过抑制Rab27a和Rab27b的表达对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用

目的 研究米非司酮在子宫内膜癌中的功能和潜在分子机制。方法 通过细胞增殖实验研究不同质量浓度（10、50、100 μg/mL）米非司酮以及随着时间变化米非司酮对子宫内膜癌细胞的影响;蛋白免疫印记实验及免疫荧光实验研究米非司酮（50 μg/mL）对子宫内膜癌细胞内外泌体分泌、外泌体调控关键蛋白的表达、外泌体关键调控蛋白对外泌体分泌的影响。结果 随着加入子宫内膜癌细胞内的米非司酮质量浓度升高和时间推移,子宫内膜癌细胞增殖速率显著减慢,同时细胞状态变差,数目显著减少;米非司酮显著降低外泌体蛋白胞外分泌,包括外泌体总蛋白以及标志蛋白CD63和Gp96等,使其滞留在胞内;米非司酮显著降低外泌体分泌调控蛋白Rab27a和Rab27b的表达;敲低外泌体分泌调控蛋白Rab27a和Rab27b的表达显著降低外泌体总蛋白以及标志蛋白CD63的胞外分泌。结论 米非司酮通过抑制外泌体分泌调控蛋白Rab27a和Rab27b的表达,从而抑制外泌体分泌,最终导致子宫内膜癌细胞增殖显著减慢。     

脂肪干细胞来源外泌体携带miR-27抑制白色脂肪的棕色化

目的 探讨脂肪干细胞（ASC）来源的外泌体在白色脂肪棕色化中的作用。方法 分离培养并鉴定小鼠ASC细胞;慢病毒转染构建过表达 miR-27的 ASC细胞;超高速离心提取正常及过表达 miR-27的 ASC细胞分泌的外泌体,实时荧光定量核酸扩增（qRT-PCR）分析外泌体中 miR-27的表达量;高脂喂食构建肥胖小鼠模型,分别注射过表达 miR-27外泌体（过表达组）、正常 ASC外泌体（正常表达组）及生理盐水（对照组）,在寒冷暴露条件下监测体质量变化;剥离小鼠附睾皮下脂肪组织和肩胛骨脂肪组织,比较组织大小,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测解偶联蛋白 1（UCP1）、过氧化物酶体增殖剂激活受体 γ（PPARγ）、含 PR结构域的锌指蛋白 16（PRDM16）、过氧化物酶体增殖子激活受体 γ共激活因子 1α（PGC-1α）的表达。结果 成功提取 ASC及其外泌体,并成功转染 miR-27;ASC及其外泌体中的 miR-27显著高于白色脂肪组织（P＜0.05）。与对照组相比,过表达组及正常表达组的小鼠体质量下降幅度小,随时间的增加效果更加明显（P＜0.05）。过表达组及正常表达组的小鼠的附睾皮下脂肪组织较对照组的小鼠要稍大;而肩胛骨脂肪组织的大小无明显变化。正常表达组与过表达组的 UCP1、PPARγ、PRDM16及 PGC-1α的表达水平较对照组下降（P＜0.05）。结论 脂肪干细胞来源外泌体能够抑制白色脂肪细胞的棕色化。     

膀胱癌来源外泌体携带程序性死亡配体1和共刺激分子B7-H4的表达及初步鉴定

目的 提取并鉴定膀胱癌BIU-87和T24细胞来源的外泌体,检测膀胱癌细胞来源外泌体中程序性死亡配体1(PD-L1)和共刺激分子B7-H4的表达,验证膀胱肿瘤通过外泌体在微环境中传递PD-L1和B7-H4.方法 体外培养膀胱尿路上皮癌BIU-87和T24细胞,超速离心法提取细胞上清液中外泌体,透射电子显微镜(TEM)观察外泌体大小及形态,BCA蛋白定量法测定外泌体蛋白浓度,蛋白质印迹法(WB)鉴定两种膀胱癌细胞的外泌体标志蛋白CD63和CD9,检测膀胱癌细胞来源外泌体PD-L1 (exo-PD-L1)和外泌体B7-H4(exo-B7-H4)的表达.最后,将膀胱癌细胞外泌体分别与膀胱正常上皮SV-HUC-1细胞共培养48h后,RT-PCR和WB分别检测SV-HUC-1细胞中PD-L1和B7-H4的mRNA和蛋白的表达情况.结果 BIU-87和T24细胞上清外泌体总蛋白浓度分别为1.88 μg/μL和1.84μg/μL,总质量分别为169 μg和166 μg.TEM观察外泌体直径为30～150nm的膜性囊泡,呈典型的"杯盘"形态.两种膀胱癌细胞上清液均检测出外泌体标志蛋白CD63及CD9.且两种膀胱癌细胞来源的外泌体中均携带PD-L1和B7-H4.当膀胱癌BIU-87和T24细胞来源的外泌体分别与SV-HUC-1细胞共培养后,后者PD-L1和B7-H4的mRNA表达阴性,两者蛋白表达阳性.结论 成功提取并鉴定了膀胱癌BIU-87和T24细胞来源的外泌体均携带PD-L1和B7-H4,且膀胱癌细胞释放的外泌体能在肿瘤微环境中传递PD-L1和B7-H4,可开展后续膀胱癌来源exo-PD-L1和exo-B7-H4的生物学功能研究.     

