Ⅱ型Waardenburg综合征患儿二例基因诊断分析

目的通过对2例中国云南地区Ⅱ型Waardenburg综合征(WS2)患儿相关基因突变位点的分析,探讨WS2可能的分子生物学致病原因。方法经知情同意,分别于2018年10月和2019年5月对2例WS2先证者及家系成员进行病史采集、体格检查、听力学评估及颞骨CT检查。获取外周血,提取基因组DNA, 高通量测序方法对MITF、PAX3、SOX10、SNAI2、END3、ENDRB、KITLG基因编码区的全部外显子及部分内含子和启动子进行检测,对先证者及其父母进行突变位点的Sanger测序验证分析。结果先证者1检测出MITF基因第7外显子c.641643delGAA突变,导致氨基酸改变p.214delR,为整码移码突变,患儿双亲MITF基因序列测序分析该位点无变异,此位点为自发突变。先证者2检测出MITF基因1~9号外显子大片段杂合缺失,影响蛋白质功能的正常发挥。结论基因诊断是确诊Waardenburg综合征的重要依据,MITF基因c.641643delGAA杂合突变和MITF基因1~9号外显子大片段杂合缺失可能是本研究2例WS2患儿的分子生物学致病原因。     

大鼠Atohl真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP的构建及转染293T细胞的研究

目的:利用基因工程方法克隆SD大鼠Atohl基因编码区序列,构建Atohl的真核表达载体pA-tohl-IRES2-EGFP,并验证其在293T细胞中的表达.方法:通过RT-PCR从SD大鼠结肠组织内扩增出Atohl基因全长CDS序列,并TA克隆于PMD-19T载体中.纯化回收的目的片段测序后连接于真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,构建pAtohl-IRES2-EGFP真核表达载体.再次测序后脂质体介导重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结果:测序后将扩增得到的大鼠Atohl CDS序列与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性,突变为无义突变,不影响蛋白表达.双酶切和测序结果证明Atohl已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒转染293T细胞24 h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达.结论:获得正确Atohl编码序列,真核表达载体pAtohl-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达,为进一步对感音神经性聋的基因治疗奠定了基础.     

大鼠核转录因子Atoh1的克隆表达及鉴定

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS区序列,构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞中表达。方法从两只SD大鼠结肠黏膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并亚克隆于PMD-19T载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠Atoh1 CDS区长1 056 bp,编码351个氨基酸,与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP),突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,荧光显微镜和Western blot证实Atoh1目的蛋白能在293T细胞中稳定表达。结论基因工程方法可成功克隆出Atoh1编码序列,真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达。     

Waardenburg综合征Ⅱ型一家系基因突变研究

目的研究Waardenburg Syndrome(瓦登伯格综合征)Ⅱ型一个家系病例的分子病因,丰富对Waardenburg综合征Ⅱ型(WS2型)的基因诊断及遗传咨询的认识。方法采集1个Waardenburg综合征Ⅱ型家系,问卷式调查留取临床资料,签署知情同意书获得先证者及一级亲属血样。提取血基因组DNA,聚合酶链反应扩增MITF、SNAI2、EDNRB、EDN3、SOX10、PAX3基因编码区全部外显子,在ABI自动测序仪上双向测序,利用GeneTool软件及生物信息学网站判读分析数据。结果在一个Waardenburg综合征Ⅱ型家系中未找到已知WS2型相关基因MITF、SNAI2、EDNRB、EDN3、SOX10、PAX3的病理性突变。结论 Waardenburg综合征Ⅱ型还存在新的致病基因,下一步需要利用全外显子组测序技术对本家系进行致病基因的研究。     

大鼠Atoh1真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP的构建及转染293T细胞的研究

目的:利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因编码区序列,构建Atoh1的真核表达载体pA-toh1-IRES2-EGFP,并验证其在293T细胞中的表达。方法:通过RT-PCR从SD大鼠结肠组织内扩增出Atoh1基因全长CDS序列,并TA克隆于PMD-19T载体中。纯化回收的目的片段测序后连接于真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,构建pAtoh1-IRES2-EGFP真核表达载体。再次测序后脂质体介导重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:测序后将扩增得到的大鼠Atoh1CDS序列与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性,突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒转染293T细胞24h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达。结论:获得正确Atoh1编码序列,真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达,为进一步对感音神经性聋的基因治疗奠定了基础。     

