野生型p53对SMMC-7721细胞中POLD1基因的影响

目的 探讨野生型p53基因表达对人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的影响.方法 设计并构建p53特异性小干扰shRNA绿色荧光真核表达质粒(p53-siRNA)和表达EGFP-p53融合蛋 白的p53绿色荧光真核增强表达质粒(pEGFP-p53),通过稳定转染,将表达pEGFP-p53重组质粒、p53-siR...     

人剪切修复基因XPD转染对人肝癌细胞SMMC-7721的生物学影响

目的 将人剪切修复基因XPD稳定转染人SMMC-7721肝癌细胞,观察转染后细胞内野生型p53、XPD、周期素依赖性蛋白激酶(CDK)7、c-myc等基因表达的变化以及对细胞生长的影响,探讨野生型XPD基因与p53、CDK7、c-myc的相互作用及细胞凋亡机制.方法 将表达绿色荧光蛋白并含有人类全长野生型XPD的pEGFP-N2-XPD重组体质粒稳定转染人SMMC-7721肝癌细胞中,选择培养基筛选单克隆稳定转染重组质粒的人SMMC-7721肝癌细胞(SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD)和稳定转染空载质粒的人SMMC-7721肝癌细胞(SMMC.7721-pEGFP-N2),并将人SMMC-7721肝癌细胞作为空白对照,利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westem blot法检测转染XPD基因后细胞内XPD、p53、CDK7、c-myc的表达量变化,并用细胞增殖力检测(MTT)法及流式细胞仪分别检测细胞增殖及凋亡和细胞周期变化.结果 ①免疫荧光显微镜下,SMMC.7721.pEGFP.N2.XPD和SMMC-7721-pEGFP-N2细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明pEGFP-N2-XPD重组质粒和pEGFP-N2空载质粒成功转染.②RT-PCR检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD中p53 mRNA、XPD mR-NA表达量与SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721相比均明显增高(P<0.01),CDK7 mRNA、c-myc mRNA在SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD的表达量比两对照组明显降低(P<0.01),而两对照组各个基因的表达没有明显差异(P>0.05).③Western blot检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞的p53、XPD蛋白表达最较两对照组升高(P<0.01),CDK7、c-myc的蛋白相对表达量比两对照组降低(P<0.01),两对照组差异没有统计学意义(P>0.05).④M1Tr检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD的细胞增殖力较对照组减弱(P<0.05),两对照组筹异没有统计学意义(P>0.05).⑤流式细胞仪检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞进入s期出现障碍,停滞在G1期的细胞增多.结论 将XPD成功稳定转染到人SMMC-7721肝癌细胞中,XPD、p53在转录和蛋白水平的表达明显升高,CDK7、c-myc表达明显降低,野生型XPD基因的过表达可能抑制CDK7、c-myc表达,改变细胞周期,并促进p53抑制肝癌细胞增长,促进细胞凋亡.     

反义RNA技术对抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因表达的研究

目的:应用反义RNA技术抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的表达,探索采用该技术干预肝癌的可行性。方法:制备人POLD1基因的反义RNA表达质粒,同时建立空白对照组与阴性对照组,由此将实验分为阴性对照组(转染空载体的SMMC-7721细胞)、空白对照组(肝癌细胞SMMC-7721)和实验组(转染人POLD1基因反义RNA表达质粒的肝癌SMMC-7721细胞)3组。MTT实验分析细胞增殖变化,并在转染SMMC-7721细胞48h后,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测POLD1基因的表达。结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,转染了反义RNA的实验组细胞增殖受到明显抑制。在转染后24～72h,实验组吸光度24h为0.306 7±0.015 4,48h为0.459 2±0.033 2,72h为0.567 1±0.061 1,与空白和阴性对照组相比,P值均<0.05。实时荧光定量PCR实验显示,实验组POLD1的mRNA表达明显下调为0.142 5±0.020 5,阴性对照组为1.017±0.188,空白对照组为1.00±0.00(F=26.5,P<0.05),说明POLD1基因表达受抑制。蛋白质印迹实验显示,POLD1基因蛋白水平(p125)变化趋势与mRNA相同,均为下调,其中实验组为0.222 3±0.009 7,阴性对照组为0.237 9±0.005 9,空白对照组为0.235 4±0.003 4(F=1 365.754,P值均<0.05),说明反义RNA可抑制p125蛋白表达,结论与基因水平趋势一致。结论:针对POLD1基因设计的反义RNA体外抑制了肝癌细胞SMMC-7721的增殖,这与POLD1在基因和蛋白水平的表达下调有关。     