转BMP-2基因MSCs细胞微囊制备的影响因素

以高压静电法制备转BMP-2基因骨髓间充质干细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊,考察了细胞浓度、海藻酸钠浓度、细胞悬液离心次数对圆囊率、粒径分布和成囊性的影响.结果表明,细胞浓度3×106个/ml,海藻酸钠浓度1.75%,细胞悬液离心洗涤2次的条件下,能制得球形好、粒径为200～300um的微囊.     

间充质干细胞外泌体治疗急性肺损伤的新思路和新策略

急性肺损伤(ALI)是临床常见的疾病,以肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,弥漫性肺间质及肺泡水肿,急性低氧性呼吸功能不全为特征,发展至终末阶段为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。间充质干细胞(MSC)对ALI有较好疗效,其释放的外泌体(EXOs)可能在治疗过程中发挥重要作用。外泌体是细胞间通讯的主要载体,在细胞间转运具有生物活性的脂质、核酸及蛋白质,从而改变受体细胞的生物学功能。间充质干细胞来源外泌体(MSC-EXOs)具有抗炎、抗细胞凋亡及促进组织修复及再生等作用,是治疗ALI的新靶点。本文主要对MSC-EXOs在ALI治疗中的应用及其作用机制进行综述,有助于进一步探讨MSC-EXOs治疗ALI的可行性。     

诱导多能干细胞分泌的外泌体对角质细胞增殖与迁移的影响

目的 探讨多能干细胞(iPSC)分泌的外泌体(Exos)促进角质细胞的增殖、侵袭与迁移,从而促进伤口愈合的作用。方法 提取iPSC-Exos并通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析技术和蛋白质印迹法进行鉴定。将带有PKH26标记纯化的iPSC-Exos加到角质细胞(HaCaT)里进行角质细胞摄取外泌体的测定;用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测外泌体最佳工作浓度。HaCaT细胞分为对照组(细胞划痕)和实验组(细胞划痕之后加入最佳工作浓度的外泌体)。分别用CCK-8、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、划痕实验及Transwell实验检测各组细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。结果 iPSC-Exos呈现圆形或椭圆形的膜囊泡结构,直径为(120.00±25.00)nm。实验组iPSC-Exos特征性表面标志物CD9、CD63、CD81的表达均呈阳性,对照组均呈阴性。HaCaT细胞能够摄取iPSC-Exos。干预24 h后,对照组和实验组的划痕愈合率分别为(25.70±1.07)%和(71.60±12.76)%,Transwell侵袭细胞数分别为(86.33±10.79)和(166.33±24...     

人脂肪来源的间充质干细胞的生物学研究

目的探索从人脂肪中获取间充质干细胞的方法,通过观察人脂肪来源间充质干细胞(hADAS)的形态学、生长动力学、细胞表面标志,揭示其生物学特性。方法分离培养脂肪间充质干细胞并观察其形态学变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测细胞活性;流式细胞仪测细胞周期和间充质干细胞表面抗原。结果脂肪干细胞呈成纤维细胞样;MTT比色法证实其有很强的增殖活性;流式细胞周期显示处于增生活跃期的细胞占很大比例;间充质干细胞表面抗原CD29、CD44随着传代表达逐渐增高,不表达内皮细胞标志CD31,造血干细胞标志CD34随细胞培养时间延长表达逐渐降低。结论通过酶消化法可从人脂肪中获取间充质干细胞,具有很强的增殖能力,表达干细胞表面标志。     

BMSCs外泌体来源miR-133a对大鼠脊髓损伤修复的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体来源miR-133a对大鼠脊髓损伤(SCI)修复的影响。方法 原代分离和培养BMSCs,测定BMSCs细胞表面标记物(CD90,CD45)表达;提取BMSCs外泌体,观察外泌体形态及外泌体标记分子(Alix、CD63)表达;建立SCI大鼠模型,随机将大鼠分为假手术组、SCI组、外泌体组、外泌体-抑制剂对照(NC)组、外泌体-miR-133a抑制剂组,28 d后,对各组大鼠进行BBB评分评估脊髓损伤程度;分离大鼠骨髓组织,检测该组织病理学变化、细胞凋亡状况;同时检测相关蛋白[胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核抗原(NeuN)、炎性小体3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-1]及miR-133a表达水平。双荧光素酶实验验证miR-133a、NLRP3靶向关系。结果 BMSCs细胞中CD90、CD45表达率分别为98.07%、0.09%。外泌体呈球形,Alix、CD63呈阳性表达。与假手术组比较,SCI组BBB评分、NeuN、miR-133a表达显著降低,细胞凋亡率、GFAP、NLRP3、caspase-1表达显著增加(P&...