COL1A1-shRNA表达质粒构建及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选

目的: 构建和筛选对大鼠肝星状细胞前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA有抑制作用的COL1A1短发夹RNA (shRNA)的表达质粒.方法:从NCBI网站获得大鼠的COL1A1 cDNA序列, 根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列, 相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中, 即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C. 为得到高效沉默COL1A1-siRNA, 以脂质体LipofectAMINE2000, 将1、2、3、4 μg DNA质粒转染至HSC-T6细胞中, 并观察转染效果. 将最佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞, RT-PCR分析各组的COL1A1 mRNA表达水平.结果: 靶向COL1A1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析, shRNA编码序列与设计的片段完全一致, 经酶切凝胶电泳证实载体构建成功. 1、2、3、4 μg组转染效率分别为16.7%、20.3%、23.5%和22.3%, 以2 μg siRNA为最佳剂量, pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C对COL1A1 mRNA的抑制率分别为16.6%, 63.3%和80.3%. 结论:筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1 mRNA的表达, 从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料.     

人参皂甙-Rg_3、-Rb_3抗病毒作用的研究

目的　观察人参皂甙 - Rg3、- Rb3抗病毒的活性。方法　在 FL细胞中扩增病毒 ,进行 TCID5 0 滴定 ,采用细胞病变抑制效应 (CPE)的测定法观察药物的抗病毒作用。结果　 0 .1 2 5～ 4.0μg/ ml浓度的人参皂甙 - Rg3因浓度不同可以以不同方式抑制 HSV- 1和 Polio V致 CPE发生 ;1 56.2～ 2 50μg/ ml浓度的人参皂甙 - Rb3因浓度不同可以不同方式抑制 HSV- 1和 VSV致 CPE发生。结论　人参皂甙 - Rg3具有抗 HSV- 1和 Poli 活性 ,人参皂甙 - Rb3具有抗 HSV- 1和 VSV活性     

小鼠肝细胞SMAC基因特异干扰载体的构建及慢病毒包装

目的构建并鉴定小鼠SMAC特异干扰载体,并进行慢病毒包装。方法针对小鼠SMAC基因设计并合成3对干扰序列siRNA1、siRNA2、siRNA3及一对阴性对照序列siRNAn,脂质体法转染小鼠肝细胞,Real time PCR法筛选出最佳干扰序列。依据该最佳干扰序列合成DNA oligo,连接GV115载体,获得重组干扰质粒,PCR鉴定阳性克隆并测序鉴定构建的正确性。将该重组干扰质粒与辅助质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞,进行慢病毒包装,收集细胞上清并浓缩,梯度稀释法测定病毒滴度。多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果 3条siRNA对肝细胞SMAC mRNA均有不同程度的抑制作用,其中siRNA1的抑制效应最强,抑制效率达到70.3%。依siRNA1片段合成DNA oligo,并与慢病毒载体连接,测序显示其构建正确,梯度稀释法测定慢病毒滴度为6×108TU/ml。结论成功构建了小鼠SMAC基因特异干扰性的慢病毒,为研究SMAC基因在肝衰竭中的作用奠定基础。     

腺相关病毒介导的小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1及基质金属蛋白酶13表达的影响

目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1及基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达情况.方法 将对大鼠TIMP-1基因具有最强抑制作用的一对siRNA,在体外构建为短发夹siRNA表达载体后,将其包装为重组AAV-rAAV/siRNA-TIMP-1/neo并感染HSC-T6,于感染后4周及12周应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1及MMP13 mRNA及蛋白质表达情况.结果 经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的1对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆.将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,rAAV/siRNA-TIMP-1/neo感染组在感染后4周及12周细胞TIMP-1 mRNA及蛋白质表达水平明显降低(P＜0.01),而MMP13 mRNA及蛋白质表达水平明显增高(P＜0.01).结论 化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因表达.     

