蛋白激酶CK2β在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的 研究蛋白激酶CK2β在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,并探讨其表达与患者预后的关系。方法 收集2012年1月-2013年6月于郑州大学第一附属医院肝胆胰外科确诊的127例肝细胞癌患者癌组织及癌旁组织,采用免疫组化法检测其CK2β的表达,分析癌组织中CK2β表达强度与肝癌患者临床特征的关系。另收集本院2018年3-6月期间手术切除的20例肝细胞癌癌组织、癌旁组织、肝硬化组织、正常肝组织标本并提取蛋白和mRNA,运用Westen Blot和real-time PCR检测其CK2β表达情况。多组间均数比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Bonferroni检验,计数资料组间比较采用χ2检验。CK2β在肝细胞癌的表达差异与临床特征参数的关系采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验。生存分析采用Kaplan-Meier法,组间比较采用log-rank检验。结果 Westen Blot和real-time PCR结果证实CK2β在癌组织中表达率显著高于癌旁组织、肝硬化组织和正常肝组织(P值均0. 05);癌旁及肝硬化组织中CK2β表达无差异(P值均 0. 05),且均高于正常组织表达(P值均0. 05)。免疫组化染色结果发现127例肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织中CK2β阳性表达率分别为85. 8%和63. 0%,差异有统计学意义(P 0. 001)。肝癌组织中CK2β的表达分布在不同年龄(Z=-2. 277,P=0. 023)、肝硬化有无(Z=-2. 144,P=0. 032)、不同肿瘤大小(Z=-2. 289,P=0. 004)、不同Edmondson-Steiner病理分级(χ2=8. 210,P=0. 016)的肝细胞癌患者中差异均有统计学意义。Kaplan-Meier生存曲线发现,CK2β表达强阳性组术后生存期均明显低于中阳性组、弱阳性组及阴性组(P值均0. 001)。结论CK2β蛋白可能参与肝细胞癌的发生发展,其阳性表达与肝细胞癌患者预后有关。     

特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的研究特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞系SK-hep-1迁移侵袭能力的影响。方法 Real-time PCR和Western Blot检测人肝癌细胞株和人正常肝细胞HL7702中LKB1表达情况。设计并合成LKB1特异性双链小干扰RNA(LKB1-siRNA),转染到高表达LKB1的人肝癌细胞株SK-hep-1中靶向沉默LKB1基因表达,并设置阴性对照组(NC组)。Real-time PCR和Western Blot检测LKB1基因的mRNA水平与蛋白表达水平的变化。利用CCK-8法检测肝癌细胞增殖能力。通过体外Transwell小室基质侵袭和迁移实验,观察LKB1表达沉默后对人肝癌细胞株SK-hep-1侵袭迁移能力的影响。计量资料两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果与正常人肝细胞HL7702相比,LKB1基因和蛋白在人肝癌细胞SK-hep-1中高表达(P值均0.05)。与NC组相比,siLKB1-1处理组SK-hep-1细胞中的LKB1基因和蛋白表达均明显降低(P值均0.05)。与NC组相比,siLKB1-1转染的SK-hep-1细胞增殖速度明显加快、侵袭和迁移能力明显增强(1.393±0.022 vs 1.128±0.032、147±19 vs 83±21、113±13 vs 75±17;t值分别为15.313、14.879、8.791;P值均0.001)。结论 LKB1有可能参与抑制肝癌增殖、侵袭迁移的过程并影响肝癌的预后。     