人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长的抑制作用

目的探讨野生型人剪切修复基因着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D,XPD)对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响,并探讨其机制。方法用脂质体转染法瞬时转染SMMC-7721细胞,转染重组质粒XPD-N2和空载质粒N2,并用未转染的与XPD-N2、N2具有相同遗传背景和代数的SMMC-721细胞作为空白对照。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot法检测细胞中XPD、c-myc、cdc25A、cdK2表达量变化,MTT法观察细胞增殖的活力。结果提取出的重组质粒pEGFP-N2-XPD用酶切鉴定,与Genebank上的相符。在荧光显微镜下,可以在SMMC-7721-pEGFP-N2、SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,质粒的转染效率为30%左右。流式细胞仪结果显示,pEGFP-N2-XPD重组质粒转染入细胞后,肝癌细胞进入S期发生阻滞,停滞在G1期。RT-PCR、Western blot检测发现SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞与SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721两对照组相比,其XPD 表达明显增高（P<0.05）。c-myc、cdc25A、cdK2相对表达量明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与两对照组相比,SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞增殖率明显减弱（P<0.05）。结论野生型XPD基因可以在转录和翻译水平抑制SMMC-7721细胞内c-myc、cdc25A、cdK2的表达。而且野生型XPD基因通过抑制cdK2的表达作用于S期DNA损伤检控点,从而抑制SMMC-7721细胞增殖。     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53cDNA真核细胞表达载体pEGFP-p53(RS)和pEGFP-p53(AS)。用Lipofectin介导转染801D细胞。PCR检测外源p53和neo基因，荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白，免疫组化染色检测突变蛋白表达。比较pEGFP-p53(AS)-801D和pEGFP-p53(RS)-801D的集落形成试验和裸鼠移植试验，用流式细胞术分析细胞周期。结果 PCR检测出外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，免疫组化检测示pEGFP-p53(AS)-801D突变蛋白呈阴性，母系为阳性，表明反义p53能封闭突变p53蛋白表达，pEGFP-p53（RS）-801D和pEGFP-p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤性均降低，pEGFP-p53(RS)-801D更为明显。pEGFP-p53(AS)-801D细胞周期阻滞于G1期。结论 在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要的作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可恢复重建其功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

原发性肝癌组织中KruPPel样因子6(KLF6)的表达及其对肝癌细胞增殖的抑制作用

目的了解Kruppel样因子6（KLF6）基因在原发性肝癌组织中的表达水平及其对肝癌细胞增殖的抑制作用。方法分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Wstern blot检测原发性肝癌及其癌旁组织KLF6 mRNA及蛋白质的表达水平。构建KLF6真核表达质粒并转染肝癌细胞SMMC-7721,流式细胞仪及MTT试验观察KLF6基因对细胞周期及细胞增殖活性的影响。以Western blot技术检测外源KLF6基因对p21WAF1表达的影响。结果与对应的癌周组织比较,23例原发性肝癌组织中8例（34.8%）KLF6 mRNA,9例（39.1%）KLF6蛋白质水平明显下降。与对照组比较,转染KLF6基因的SMMC-7721细胞G0~G1期所占细胞的比例明显增高,转染KLF6基因SMMC-7721的增殖率明显下降。外源KLF6基因能上调肝癌细胞p21WAF1表达。结论KLF6基因表达水平的下降可能在原发性肝癌发病机制中起到一定作用。上调p21WAF1表达是KLF6基因抑制肝癌细胞增殖的重要途径.     