Beclinl基因沉默对胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长的影响

Beclin1基因与酵母自噬基因Atg 6同源,是参与哺乳动物自噬体形成,调控细胞自噬过程的重要基因.Beclin1自噬基因的缺陷可能导致肿瘤细胞逃避自噬性死亡[1],而稳定转染Beclin1后可促进细胞的自噬活性,并降低了其成瘤能力[2].本研究观察沉默胰腺癌MiaPaCa-2细胞的Beclin1基因表达后对其增殖、凋亡及细胞周期分布的影响,为胰腺癌的基因治疗提供新的思路. 一、材料与方法 1.靶向Beclin1的siRNA表达载体构建：根据siRNA设计原理,由上海吉玛制药技术有限公司构建3个插入靶向Beclin1基因的siRNA（Beclin1-siRNA）质粒以及阴性对照siRNA（NC-siRNA）质粒和荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）质粒.经筛选后选择沉默效果最好的Beclin1-siRNA序列插入表达载体U6/Neo,构建表达载体U6/Neo-shBeclin1,同时构建阴性对照载体pGPU6/Neo-shNC及荧光对照载体pGPU6/GFP/Neo-shNC.     

STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞的沉默作用

目的 探讨STAT3基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌SW480细胞STAT3基因的干扰作用.方法 根据siRNA设计原则,构建靶向STAT3基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480),通过RT-PCR和 Western 印迹检测结肠癌SW480细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平.结果 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确.质粒成功转染SW480细胞后,该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05).结论 成功构建靶向STAT3基因的shRNA表达载体,转染SW480细胞,能有效抑制细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达,为STAT3基因靶向治疗提供前期的实验依据.     

干扰ABCG2的表达对宫颈癌细胞化疗的增敏作用

目的探讨靶向宫颈癌He La细胞内三磷酸腺苷结合盒转运体(ABC)G2基因的siRNA对He La细胞的化疗增敏作用。方法构建靶向ABCG2的RNA干扰重组慢病毒Ad-ABCG2-siRNA,感染宫颈癌耐药细胞耐丝裂霉素细胞He La/MMC后,筛选稳定表达细胞建立稳定表达细胞系。采用qRT-PCR、Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测细胞内ABCG2基因的表达,验证ABCG2的表达被成功下调,然后用MTT法测定He La/MMC细胞对化疗药物敏感性的变化;采用流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况。结果成功构建靶向ABCG2的RNA干扰重组慢病毒Ad-ABCG2-siRNA,转染He La/MMC细胞后,经qRT-PCR、Western印迹检测,ABCG2的表达被成功下调;MTT法测定显示,经不同浓度的丝裂霉素处理后,ABCG2表达下调的He La/MMC细胞组(实验组)细胞抑制率明显高于未经干扰的He La/MMC细胞组(对照组),差异具有统计学意义(P0.05),药物敏感性提高3.42倍。流式细胞术分析结果显示,实验组He La/MMC细胞的总凋亡率[(35.6±1.1)%]明显高于对照组[(15.3±2.3)%],差异有统计学意义(P0.05)。结论下调ABCG2的表达对宫颈癌细胞具有化疗增敏作用,可促进耐药细胞He La/MMC的凋亡。     

NP基因特异性干扰RNA抑制H5N1高致病性禽流感病毒复制的研究

目的设计针对H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）核蛋白（NP）基因的干扰RNA（siRNA）,研究其在细胞水平抑制病毒复制的效果。方法根据siRNA设计原则,设计并合成3对靶向HPAIV NP基因的siRNA,构建表达性质粒（ps-NP732、ps-NP863、ps-NP1344）,分别转染MDCK细胞并攻毒,通过病毒滴度测定r、eal-time PCR、间接免疫荧光试验和Western blot,检测siRNA抑制AIV复制的效果。结果设计的3对siRNA中,ps-NP863明显抑制AIV复制,病毒滴度与对照组相比降低31倍,real-time PCR、间接免疫荧光试验、Western blot结果与病毒滴度测定结果相符,而ps-NP732和ps-NP1344无抑制AIV复制作用。结论构建的ps-NP863可显著抑制HPAIV复制,为开发抗AIV治疗制剂和动物机体抗AIV研究奠定了基础。     