原发性肝癌组织中长链非编码RNA外泌体复合物7的表达及临床意义

目的探讨长链非编码RNA外泌体复合物7(LncRNA EXOC7)在原发性肝癌组织中的表达及临床意义。方法收集于宣城市中心医院2010年1月-2014年1月行肝癌手术患者的肝癌组织及其癌旁组织标本79对,采用real-time PCR分别检测肝癌组织和癌旁组织中LncRNA EXOC7的表达情况,分析其与病理特征和预后的关系。计量资料2组间比较采用t检验,计数资料2组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,术后患者的生存分析采用Kaplan-Meier方法,使用Cox模型分析影响预后的危险因素。结果 LncRNA EXOC7在肝癌组织中表达水平明显高于癌旁组织(6. 211±0. 637 vs 2. 924±0. 415,t=4. 106,P 0. 01)。肿瘤大小(χ2=5. 157,P=0. 023)、有无门静脉癌栓(χ2=4. 049,P=0. 044)、有无脏器转移(χ2=4. 345,P=0. 037)和TNM分期(χ2=6. 479,P=0. 011)在LncRNA EXOC7高表达和低表达组间差异均有统计学意义。LncRNA EXOC7高表达组的无瘤生存期(χ2=8. 215,P 0. 001)和总体生存期(χ2=6. 091,P=0. 001)较低表达组短。Cox回归分析显示LncRNA EXOC7表达、肿瘤大小、脏器转移和TNM分期是影响原发性肝癌预后的独立因素(P值均0. 05)。结论 LncRNA EXOC7参与调节原发性肝癌的发生发展,有望成为一种新的肝癌预后参考指标。     

小干扰RNA沉默巨噬细胞移动抑制因子基因对肝癌细胞p27表达的影响

目的 观察巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和细胞周期调控因子p27在肝细胞癌中表达的相互关系,探讨小干扰RNA(siRNA)沉默MIF基因对肝癌细胞p27表达的影响.方法 免疫组织化学法和荧光定量PCR法检测MIF、p27的蛋白和mRNA在肝癌及其癌旁组织中的表达情况.化学合成MIF siRNA和对照siRNA,脂质体法转染肝癌细胞PLC和Hep3B,荧光定量PCR法检测MIF和p27 mRNA在实验组及对照组中的表达情况.根据不同资料分别采用X2检验、Logistic回归分析或单因素方差分析.结果 MIF蛋白及其mRNA在肝癌组织中过表达,在癌旁组织中低表达;p27蛋白及其mRNA在癌组织中低表达,在癌旁组织中高表达.Logistic回归分析提示MIF为肝癌发生的危险因素,p27为保护因素.MIF mRNA在肝癌细胞株中过表达(F=61.036,P＜0.01),p27 mRNA在正常肝细胞L02中高表达(F=529.853,P＜0.01).经MIFsiRNA转染后,MIF mRNA在PLC及Hep3B中的表达水平降低,并且呈剂量依赖关系(F值分别为320.1和201.2,P值均＜0.01);p27 mRNA伴随MIF mRNA的降低而增加(F值分别为419.4和459.9,P值均＜0.01).结论 MIF在肝细胞癌中过表达,MIF siRNA能特异性抑制其在肝癌细胞中的表达;MIF可能参与了p27基因表达的调控.     

肝癌胰岛素样生长因子-Ⅱ表观遗传改变与其基因转录、表达的相关性分析

目的 分析胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅱ表观遗传改变与基因转录、表达间的相互关系.方法 以自身配对法收集肝癌的癌灶、癌周和远癌组织,以甲基化特异性PCR分析IGF-Ⅱ基因启动子P3的甲基化状态,以逆转录巢式PCR分析IGF-Ⅱ mRNA转录水平,以免疫组织化学法分析肝组织IGF-Ⅱ表达、胞内分布与临床病理学特征.对数据采用x 2检验、等级相关等分析. 结果 IGF-Ⅱ基因P3启动子甲基化率在肝癌组织为0,显著低于癌旁组织(47.5％,x2 - 24.918,P＜0.01)及远癌组织(100.0％,x2=80.000,P＜0.01).肝癌组织IGF-Ⅱ mRNA扩增阳性率为100.0％,明显高于癌旁组织(52.5％,x2=24.918,P＜0.01)和远癌组织(0,x2=80.000,P＜0.01);肝癌组织IGF-Ⅱ蛋白阳性表达率为82.5％,明显高于癌旁组织(45.0％,x2=12.170,P＜ 0.01)和远癌组织(0,x2=56.170,P＜0.01).癌组织IGF-Ⅱ过表达与其分化程度、浆膜浸润、瘤体大小和HBV感染相关.结论 基因表观遗传改变调控IGF-Ⅱ的转录和表达,与肝癌的发生、发展密切相关.     