腺病毒E1a基因增强P16基因诱导SMMC-7721肝癌细胞的凋亡

目的:研究腺病毒E1a基因与P16抑癌基因协同对肝癌SMMC-7721细胞凋亡和增殖的影响,探索肿瘤基因治疗新模式.方法:构建E1a基因真核表达质粒pDC315-E1a和携带P16的重组病毒AdCMV-P16,RT-PCR和免疫荧光标记法检测pDC315-E1a质粒转染或AdCMV-P16病毒感染后SMMC-7721细...     

过表达CHD5基因对肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响

目的:探讨过表达CHD5基因对人肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响。方法:采用脂质体法将CHD5过表达质粒及对照质粒分别转染SMMC-7721细胞,Western blotting检测SMMC-7721细胞中CHD5蛋白的表达情况,CCK-8法检测SMMC-7721细胞生长增殖能力的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:转染CHD5过表达质粒后,SMMC-7721细胞CHD5蛋白表达水平显著增高（P<0.01）,抑制了细胞增殖、迁移和侵袭（P<0.05）,促进了细胞凋亡（P<0.05）。结论:过表达CHD5基因可抑制SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭并诱导其凋亡。     

乙肝病毒x蛋白对肝癌细胞中PUMA表达的影响

目的:探讨乙肝病毒x蛋白（hepatitis B virus x protein,HBx）对肝癌细胞中PUMA表达的影响及其机制。方法:利用质粒转染技术对p53基因不同状态的肝癌细胞转染野生型HBx基因,用RT-PCR检测转染后肝癌细胞中HBx mRNA表达和荧光定量PCR检测NFκB mRNA表达,Western blot检测HBx、p53、NFκB、PUMA蛋白表达。结果:转染后随着HBx的表达,在p53野生型肝癌细胞BEL-7402和p53突变型肝癌细胞Huh-7中NFκB mRNA和蛋白上调而p53蛋白表达下降,BEL-7402细胞PUMA蛋白表达下降而Huh-7细胞中PUMA蛋白表达略有下降。加入NFκB抑制剂PDTC后并随着PDTC浓度逐渐增加,BEL-7402细胞NFκB蛋白表达逐渐下降而p53蛋白和PUMA蛋白表达逐渐上升;但在Huh-7细胞中随着NFκB蛋白表达的抑制,p53蛋白逐渐上升而PUMA蛋白上升不明显。结论:结果提示转染HBx基因可以抑制肝癌细胞中PUMA蛋白表达,在p53野生型肝癌细胞这种抑制可能与HBx通过NFκB 的激活有关。     

乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21WAF1表达的影响

背景与目的:研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒 X基因(HBx)对 p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚.本研究的目的是探讨 HBx对 p53下游基因 p21WAF1的影响.方法:通过正、反义野生型 p53(wtp53)与 HBx单转染及共转染人肝癌细胞株 SMMC-7721细胞,以及 HBx转染不同内源性 p53状态的肝癌细胞株,检测 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化 ,Western blot法比较 p53、p21WAF1表达水平的变化.结果:正、反义 wtp53与 HBx 单转染及共转染 SMMC-7721细胞 ,HBx与正义 wtp53共转染组(1.007± 0.098)与单转染正义 wtp53(0.490± 0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P< 0.05),其余各组 HBx均可导致 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P< 0.05).Western blot法表明 HBx可导致 p53的表达增加,但 p53表达较低的 SMMC-7721细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达减弱 ,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053± 0.010)也较对照组(0.094± 0.013)明显减少(P< 0.05),而 p53表达较强的 HepG2细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252± 0.052)较对照组明显升高(0.767± 0.031)(P< 0.05).细胞周期结果表明瞬时转染 HBx的 SMMC-7721和 Hep3B细胞停滞在 G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%)较对照组(47.10%、42.90%)减少,而瞬时转染 HBx的 HepG2细胞(63.62%)停滞在 G0-G1期的细胞数较对照组(57.42%)增加,但稳定筛选后 ,pcDNA3HBxHepG2细胞(57.31%)停滞在 G0-G1期细胞数较对照组(61.49%)减少.结论:HBx一方面可能引起 p53蛋白在细胞内积聚导致 p21WAF1表达升高,另一方面可直接抑制 p21WAF1启动子的转录活性.     