靶向大鼠Smad3基因的siRNA筛选及其shRNA重组慢病毒的构建

目的设计并筛选针对大鼠Smad3基因的siRNA,构建靶向Smad3基因的shRNA重组慢病毒。方法针对大鼠Smad3基因设计并合成6对siRNA（siRNA001～006）及1对无关对照siRNA,转染大鼠肝细胞株BRL-3A,应用Western Blot检测各siRNA对SMAD3蛋白表达的抑制作用,挑选抑制效率高的siRNA。依据所得的序列合成并克隆到pLL3.7载体中,与包装质粒pRSV-rev、pMDLg-pRRE和VSV-G共转染293FT细胞获得靶向Smad3的慢病毒。通过流式细胞仪绿色荧光蛋白（GFP）荧光计数来检测病毒滴度。结果 Western Blot检测证实siRNA001、siRNA005、siRNA006对SMAD3蛋白表达的抑制作用明显,抑制率分别可达83.36%、86.99%及64.88%,而对照siRNA无明显作用。酶切和测序结果显示Smad3 shRNA及对照shRNA重组载体质粒pLL3.7-shRNA构建成功,将构建的质粒进行慢病毒包装可产生有感染活性的慢病毒颗粒。结论筛选出针对大鼠Smad3基因有明显抑制作用的3对siRNA,并成功构建表达相应shRNA的4种重组慢病毒,为研究调控Smad3的表达对肝再生或肝纤维化的影响提供了实验条件。     

R5嗜性的人类免疫缺陷病毒-1在疾病不同阶段的生物学特性

目的 研究HIV-1感染者不同时期分离的R5毒株的生物学特性.方法 采用传统的共培养方法分离并培养HIV-1,用表达CD4和CC趋化因子受体5(CCR5)或CXC趋化因子受体4(CXCR4)的GHOST细胞系,通过流式细胞仪测定病毒辅助受体的利用和感染性,从而判断所分离毒株的CCR5嗜型(R5型毒株);使用2 ng P24病毒量感染正常人分离的外周血单个核细胞(PBMC),ELISA法检测第1、3、5、7、10、15天的HIV-1 P24抗原,反映病毒复制能力;采用HIV-1核酸荧光定量检测试剂盒测定血浆病毒载量.数据分析采用t检验.结果 HIV-1B'亚型感染者22例,其中CD4+细胞>0.2×109/L和CD4+细胞≤0.2×109/L各11例;所分离的病毒仅利用CCR5辅助受体,均为R5型毒株,感染性的结果显示,来自CD4+细胞≤0.2×109/L的11株R5毒株的感染性为(7.392 7±4.584 2)%,而CD4+细胞>0.2×109/L的为(2.613 6±1.610 5)%,差异有统计学意义(t=3.262,P<0.05);两组病毒复制滴度在第7天开始明显上升,培养第7、10、15天,两组病毒复制动力学差异有统计学意义(t值分别为3.771、2.509和2.260;P<0.05),CD4+细胞≤0.2×109/L的R5毒株的复制能力较CD4+细胞>0.2×109/L的明显增强;CD4+细胞≤0.2 × 109/L R5型毒株的病毒载量的对数值为(5.606 8±0.815 1)拷贝/mL,CD4+细胞>0.2 × 109/L的为(4.729 8±0.431 6)拷贝/mL,两组差异有统计学意义(t=3.771,P<0.05).结论 疾病进展过程中,即使病毒的辅助受体利用未从CCR5转变为CXCR4,但病毒的感染性和复制能力已有明显改变.     

胞内氯离子通道蛋白1基因沉默对小鼠肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响

目的 合成和筛选有效抑制细胞内氯离子通道蛋白1 (CLICl) 基因的shRNA序列,构建表达质粒,并进一步研究CLIC1基因的表达被抑制后小鼠肝癌细胞株Hca-F细胞增殖及侵袭能力的变化.方法 设计并合成3条理论上最佳的siRNA序列,进而将相应的双链DNA插入pGPU6/GFP/Neo质粒中,以脂质体Lipofectamine 2000将DNA质粒稳定转染至小鼠Hca-F细胞中,收取细胞进行逆转录多聚酶链反应分析各组的CLIC1 mRNA表达水平,选出最佳干扰序列.应用细胞计数试剂盒检测最佳干扰序列表达质粒稳定转染的Hca-F细胞,对比观察其干扰前后增殖情况的变化;应用transwell小室检测其侵袭能力的变化.对研究数据应用统计学软件SPSS13.0进行方差分析.结果 靶向CLIC1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致.经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.稳定转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒的Hca-F细胞对其CLIC 1 mRNA抑制效果明显,抑制率达42.4%.经该表达质粒的干扰后,Hca-F细胞的增殖能力明显增强,侵袭能力显著下降,空白对照组、无关序列处理组、shRNA干扰组的穿膜细胞个数分别为98.93±5.00、96.27±2.60、50.73±3.89,P值均<0.01.结论 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-3表达质粒能高效地抑制小鼠Hca-F细胞中CLIC1 mRNA的表达,CLIC1基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其侵袭的作用.     

