骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源,但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异,有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。方法：通过全骨髓贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察形态学特点,流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2,4,6,8,12周龄和10,12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1,2,3周,采用酶联免疫法检测骨钙素含量。结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性,CD45表达阴性,CD44部分表达;经成骨分化诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色阳性;经成软骨分化诱导,阿利辛蓝染色阳性,可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存存怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用.设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300 g 6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用.取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组.主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后.部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞旱节律性跳动,晕心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性.对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变.其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性.结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟.     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞:最佳诱导剂量筛选

背景:目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体.目的:观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的最佳浓度.方法:SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50 g/L 3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导.倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率.结果与结论:①原代细胞接种3 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列.②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性.③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25 g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高.提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25 g/L为最适诱导剂量.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

骨形态发生蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前研究者尝试使用各种细胞因子、中药单体和组织裂解液等诱导剂作用于其分化过程,用以修复梗死的心肌组织。目的:探索骨形态发生蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中的作用。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用含有骨形态发生蛋白2的培养基定向诱导培养(对照组为普通培养基培养)72h,其后换用普通培养基继续培养4周。结果与结论:初分离的细胞经纯化培养后,显示CD29阳性、CD34阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征,生长曲线显示各代细胞生长规律相近。经骨形态发生蛋白2体外诱导培养后,细胞形态狭长,排列紧密、方向一致。分化后的细胞均阳性表达C-TnI、C-TnT、desmin、α-sarcomericactin和P38MAPK。空白对照组则基本不表达以上蛋白。提示骨形态发生蛋白2可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌样细胞,是骨髓间充质干细胞体外心肌分化的一种新的有效诱导剂。     

静脉移植骨髓间充质干细胞联合重组人生长激素对充血性心肌病大鼠心肌和血管组织的修复

背景:骨髓间充质干细胞静脉移植后,能否归巢至心脏受损部位和分化为心肌样细胞尚无统一定论.目的:探讨重组人生长激素联合骨髓间充质干细胞静脉移植对充血性心肌病大鼠心肌和血管新生的影响.方法:密度梯度离心和贴壁筛选法获得大鼠骨髓间充质干细胞.模型组、细胞移植组、生长激素组、联合组大鼠均在阿霉素诱导下建立心脏衰竭模型.造模后,细胞移植组经静脉注入BrdU标记的骨髓间充质干细胞8×10~(13) L~(-1);生长激素组皮下注射重组人生长激素2 U/(kg·d),连续14 d;联合组行骨髓间充质干细胞移植与重组人生长激素注射.4周后取材,BrdU+MHC及BrdU+Actin免疫组化染色确定骨髓间充质干细胞的归巢情况,评价移植细胞向心肌样细胞和血管内皮细胞的分化,苏木精-伊红染色检测血管密度.结果与结论:与细胞移植组比较,联合组BrdU免疫组化阳性率显著升高(P < 0.001);BrdU+MHC双染和BrdU+Actin双染后心肌样细胞、血管内皮细胞均显著增多(P < 0.001).与模型组比较,生长激素组、细胞移植组、联合组的总血管密度、微血管密度、毛细血管密度均显著升高(P < 0.001),后3组间比较无明显差异(P > 0.05).结果证实骨髓间充质干细胞静脉移植后可归巢到心脏,对充血性心肌病大鼠心肌和血管有明显修复作用,能在损伤处区存活、生长,并向心肌样细胞、血管内皮细胞方向分化,增加损伤处血管密度;生长激素可以改善微环境,加强骨髓间充质干细胞向心肌样细胞、血管内皮细胞的转化率.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化:肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子的作用

背景:研究证实人骨髓间充质干细胞能够诱导分化为肝样细胞,但其具体生物学特性及分化机制尚不清楚,且诱导分化培养体系尚不成熟.目的:探讨肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性.方法:取食管癌手术患者肋骨,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法获取人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达.取第3代人骨髓间充质干细胞,分为4组,肝细胞生长因子组加入20 μg/L肝细胞生长因子,表皮细胞生长因子组加入20 μg/L表皮细胞生长因子,联合组同时加入上述两种生长因子,空白对照组不加任何生长因子.倒置显微镜下观察细胞形态的变化,诱导7,14 d RT-PCR检测甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达.结果与结论:入骨髓间质干细胞不表达造血细胞标志CD34,CD45,强表达β1-整合素CD29和基质受体CD44.肝细胞生长园子组、表皮细胞生长因子组、联合组诱导后,细胞形态由长梭形变为类圆形或多角形,诱导第7,14天甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阳性表达:空白对照组未见多角形细胞,甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阴性表达.证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力,至于二者联合是否能增强其分化能力尚待进一步免疫细胞化学染色定量分析予以验证.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景:目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少.目的:观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法:采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基.诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化.结果与结论:诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组(P < 0.01),诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性.结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