新型PAX3基因突变导致Waardenburg I型综合征

报道一个Waardenburg I型综合征(waardenburg syndrome, WS)家系的新型PAX3突变。通过全基因组测序的方法检测家系各成员的基因突变，结合遗传谱系分析研究其遗传特点。该WS I型家系共有3代11位成员，结合临床诊断标准，先证者及其母亲确诊为WS I，结合基因组测序结果，两位患者以及先证者的外祖母存在PAX3基因c.358Ggt;T突变，该突变为PAX3基因的新型突变，预测其可导致120Glu无义突变为终止子，从而致病。该WS I家系存在一新型的PAX3突变，有一定的遗传指导意义。     

SOX10基因新突变导致一Waardenburg综合征2型家系的分析

目的 通过对WS2的临床分析和候选基因的突变检测,加深对WS2的认识,并探讨Waardenburg综合征2型的分子遗传学特征.方法 收集一就诊于湘雅医院耳鼻咽喉科门诊的湖南家系,做出临床诊断,签署知情同意书获取血样.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增MITF、SNA12、SOX10基因编码区的全部外显子,扩增的PCR产物酶切后在ABI3100自动测序仪上进行正反向直接测序分析,利用GeneTool软件及遗传学网站的信息分析数据.结果 (1)2位患者诊断为WS2;(2)先证者及先证者母亲的SOXIO基因的编码区找到了一个国内外未曾报道过的杂合子新突变(c.113delG,p.Gly38AlafsX71),在家系中其他成员和100名家系外健康对照者中均未发现此突变.MITF和SNA12基因突变检测均正常.结论 (1)本研究对Waardenburg综合征Ⅱ型一家系进行了临床特征和基因突变分析,有助于对该综合征的进一步认识;(2)所发现的SOX10基冈(c.113delG.p.Gly38AlafsX71)国内外尚未见报道,属新突变,不仅丰富了人类基因突变数据库,而且为更好地了解该基因的功能提供了新的线索;(3)WS2患者在做基因筛查时SOX1O和MITF要作为候选基因.     

Waardenburg综合征II型中国家系MITF基因突变分析

目的探讨Waardenburg综合征II型中国家系的临床和分子遗传学特征。方法收集两个Waardenburg综合征II型中国家系详细的临床资料并绘制家系图谱,签署知情同意书获取血样。聚合酶链反应扩增MITF基因编码区的全部外显子,在ABI3100自动测序仪上进行正反向测序,利用GeneTool软件及遗传学网站的信息分析数据。结果Waardenburg综合征II型临床表现变异较大,不是所有的患者均满足Waardenburg综合征II型的诊断标准,眼睛色素分布异常(蓝虹膜)和正常的内眦间距是临床上最常见的表型特征。MITF基因第1、7号外显子在两个家系中分别检测到一个错义突变和一个缺失突变,50例正常对照组均未检测到这两种突变。结论本文对两个Waardenburg综合征II型家系做出分子水平的基因诊断,其详细的临床资料有助于对该综合征的进一步认识;新的基因突变位点不仅丰富了人类基因突变数据库,而且为更好地了解MITF基因的功能提供了新的线索。     

STAT3在喉癌中的表达特征及其与Survivin表达的关系

目的探讨信号传导与转录激活因子3（STAT3）在喉癌中的表达特征及其与Survivin表达的关系。方法采用免疫组织化学方法检测40例喉鳞状细胞癌组织和12例喉正常黏膜组织中STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白和Survivin蛋白的表达;运用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）检测上述组织中STAT3 mRNA和Survivin mRNA的表达。结合病例资料进行统计学处理,采用χ2、t检验。结果喉癌组织中STAT3、p-STAT3和Survivin蛋白及STAT3 mRNA和Survivin mRNA的阳性表达率均明显高于正常喉黏膜（P＜0.01）; STAT3、p-STAT3蛋白和STAT3 mRNA在喉癌中的表达均与喉癌的临床分期相关（分别为P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）;Survivin蛋白和 Survivin mRNA在喉癌中的表达与临床分期及淋巴结转移相关（P＜0.01,P＜0.01）STAT3和Survivin的表达呈正相关。结论STAT3的过量表达可能在喉癌的发生、发展中起重要作用,它的异常激活也可能通过上调Survivin基因的表达,延长喉癌细胞生存时间。     