Wnt诱导分泌型蛋白1:研究乙型肝炎诱发肝癌的新途径

目的 观察由乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)引起的HepG2细胞内Wnt诱导分泌型蛋白1 (WISP-1)的变化,探索HBV诱发肝癌的机制. 方法 收集肝癌、癌旁及正常肝组织标本,用免疫组织化学法检测标本中HBX和WISP-1的表达差异.设立2个实验组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(Gx)组和稳定转染空载体pc-DNA3.1(+)HepG2细胞(G0)组.同时用PCR和Western blot检测两组细胞中WISP-1的表达.计数资料样本率比较用x2检验;计量资料均数的比较用t检验和单因素方差分析;相关分析采用Spearman秩相关系数检验. 结果 肝癌组织中WISP-1的表达阳性率为76.6％,较癌旁组织的23.4％及正常肝组织的0明显增高,x2=35.967,P＜0.01,差异有统计学意义.Gx细胞中WISP-1 mRNA和蛋白的相对表达水平分别为1170.33±41.26、240.33±11.37,与G0细胞中WISP-1的mRNA和蛋白相对表达水平265.34±27.47,40.33±7.09比较;t=31.625,F=600.565,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.结论 WISP-1基因在肝癌中呈高表达,HBV感染肝细胞后,其HBX可通过上调WISP-1的表达水平引起肝癌的发生.     

葡萄糖调节蛋白78调控乙型肝炎相关性肝细胞癌患者线粒体生成蛋白的表达及临床分析

目的研究葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在乙型肝炎相关性肝细胞癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系,探索GRP78对肝癌细胞中线粒体生成相关蛋白分子的调控,为建立肝癌防治的新策略提供基础。方法收集乙型肝炎相关性肝细胞癌54例患者组织标本,用免疫组化和Western Blot检测肝癌及癌旁组织中GRP78、Lon、TFAM、COXⅣ的表达;用siRNA干涉肝癌细胞中GRP78的表达,检测细胞中GRP78、Lon、TFAM、COXⅣ的表达;用实时定量PCR(qRT-PCR)检测临床标本和干涉GRP78表达后肝癌细胞中线粒体DNA(mt DNA)的水平;对临床资料和实验数据进行统计分析。计量资料2组间比较比较采用t检验,计数资料2组间比较采用Fisher精确检验,患者生存分析采用Kaplan-Meier法。结果 GRP78及Lon在乙型肝炎相关性肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织(t值分别为9.135、5.523,P值均0.001),而线粒体生成相关蛋白TFAM、COXⅣ的表达及mt DNA水平显著低于癌旁组织(t值分别为2.765、4.260、12.280,P值分别为0.011、0.001、0.001)。干涉肝癌细胞中GRP78的表达,可显著提高线粒体生成相关蛋白TFAM、COXⅣ的表达及mt DNA水平(P值均0.05)。GRP78在不同肿瘤数量、门静脉癌栓以及肿瘤分期的病例中,表达水平存在显著差异(P值分别为0.016、0.003、0.045);GRP78低表达患者术后总生存期及无复发生存期优于GRP78高表达的患者(χ2值分别为5.006、4.995,P值分别为0.025、0.026)。结论 GRP78对线粒体维持与生成具有潜在的调控作用,对建立潜在的肝癌防治新策略具有重要的临床指导意义。     