HGF联合5-aza诱导间充质干细胞心肌样分化实验探讨

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)联合5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向心肌样细胞分化的机制。方法 1采用全骨髓贴壁法培养BMMSCs,用流式细胞仪对阳性表面标记抗原CD44、CD29和阴性标记抗原CD34进行检测。2取第4代BMMSCs进行分组诱导,空白对照组(普通培养基)、5-aza组(10μmol/L)、HGF组(10 ng/ml)、5-aza+HGF组(10μmol/l+10 ng/ml)。各组BMMSCs诱导4周后,实时荧光定量PCR法检测各组α-actin、GATA-4相对表达量,免疫组化法鉴定肌钙蛋白T(cTnT)表达。结果 1大鼠BMMSCs体外培养形态特征及鉴定:细胞呈长梭形、同心圆状生长,形态逐渐趋向一致。CD44阳性表达率为(86.14)%,CD29阳性表达率为(98.97)%,CD34阳性表达率为(6.86%);2BMMSCs诱导4周后空白对照组细胞死亡,免疫组化显示3组均表达心肌特异性结构蛋白cTnT;实时荧光定量PCR显示3组均表达心肌分化早期基因,其中5-aza+HGF组明显高于其他两组。结论 1骨髓间充质干细胞经5-aza、HGF诱导后可以分化为心肌样细胞。2在骨髓间充质干细胞诱导为心肌样细胞的过程中,5-aza+HGF组优于5-aza及HGF组。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞（P〈0.01）。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

核受体相关因子1基因转染骨髓源性神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元的分化

背景:核受体相关因子1基因修饰是否促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化少见报道。目的:观察核受体相关因子1基因修饰骨髓源性神经干细胞在体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法:体外培养和纯化大鼠骨髓源性神经干细胞,将骨髓源性神经干细胞分为4组,将未转染的骨髓源性神经干细胞随机分为对照组,脑源性神经营养因子组;将筛选出的重组质粒转染阳性的神经干细胞分为核受体相关因子1组和核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组。结果与结论:RT-PCR显示转染的骨髓源性神经干细胞4d后核受体相关因子1高表达,分化结果显示:核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组细胞内酪氨酸羟化酶在mRNA水平上的表达量最高,神经干细胞贴壁分化后各组酪氨酸羟化酶阳性细胞比例均明显高于对照组,其中以核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组分化比例最高,为(52.44±15.9)%。提示核受体相关因子1基因修饰可促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化,并通过脑源性神经营养因子的诱导作用,在体外可获得大量的多巴胺能神经元。     

DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原的调节

背景：DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰。目的：观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响。方法：全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组化法鉴定骨髓间充质干细胞CD44和CD45蛋白的表达,MTT法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响,免疫组化法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原蛋白表达的影响。结果与结论：①第3代骨髓间充质干细胞不表达或低表达CD45,高表达CD44。②与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48h,6,12,24μmol/L组显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）,无浓度依赖性。③与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48h,6,12,24μmol/L组增殖细胞核抗原蛋白积分吸光度值显著增加（P〈0.05）,组间差异无显著性意义。结果显示在一定浓度范围内,5-杂氮胞苷发挥去甲基化作用,激活增殖细胞核抗原蛋白表达,从而促进骨髓间充质干细胞增殖。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景:自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在不同诱导条件下,骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞,如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-I是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。目的:观察胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。设计:开放性实验。单位:中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。材料:实验于2003-03/11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。方法:采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞,体外扩增,用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44,CD71,CD34,CD45表达;在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg/L胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液,采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。主要观察指标:通过检测细胞CD34,CD44,CD45的表达,进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。结果:①倒置显微镜观察结果:体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定:流式细胞仪结果显示细胞均一性较好,第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45,说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点。③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化:加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-I共培养,在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆,15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形,突起短,呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72.5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内,呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液共培养组培养15d后,细胞内蛋白多糖含量为(8.92±0.91)μg/L,高于单纯骨髓间充质干细胞培养组[(2.56±0.26)μg/L,P<0.05],但低于软骨细胞组[(13.69±1.51)μg/L,P<0.05]。结论:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：最新研究表明,P53可通过阻断P53-P21蛋白通路,显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路,抑制细胞增殖,导致细胞凋亡。目的：观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代,取第4代细胞分为4组,正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α＋5-氮杂胞苷组。结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示,诱导后4周时,可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43,其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组和5-氮杂胞苷＋PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示,诱导1周时,5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达;诱导4周时,5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡,促进其增殖,且能诱导其向心肌样细胞分化。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。     