Livin在脑胶质瘤中的表达及意义

目的探讨Livin mRNA和Livin蛋白在脑胶质瘤中的表达及意义。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法分别检测30例脑胶质瘤组织中Livinα、Livinβ的表达,分析其表达与胶质瘤临床病理特征的关系。结果30例胶质瘤组织标本中均可检测到Livin mRNA的表达,且Livin mRNA和Livin蛋白的表达明显高于正常脑组织,差异有统计学意义(P=0.008);Livin mRNA和Livin蛋白表达水平具有相关性(R=8.321,P=0.015)。且与胶质瘤细胞的分化程度、瘤周脑水肿密切相关。结论livin基因的表达水平上调与胶质瘤的发生发展密切相关。     

E-选择素在鼻息肉中的分泌与表达

目的:检测黏附分子E选择素在鼻息肉中的分泌水平与表达部位,借以探讨其与鼻息肉可能的病理机制的相关性。方法:采用酶联免疫吸附测定法检测25例鼻息肉(鼻息肉组)组织匀浆中E选择素水平,以9例鼻中隔手术患者之代偿肥大的下鼻甲后端黏膜作为对照(对照组);同时对上述标本进行苏木精伊红染色及E选择素免疫组织化学染色,观察其表达情况。结果:鼻息肉组大量嗜酸粒细胞浸润。E选择素浓度为(42.58±13.52)μg/L,对照组为(11.35±3.17)μg/L,差异有统计学意义(P<0.01)。E选择素主要表达于血管内皮、腺体上皮、间质和浸润炎症细胞上。鼻息肉组腺体上皮阳性表达率为92.0%,对照组为55.6%,差异有统计学意义(P<0.05)。鼻息肉组在血管内皮上阳性表达率为84.0%,对照组为44.4%;鼻息肉组在间质及浸润炎症细胞阳性表达率为92.0%,对照组为33.3%,差异均有统计学意义。Spearman相关性分析E选择素在血管内皮上的表达和在间质及浸润炎症细胞上的表达呈正相关(r=0.544,P<0.01)。结论:高表达的E选择素可能通过参与嗜酸粒细胞等炎症细胞的浸润、活化、增殖,从而在鼻息肉的形成过程中起重要作用。     

Gli1蛋白在喉癌组织中的表达与临床病理因素及PCNA表达之间的关系

目的探讨神经胶质瘤致病基因1(Glioma-associated oncogene homolog 1,Gli1)蛋白在喉癌组织中的表达与喉癌临床病理因素及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达之间的关系,为喉癌的诊断和治疗提供新思路。方法采用免疫组化法检测Gli1蛋白和PCNA在40例喉癌组织中的表达情况,对Gli1蛋白在喉癌组织中的表达与临床病理因素及PCNA表达之间的关系进行统计学分析。结果Gli 1蛋白在喉癌组织中表达阳性率为1 0 0%。其表达与喉癌患者年龄(P=0.5 7 2)、性别(P=0.8 3 7)、肿瘤生长部位(P=0.9 4 7)、肿瘤T分级(P=0.5 6 0)无相关性。而与病理分级(P=0.000)、有无淋巴结转移(P=0.001)有关。PCNA在喉癌组织中呈巢状、局灶状或呈片状分布,相关分析显示Gli1蛋白的表达与PCNA阳性表达呈明显正相关。结论 Gli1蛋白通过促进肿瘤增殖活性,在喉鳞癌发生、发展中有重要作用。     

VEGF-C真核表达载体的构建和体外表达

目的构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达载体,检测其在真核细胞CHO中的表达.方法根据人VEGF-C cDNA的序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF-C基因的cDNA,回收PCR产物连接于克隆载体.扩增,质粒提取,酶切鉴定并进行基因序列鉴定.酶切回收VEGF-C cDNA全长的基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接称重组质粒进行酶切鉴定.采用脂质体转染法将构建的pcDNA3.1(-)/VEGF-C转染至CHO细胞中,G418加压筛选培养.最后用Western-blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白.结果基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长.重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-C cDNA全长序列,Western-blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在.结论成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达.     