microRNA-149-5p过表达对肝癌细胞HepG2和Bel-7402增殖及迁移的抑制作用

目的明确microRNA-149-5p(miR-149-5p)在肝癌组织中的表达,并探讨其在肝癌细胞中的分子生物学作用。方法收集2010年1月-2014年1月内蒙古医科大学附属医院通过肝切除术获得的65例肝癌组织及相应癌旁组织,采用荧光定量PCR检测65例肝癌组织及相应癌旁组织中miR-149-5p的表达情况。细胞实验分2组,实验组转染miR-149-5p模拟物,对照组转染模拟物阴性对照,采用噻唑蓝比色法和创伤愈合试验检测miR-149-5p对Hep G2和Bel-7402细胞增殖及迁移能力的影响。计量资料组间比较采用t检验或单因素方差分析。结果 miR-149-5p在肝癌组织的表达量(0.14±0.06)明显低于配对的癌旁组织(2.56±0.42),两者差异有统计学意义(t=7.79,P0.05);miR-149-5p在肝癌细胞Hep G2、Bel-7402和正常肝上皮细胞L02中的表达量分别为(1.43±0.25)、(1.77±0.32)和(5.68±0.74),3组间比较差异有统计学意义(F=11.27,P0.05)。体外功能实验发现,miR-149-5p模拟物可显著抑制Hep G2和Bel-7402细胞24、48、72 h时的增殖(Hep G2:t值分别为4.98、5.17、7.78,P值均0.05;Bel-7402:t值分别为6.83、7.09、15.67,P值均0.05),并降低Hep G2和Bel-7402细胞的迁移(t值分别为23.11、17.42,P值均0.05)。结论 miR-149-5p在肝癌组织中表达下调,过表达miR-149-5p可抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力,提示miR-149-5p可作为肝癌基因治疗的一个新的有效的分子靶标。     

D-双功能蛋白在肝癌组织中的表达及其与AFP和CA19-9的相关性

目的探讨D-双功能蛋白(DBP)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达情况,以及与肿瘤血清学标志物AFP、CA19-9表达的相关性,进而分析DBP对HCC早期诊断和预后判断的临床价值。方法选择唐山市妇幼保健院和唐山市人民院2015年6月-2017年5月行肝癌切除术并随访的20例患者作为试验组,同期两所医院的20例健康体检者作为对照组,应用化学发光法检测AFP、CA19-9的表达水平,免疫组化法检测肝癌组织和癌旁组织DBP的表达水平,用积分光密度值(IOD)进行测量。计量资料2组间比较采用t检验,检测指标相关性检验采用Pearson相关分析。结果肝癌组织DBP的IOD值(220. 52±101. 30)明显高于癌旁组织(40. 49±19. 32),差异具有统计学意义(t=-7.00,P 0.01)。且DBP与AFP(r2=0. 868,P 0. 01)和CA19-9(r2=0. 814,P 0. 01)的表达水平均呈正相关。结论 HCC患者DBP表达升高,与HCC的发生发展密切相关,为肝癌的诊断提供新的靶点。     

微小RNA-223及其标靶基因c-myc在肝癌发病中的作用

目的 探讨微小RNA-223(miR-223)对原癌基因c-myc的调控及其在肝癌发病中的作用.方法 通过实时定量聚合酶链反应和Western blot检测正常肝脏组织、癌旁组织、肝癌组织及肝癌HepG2细胞、胎肝L02细胞中miR-223和c-myc的mRNA和蛋白质表达水平.构建miR-223模拟物(mimics)上调肝癌细胞HepG2中miR-223表达后,实时定量聚合酶链反应和Western blot 检测HepG2细胞中c-myc表达水平的变化.分别用独立样本t检验和单因素方差分析进行两组及多组数据间的比较,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 miR-223在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.055±0.015、0.030±0.008和0.020±0.016,肝癌组织低于正常肝组织(t=-0.031,P＜0.05).miR-223在HepG2细胞中的表达较L02细胞下调(0.005±0.003比0.011±0.006,t=12.74,P＜0.01).c-myc mRNA在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.029±0.023、0.136±0.071和0.425±0.026,肝癌组织高于正常肝组织(t=-0.317,P＜0.05);c-myc蛋白在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.137±O.015、0.299±0.033和0.439±0.027,差异有统计学意义(F=103.35,P＜0.01).miR-223 mimics转染HepG2细胞后,c-myc蛋白在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为0.423±0.041、0.116±0.015和0.432±0.034,转染组较其他两组明显降低(F=94.93,P＜0.05).结论 miR-223在肝癌组织中表达下调,丧失其对c-myc表达的抑制而导致c-myc异常高表达可能是肝癌发生的重要机制.