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

骨髓间充质干细胞的增殖、分化及迁移等生物学特性受骨髓微环境的调节.肝细胞生长因子（HGF）是骨髓微环境分泌的主要因子之一,但它对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响并不清楚.本研究目的是观察重组人HGF对骨髓MSC生物学特性的影响.用免疫组织化学方法检测c-Met的表达,用MTT法测定细胞增殖,定量测定ALP的活性,进行细胞迁移分析和失巢凋亡（anoikis）诱导MSC凋亡分析.结果表明,重组人HGF不影响骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨细胞的分化,但可明显促进骨髓间充质干细胞的迁移并抑制anoikis诱导的细胞凋亡;PI-3K和MAPK途径参与了HGF促进细胞迁移的作用.结论：肝细胞生长因子通过受体c-Met影响骨髓间充质干细胞的生物学特性.     

DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞端粒酶反转录酶的调节

背景：DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰,对肿瘤细胞的端粒酶具有重要调节作用,而对骨髓间充质干细胞端粒酶活性有何影响尚不清楚。目的：观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及端粒酶反转录酶蛋白表达的影响。方法：全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞;按照下列分组加入5-杂氮胞苷,使各组5-杂氮胞苷终浓度分别为0,3,6,12,24μmol/L。加入5-杂氮胞苷后第1,2,3,5,7天进行指标检测。结果与结论：与对照组相比,5-杂氮胞苷干预24h,各浓度组均显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）;干预48h,6,12,24μmol/L组显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）;干预72h,12,24μmol/L组显著抑制细胞增殖活性（P〈0.05）;干预120,168h,对照组与各浓度组间差异均无显著性意义（P〉0.05）。5-杂氮胞苷干预48h,6,12,24μmol/L组端粒酶反转录酶蛋白IA值较对照组显著增加（P〈0.05）。提示在一定浓度范围及一定作用时间内,5-杂氮胞苷可以促进骨髓间充质干细胞增殖与端粒酶反转录酶蛋白的表达。     

四种诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：不同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化形成心肌样细胞功能学方面的研究未见报道。目的：观察5-氮杂胞苷、血管紧张素Ⅱ、骨形态发生蛋白2和P53特异性抑制剂对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为5组,即正常对照组,5-氮杂胞苷组、血管紧张素Ⅱ组、骨形态发生蛋白2组和P53特异性抑制剂组。采用流式细胞仪技术鉴定骨髓间充质干细胞表面特定抗原表达情况,Western blot法检测诱导4周后Cx43、肌钙蛋白Ⅰ表达情况,fluo3/AM钙离子探针激光共聚焦检测诱导4周后钙瞬变能力。结果与结论：骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD45的阳性表达率分别为89.1%,90.4%和1.9%。Western blot结果显示,各诱导组均有肌钙蛋白Ⅰ的表达,P53特异性抑制剂组较其余各组表达多（P〈0.05）,骨形态发生蛋白2组较其余各组表达少（P〈0.05）。Cx43蛋白在各组之间均有表达,正常对照组较各实验组明显较少（P〈0.05）,P53特异性抑制剂组较其余各组表达多（P〈0.05）,血管紧张素Ⅱ组较其余各组表达少（P〈0.05）。钙瞬变功能测定结果显示,荧光强度血管紧张素Ⅱ〉P53特异性抑制剂〉5氮杂胞苷〉骨形态发生蛋白2〉正常对照组（P〈0.01）。提示不同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞之后,各实验组均能向心肌样细胞分化,表达心肌特异性蛋白。而不同诱导剂发挥作用的通路不同,从而对诱导骨髓间充质干细胞分化形成心肌样细胞的功能产生不同影响。