人肝癌SMMC-7721细胞中POLD1基因CDS突变的检测

目的检测人肝癌细胞株SMMC-7721中POLDl基因CDS的突变情况,以期从DNA复制最关键酶的编码基因POLDl的突变为干预细胞恶性增殖提供新的思路。方法设计人POLDl基因CDS特异性引物,以人肝癌细胞株SMMC．7721总RNA为模板进行RT—PCR扩增,将扩增产物纯化后加入“腺嘌呤”并与T载体连接,将连接产物进行测序,与数据库中的序列进行比对。结果成功扩增了人肝癌细胞中POLDl基因的CDS片段。SMMC．7721细胞中POLDl基因的CDS存在11个碱基替换,1个碱基缺失。结论人肝癌细胞SMMC-7721中POLDl基因的CDS发生了突变,进而导致其编码的氨基酸序列发生改变。     

雷公藤内酯醇下调P53基因甲基化抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖

目的:研究雷公藤内酯醇(triptolide,TP)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响以及对P53基因的去甲基化作用。方法:MTT法检测TP对SMMC-7721细胞增殖的影响,甲基特异性PCR检测TP对SMMC-7721细胞P53基因甲基化的影响,RT-PCR检测SMMC-7721细胞甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA的表达,Western blotting检测SMMC-7721细胞中P53蛋白的表达。结果:TP剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞的增殖(P<0.05),40 ng/ml时的抑制率达(73.5±3.02)%,其半数抑制浓度(IC50)约为20 ng/ml。TP显著抑制SMMC-7721细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA的表达(P<0.05,P<0.01);TP作用后P53基因的高甲基化被逆转,并呈剂量依赖性;TP可显著增强SMMC-7721细胞中P53蛋白的表达。结论:TP可通过抑制甲基转移酶使P53基因去甲基化,促进P53蛋白的表达,从而抑制SMMC-7721细胞的增殖。     

转录水平RNA干扰肝素酶基因对肝癌细胞侵袭能力的影响

目的 探讨转录水平基因沉默（TGS）技术和转录后水平基因沉默（PTGS）技术对肝素酶（HPA）基因干扰效果及其对肝癌SMCC-7721细胞侵袭能力的影响。方法 从HPA基因启动子区和编码区分别设计并合成TGS和PTGS的小干扰RNA（siRNA）,并转染肝癌细胞SMMC-7721;实时半定量PCR和Western blotting检测TGS和PTGS siRNA转染后48、72和96h HPA的表达,并设空白组作为对照;Transwell小室实验检测干扰后SMMC-7721细胞的侵袭能力。结果 TGS和PTGS两种技术在转染48h后,从mRNA和蛋白水平上均能成功干扰HPA表达;转染后72h,PTGS组HPA恢复表达,而TGS组仍保持沉默;转染后96h,两组HPA均恢复表达。Transwell小室实验表明,TGS和PTGS组HPA基因均能使SMCC-7721的穿膜细胞数减少,TGS组效果更明显。结论 TGS技术沉默肝癌SMMC-7721细胞中HPA基因的能力优于PTGS技术,并使肝癌细胞的侵袭能力显著降低。     

RNA干扰技术靶向hTERT基因治疗肝癌的实验研究

背景与目的：RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的新基因阻断技术,在基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。目前,利用RNAi已抑制了包括cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在内的多个内源基因的表达。同时在艾滋病、病毒性肝炎等的治疗研究中也已取得一定进展。但对肝癌等恶性肿瘤中高表达的hTERT基因,国内外还未见相关研究报道。本研究利用RNAi技术,在体内外抑制hTERT基因表达,探讨RNAi对肝癌治疗的可行性。方法：设计干扰hTERT基因的小片段RNA,构建重组表达质粒pTzu6 1-shRNA-hTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi,采用流式细胞检测技术、RT—PCR法、免疫组化等同时检测RNAi治疗组和对照组hTERT基因表达及细胞增殖变化,结果：体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6 1—shRNA—hTERT导入肝癌SMMC7721细胞株3～7天后,肝癌细胞生长抑制率达37．5％;细胞周期相分布发生显著变化,S期细胞明显减少,G1／G0期细胞显著增加;hTERT的mRNA表达由99．4％下调到53．1％,hTERT蛋白表达由86．3％下调到46．6％。裸鼠体内实验结果显示,质粒pTZu6 1-shRNA-hTERT注射裸鼠皮下移植瘤7天后,瘤体积明显缩小,hTERT的mRNA表达由99．1％下调到76．2％,hT．ERT蛋白表达由87．2％下调到61．8％。体内、外对照组各指标均无变化。结论：RNAi明显抑制了靶基因hTERT的表达及肝癌细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法。     