野生型SLC26A4基因表达载体的构建及在HEK 293细胞中的表达

目的构建含有野生型SLC26A4基因和绿色荧光蛋白基因(pEGFP,enhanced green fluorescent protein)的真核共表达载体,为指导临床SLC26A4相关耳聋的基因诊断及产前诊断奠定实验基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切及基因测序方法,构建并鉴定pEGFP-SLC26A4真核表达质粒。经脂质体介导转染HEK293细胞系,荧光显微镜下观察pEGFP-SLC26A4真核表达质粒在HEK293细胞系中的表达,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测SLC26A4mRNA的表达,利用Western Blot(蛋白印迹)方法检测Pendrin的表达。结果阳性重组子经酶切鉴定含有SLC26A4基因片段,基因测序结果与GenBank中SLC26A4序列相同。重组pEGFP-SLC26A4真核表达质粒转入HEK293细胞系后24小时,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR能够扩增出SLC26A4的条带,Western Blot检测出87kDa大小的蛋白。结论本文成功地构建了含有人全长SLC26A4基因和pEGFP基因的真核共表达载体,且能在哺乳动物HEK293细胞系中表达。     

Bcl-x_l和Bcl-2在鼻息肉组织嗜酸粒细胞中的表达

目的　探讨B细胞淋巴瘤 白血病 2 (B celllymphoma leukemia 2 ,Bcl 2 )基因及B细胞淋巴瘤 白血病 x基因长片段 (B celllymphoma leukemia xlong ,Bcl xl)在鼻息肉组织嗜酸性粒细胞中的蛋白表达及鼻腔应用二丙酸倍氯米松 (biclomethasonedipropionate,Bdp)对其表达的影响。方法　采用May Gr櫣ｎｗａｌｄ Giemsa(MGG)染色和免疫组织化学染色 ,观察比较经Bdp治疗 10～ 12周鼻息肉组织 (2 5例 )和未治疗鼻息肉组织 (2 7例 )中嗜酸粒细胞的浸润状态和对Bcl xl,Bcl 2蛋白的表达。结果　①治疗组鼻息肉组织中嗜酸粒细胞的浸润程度弱于未治组 ,两者间差异有显著性意义 (P <0 .0 1) ;② 5 2例鼻息肉组织均无Bcl 2蛋白的表达 ;③治疗组Bcl xl 表达率为 2 0 .0 % ,未治组表达率为 48.1% ,2组的表达率差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。结论　Bcl xl 可能在鼻息肉组织嗜酸粒细胞凋亡中发挥抗凋亡作用 ,糖皮质激素可能通过抑制Bcl xl的表达而发挥其凋亡诱导作用     

CK13基因5′旁侧活性与其组织特异性表达的相关性研究

目的 检测CK13基因′旁侧在不同细胞中的报告基因活性，探讨CK13基因组织特异性表达及上皮性肿瘤中异常表达与CK13基因′旁侧活性的关系。方法 采用报告基因分析的方法，构建CK13基因′旁侧帝侧413bp与氯霉素乙酰转移酶报告基因载体pCAT－Enhancer的重组体，并通过脂质体介导的转染技术导入不同细胞，检测该重组体报告基因的瞬间表达，探讨CK13基因′旁侧报告基因枯不同细胞中的活性。同时采用Northern-blot的方法检测这些细胞中CK13基因的表达情况，探讨CK13基因组织特异性表达与其5′旁侧活性的关系。结果 不同类型细胞中的CK13基因′旁侧报告基因活性不一，报告基因活性很低的细胞不表达CK13基因，报告基因活性很强的细胞明显表达CK13基因。结论 CK13基因组织特异性表达及上皮性肿瘤中异常表达与CK13基因′旁侧活性明显相关。     

喉癌肿瘤标记物的筛选及其表达变化

目的:用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术建立喉癌患者血清蛋白质组构型,并筛选出相对特异标记物.方法:收集32例喉癌患者术前、15例喉癌患者术后10 d及40例正常人的血清,用固定金属亲和表面蛋白质芯片(IMAC-Cu)和SELDI-TOF-MS技术检测蛋白质谱的表达.获得的蛋白质谱采用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析.结果:通过对喉癌患者术前、术后10 d与正常人血清蛋白质谱分析发现,共有26个蛋白质的表达量有明显差异.并获得平均相对分子质量分别为4 048.09、5073.79、5 339.29、3795.38、9 187.24、15 323.8、6 111.92、6943.87这8个蛋白质组成的模板,可将喉癌术前、术后及对照组正确分组.其正确分组率分别为71.88%(23/32)、66.67%(10/15)、75%(30/40).结论:SELDI-TOF-MS技术是一种快速、简便易行且高通量的分析方法,能直接筛选出喉癌患者血清中相对特异的潜在标记物,且可能具有较好的临床应用前景.