α-胞衬蛋白-小干扰RNA真核表达载体的构建及其对原发性干燥综合征模型小鼠治疗作用的研究

目的 针对α胞衬蛋白(α-Fodrin)构建2段小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观察其对原发性干燥综合征模型小鼠(NOD小鼠)的治疗作用.方法 16只8周龄的NOD小鼠采用单纯随机抽样法分为4组,对照组、空载体组、α-胞衬蛋白-siRNA1组及α-胞衬蛋白-siRNA2组,每组4只.化学合成siRNA的模板DNA 4条,退火形成2条双链DNA(dsDNA),BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入线性化质粒载体pGFP-V-RS的启动子下游,重组体采用双酶切和测序鉴定.将测序鉴定成功的0.5 mg/kg siRNA真核表达载体分别尾静脉注射NOD小鼠,1次/周,共2次,对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),空载体组注射等剂量的空载体.组织切片在荧光显微镜下观察其是否靶向到泪腺,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NOD小鼠肺脏α-胞衬蛋白(mRNA)的表达,免疫组织化学法检测NOD小鼠泪腺和肺脏α-胞衬蛋白的表达水平.酶联免疫吸附(ELISA)法检测NOD小鼠血清中干扰素-γ和白细胞介素(IL)-17的表达水平;苏木精-伊红(HE)染色法观察各组小鼠泪腺和脏器的病理变化.统计学方法采用重复测量的方差分析.结果 ①成功构建2段siRNA真核表达载体;②α-胞衬蛋白-siRNA质粒载体靶向到泪腺;③α-胞衬蛋白-siRNA组与对照组和空载体组相比,α-胞衬蛋白mRNA和蛋白的表达明显降低;④α-胞衬蛋白-siRNA组[1组(4.38±1.02) pg/ml,2组(4.55±0.06) pg/ml]与对照组[(11.73±2.73) pg/ml]和空载体组[(15.40±1.99) pg/ml]相比,2次注射后小鼠血清中IL-17水平显著下降(P＜0.05),干扰素-γ水平无明显下降(P＞0.05);⑤α-胞衬蛋白-siRNA组与对照组和空载体组相比,小鼠泪腺淋巴细胞浸润减少,肺间质炎细胞浸润明显减少.结论 α-胞衬蛋白siRNA能抑制炎症反应,减轻NOD小鼠的泪腺和肺脏炎细胞浸润程度,从而抑制疾病的进展.     

化学合成siRNA体外对柯萨奇B3病毒的影响

目的RNA干扰是近年来研究基因功能的重要工具。本研究是在培养HELA细胞中，体外化学合成siRNA（small interfering RNA）对柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）的影响，探讨RNA干扰的抗病毒效应与其应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则，设计了一段针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA，并在体外通过化学合成形成siRNA。同时合成一段与CVB基因组序列无关的阴性对照siRNA。用CVB3感染培养HELA细胞，将其分为3组，即siRNA组（n=8），阴性siRNA组（n=8），病毒对照组（n=8），分别观察转染后第1天到第5天的细胞病变，并与未感染CVB3的空白对照组进行比较；采用RT-PCR技术检测感染CVB3各组的病毒RNA片断，观察病毒RNA与内参GAPDH的OD比值；用免疫荧光技术检测各组CVB3蛋白的表达。结果RT-PCR检测各组CVB3病毒5’端非编码区（5’UTR）RNA，siRNA组与阴性siRNA组和病毒对照组比较无明显变化（P〉0．05）；免疫荧光检测各组CVB3病毒蛋白也未见显著差异；细胞病理效应（cytophatic effects，CPE）各组问未见明显差异。结论本文选择针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA未能抑制CVB3病毒复制。     