TSA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及其机制

目的:研究去乙酰化转移酶抑制剂TSA对肝癌细胞SMMC-7721的作用及其机理。方法:利用细胞计数,流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期,Tunel试验研究TSA对肝癌细胞SMMC-7721的作用;利用western研究TSA对肝癌细胞蛋白表达的影响。结果:TSA可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长,并可诱导细胞凋亡。可阻滞肝癌细胞SMMC-7721细胞周期于G0/G1期。可增加p53,p21,bax等基因的表达,降低BCL-2的表达。结论:去乙酰化转移酶抑制剂TSA可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长并诱导其凋亡,其主要通过调控一些肿瘤相关基因的表达起作用。     

The effect of NET-1 on the proliferation, migration and endocytosis of the SMMC-7721 HCC cell line

To explore the effect of NET-1 on the proliferation, migration and endocytosis in the hepatocellular carcinoma (HCC) cell line SMMC-7721, we constructed the pU6H1-NET-1-siRNA (NET-1siRNA) and pcDNA3.1/myc-NET-1 (myc-NET-1) vectors and transfected them into SMMC-7721 cells. The expression levels of NET-1 mRNA and protein were detected using real-time quantitative RT-QPCR and western blotting. The proliferation rates of SMMC-7721 cells were determined by CCK-8 assays, flow cytometry (FCM) and immunohistochemistry staining. The migration in two or three dimensional space of SMMC-7721 cells were determined by wound-healing assay and in vitro invasion assay. The extent of endocytosis in SMMC-7721 cells was estimated by observing the amount of transferrin (Tfn) absorbed with capture ELISA assays, and Tfn endocytosis was observed under confocal immunofluorescence microscopy. The results show that: i) after transfecting NET-1 siRNA, the expression of NET-1 mRNA and protein in SMMC-7721 cells decreased significantly, the growth of cells was suppressed, which induced cell cycle arrest, the proliferation rates were dramatically reduced and the expression of Ki67 declined, and migration and endocytosis in cells were inhibited, compared with untreated cells (every P<0.01); ii) Following transfection with myc-NET-1, the expression of NET-1 mRNA and protein in SMMC-7721 cells increased, and both the proliferation of cells and the cell cycle were promoted (P<0.01, respectively). However, the abilities of cell migration and endocytosis were not affected compared with untreated cells. These data suggest that: i) the NET-1 gene may play an important role in proliferation, migration and endocytosis of cells; ii) siRNA technology may efficiently suppress the expression and function of NET-1 in HCC, suggesting that NET-1 may be a therapeutic target for HCC.     

珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究

目的观察珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应并初探其分子机制。方法体外细胞培养采用人肝癌细胞株SMMC-7721,分为对照(BL)组、珠子参(PJ)组、二甲基亚砜(DMSO)组及5-FU组,采用电镜观察作用后肝癌细胞超微结构改变;流式细胞仪检测肝癌细胞周期和凋亡率;RT-PCR法检测癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、p21表达的变化。结果与对照组比较,电镜下珠子参组SMMC-7721细胞染色质浓缩,分解成大小不一有膜包绕团块,内含有新月形DNA物质及细胞器,形成凋亡小体;周期分析可见G0/G1期细胞阻滞,阻止了细胞向S期的转换,并引起细胞凋亡,凋亡率达38.34%;RT-PCR半定量分析珠子参能降低癌基因c-myc表达(P<0.05),增高抑癌基因p53和p21表达(P<0.05)。结论珠子参能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡,部分作用机制可能与阻滞细胞停留在G0/G1,降低癌基因c-myc和c-fos表达,增高抑癌基因p53和p21表达有关。