YB-1基因沉默对肝癌细胞化学治疗敏感性的影响及可能机制

目的探讨沉默YB-1基因对肝癌细胞化学治疗敏感性的影响及可能机制。方法根据YB-1靶点序列设计YB-1基因siRNA干扰序列,与Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后的线性化pLKD-CMV-GPR-U6慢病毒载体连接及转化形成重组慢病毒;参照此方法设计并构建阴性对照重组慢病毒,并将其转染肝癌细胞SMMC-7721,分别命名为YB-1-siRNA组和NC-siRNA组,设置空白对照组(未经任何处理的肝癌细胞SMMC-7721),分别加入含顺铂(1μg/ml)和多柔比星(1μg/ml)的现配培养基。采用实时荧光定量PCR检测各组药物处理前后YB-1 mRNA表达水平;采用MTT法检测药物处理前后各组细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测药物处理前后各组细胞的凋亡情况,采用Western blot检测各组药物处理后PI3K、AKT和GSK-3β蛋白的表达。结果处理前后,YB-1-siRNA组、NC-siRNA组和空白对照组间YB-1 mRNA表达水平及细胞活力差异均有统计学意义(P 0.05),与处理前比较,处理后YB-1-siRNA组、NC-siRNA组和空白对照组YB-1 mRNA表达水平和细胞活力均显著下降(P 0.05)。处理前后,YB-1-siRNA组、NC-siRNA组和空白对照组间细胞凋亡率的差异有统计学意义(P 0.05);与处理前比较,处理后各组细胞凋亡率均显著升高(P 0.05)。经药物处理后,3组间PI3K、AKT和GSK-3β蛋白表达差异均有统计学意义(P 0.05)。结论靶向敲除YB-1基因联合化学治疗可显著增强抑制肝癌细胞增殖及促进其凋亡的能力,可能与PI3K/AKT/GSK3β信号转导通路有关。     

NM23B对大鼠肝细胞体外增殖的影响

目的观察NM23B在体外培养大鼠肝细胞增殖中的作用。方法构建NM23B过表达载体和干扰载体及其阴性对照载体,分别转染SD大鼠BRL-3A肝细胞,并设空白对照组(CON)、干扰NC组(siRNA-NC)、干扰组(siRNA)、过表达组(OE)、过表达NC组(OE-NC),通过定量PCR分析各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA变化;Western印迹分析比较各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA蛋白的变化;流式细胞仪检测各组细胞周期比例;用CCK 8法检测细胞增殖。结果 OE组Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著增多(P0.05);另一方面,siRNA组的Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著降低(P0.05),干扰NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P0.05)。OE组的G0/G1期细胞比例明显低于CON组(P0.05),siRNA组的G_0/G_1期细胞比例明显高于CON组(P0.05)。同时,OE组的S期细胞比例明显高于CON组(P0.05),siRNA组的S期细胞比例明显低于CON组(P0.05),siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P0.05)。CCK-8检测细胞增殖表明OE组的增殖速度明显快于CON组(P0.05),siRNA组的增殖速度明显慢于CON组(P0.05),siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P0.05)。结论过表达NM23B可以加强Cyclin D1、PCNA的表达,缩短细胞周期,从而促进肝细胞增殖;干扰NM23B表达则削弱了Cyclin D1、PCNA的表达,延长细胞周期,从而抑制肝细胞增殖。证实了NM23B在体外培养SD大鼠肝细胞增殖中的作用,为后续体内实验奠定了理论基础。     

RNA干扰抗A型H1N1流感病毒的研究

目的 制备靶向A型H1N1流感病毒RNA聚合酶(PA)基因的小干扰RNA(siRNA),研究其抑制病毒复制的效果.方法 设计并合成3对靶向A型H1N1流感病毒PA基因的siRNA,构建表达质粒pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537,分别转染MDCK细胞及鸡胚,并感染H1N1亚流感病毒,检测siRNA抑制流感病毒复制的效果.结果 设计的3对siRNA中,pS-PA1537可明显抑制A型H1N1流感病毒在MDCK细胞及鸡胚中的复制.结论 该研究为开发抗H1N1治疗制剂研究奠定了基础.     

慢病毒介导RNA干扰心房区心肌细胞Kir2.2基因对Kv2.1钾通道及内向整流钾电流的影响

目的探讨慢病毒介导RNA干扰心房区心肌细胞Kir2.2基因对Kv2.1钾通道及内向整流钾电流的影响。方法构建携带Kir2.2基因干扰RNA的慢病毒载体(pGCSIL-Kir2.2-siRNA),并转染大鼠心房区心肌细胞,采用荧光显微镜观察携带报告基因GFP的慢病毒载体(pGCSIL-GFP-siRNA)在心肌细胞的转染情况,根据实验设计分为三组:Control组(不行慢病毒转染)、Ad-siRNA-null组(仅行空慢病毒转染)和Ad-siRNA-Kir2.2组(行pGCSIL-Kir2.2-siRNA慢病毒转染)。分别采用RT-PCR和Western印迹检测三组的Kir2.2基因的mRNA及Kv2.1钾通道的蛋白水平,采用膜片钳技术记录RNA干扰前后的心肌细胞内向整流钾电流(IK1)的变化情况。结果 pGCSIL-GFP/Kir2.2-siRNA慢病毒载体构建成功,且pGCSIL-GFP-siRNA转染心房肌细胞后,超过80%的细胞均可检测GFP(MOI=50),载体可正确表达;RT-PCR显示干扰后的细胞Kir2.2基因表达受到明显抑制,Ad-siRNA-Kir2.2组的Kir2.2基因的mRNA和Kv2.1钾通道的蛋白水平均下降,与其余两组相比均有差异(P<0.05);与Control组相比,Ad-siRNA-Kir2.2组的IK1减弱,电流密度降低,且电流-电压曲线上移,内向电流(-100 mV)和外向电流(-60 mV)均降低。结论慢病毒介导RNA干扰心房区心肌细胞Kir2.2基因可降低Kv2.1钾通道的表达并抑制内向整流钾电流。     

SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达及其对细胞生长、凋亡的影响

目的 观察血清淀粉样蛋白A(SAA)在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达及其对细胞生长、凋亡的影响.方法 构建针对SAA基因的shRNA表达干扰载体,筛选出有效的小干扰RNA(siRNA)序列,利用siRNA技术和高表达载体分别沉默及过表达SAA,检测SAA表达对鼻咽癌CNE-2细胞的生长及凋亡的影响.结果 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482和pCD3.1(+)-SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中可有效地沉默及过表达SAA基因的mRNA和蛋白,且与对照组比较差异具有统计学意义(P均＜0.05);SAA增高可促进鼻咽癌CNE-2细胞生长,降低可促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡.结论 在SAA基因的shRNA表达干扰载体中,只有pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482可有效沉默SAA在鼻咽癌CNE-2细胞中的表达;SAA增高可促进鼻咽癌CNE-2细胞生长,SAA沉默可促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡.     

抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA设计、合成及活性鉴定

目的　设计、合成及筛选高效抗肝纤维化关键基因———结缔组织生长因子 (CTGF)的小分子干扰RNA(siRNA)。方法　应用RNA设计软件 ,模拟SD大鼠CTGFmRNA二级结构 ,设计并合成针对CTGFmRNA 483、885及946位点的三对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,转染肝星状细胞系 (HSCT6) ,以空白及转染非特异siRNA(与CTGFmRNA无同源性的 2 1ntsiRNA)作为对照 ,应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测HSCT6细胞CTGFmRNA表达。结果　与对照相比 ,转染siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA明显下调 ,在 5 0～ 2 0 0nmol/L范围 ,CTGFmRNA下调幅度呈浓度依赖性增加 ,以 483siRNA 2 0 0nmol/L最显著 ,转染非特异siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平无明显变化。转染 483siRNA的HSCT6细胞 2 4、48及 72hCTGFmRNA分别较对照下调 91%± 2 %、65 %± 3 % (t =78.82 ,3 7.5 3 ,P均 <0 .0 1)和 10 %± 7% (t =2 .5 5 ,P =0 .0 6) ,在 2 4～ 72h范围 ,CTGFmRNA下调幅度呈时间依赖性降低。结论　成功筛选到能高效阻抑CTGF表达的 483siRNA ,其有效阻抑时间约 72h ,有望通过介导CTGFmRNA剪切而抑制肝纤维化的发生与发展 ,可发展为新一代防治肝纤维化的核酸药物     

表面抗原插入突变乙型肝炎病毒免疫逃避株的生物功能学分析

目的 我们在121例血清HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染者中发现2例HBsAg编码区114-115位氨基酸插入突变,本研究分析了其中1种插入突变(NTT)对病毒生物学特性包括抗原性和复制能力的影响. 方法 利用生物信息学分析技术对发生插入突变的HBsAg的抗原性改变进行模拟分析,同时构建带有该插入突变的复制型质粒,体外表型研究突变株的抗原性和复制能力变化. 结果 HBsAg 114-115位氨基酸的插入突变对HBsAg的抗原性指数、亲水性、表面可能性和蛋白骨架柔韧区域均产生影响,导致抗HBsAg抗体对抗原亲和力降低,但病毒的复制能力无明显改变. 结论 HBsAg 114-115位的NTT氨基酸插入突变可导致病毒的免疫逃避,同时维持了病毒的正常复制能力.