Abstract：

Objective To investigate the regulatory role of microRNA-223 (miR-223) on c-myc and its role in hepatocarcinogenesis.Method miR-223 and c-myc mRNA expressions in normal tissue,paraneoplastic tissue,liver cancer tissue and liver cancer cells were tested with microRNA microarray and quantitative real-time PCR (qRT-PCR).C-myc protein expression was detected by Western blot.MiR-223mimic was transfected into HepG2 cells and the expression changes of c-myc mRNA and protein were tested with qRT-PCR and Western blot respectively.Results MiR-223 was down-regulated by 61.53% and 30.77% respectively in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues as compared to normal liver tissues and the expression of miR-223 was also decreased in HepG2 cell as compared to fetal liver cells L02,whereas the expressions of c-myc mRNA and protein increased in paraneoplastic and HCC tissues compared with normal liver tissues.It prompts that the expressions of miR-223 and c-myc are negatively correlated.No obvious difference found among c-myc mRNA expressions after miR-223 mimics transfection.Conclusions The cmyc abnormal high-expression may play a dynamic role in hepatocarcinogenesis due to the miR-223 downregulation.     

人蛋白酶体β亚基4型在肝细胞癌中的表达及与预后的关系

目的 探讨人蛋白酶体β亚基4型(PSMB4)在肝细胞癌(以下简称肝癌)组织及正常肝组织中的表达及其在临床预后中的意义。方法 收集2017年1月-10月在南通大学附属医院行手术治疗的8例肝癌组织及癌旁组织标本,应用Western Blot法检测肝癌组织及相应癌旁组织中PSMB4蛋白的表达情况。另收集2009年1月-2012年10月南通大学附属医院留存的105例肝癌组织和25例正常肝组织的石蜡包埋标本,应用免疫组化法进一步检测PSMB4的表达情况。根据PSMB4免疫组化结果差异将105例肝癌患者分为PSMB4高表达组(n=57)和PSMB4低表达组(n=48)。计量资料2组间比较采用独立样本t检验;计数资料2组间比较采用χ2检验。Cox风险回归模型分析2组患者临床病理特征及预后的关系,Kaplan-Meier生存曲线分析不同PSMB4水平患者的生存情况。结果 2组间HBV感染、肿瘤最大直径、肿瘤分化程度、TNM分期比较差异均有统计学意义(χ^2值分别为22.482、8.219、14.964、6.587,P值均<0.05)。105例肝癌患者中57例(54.29%)为PSMB4 高表达,48例(45.71%)为PSMB4低表达;而25例正常肝组织中8例(32%)为PSMB4高表达,17例(68%)为PSMB4低表达或不表达,2组表达情况比较差异有统计学意义(χ^2=4.011, P<0.05)。PSMB4染色主要分布于细胞浆和细胞核内,染色呈棕色及棕黄色颗粒样。8例新鲜肝癌及癌旁组织样本中有7例肝癌组织的PSMB4蛋白表达水平明显高于癌旁组织(P值均<0.05)。单因素分析显示患者的5年生存状态与肿瘤大小(P=0.01)、转移情况(P<0.001)、分化程度(P=0.01)、TNM分期(P=0.003)以及PSMB4表达水平(P<0.001)有关;多因素结果显示肿瘤转移[风险比(HR)=11.375,95%可信区间(95%CI):4.911~26.348)]和PSMB4高表达(HR=6.834,95%CI: 2.939~15.889)是肝癌患者的独立危险因素(P值均<0.001)。PSMB4高表达组患者5年生存率明显低于PSMB4低表达组(27.6% vs 79.2%, χ^2=22.96,P<0.05)。结论 PSMB4在肝癌组织中的表达增高,并且其高表达是肝癌患者预后的独立危险因素,PSMB4有可能作为肝癌预后的潜在标志及治疗的潜在靶点。     

健脾消积方水提物对人肝癌SMMC7721细胞自噬的调控机制

目的探讨健脾消积方水提物抗肝癌机制以及对细胞自噬流和自噬相关蛋白的影响。方法提取健脾消积方水提物,作用于SMMC7721细胞,使用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞学检测细胞的凋亡率,使用Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达,并监测自噬体的形成及自噬体与溶酶体的融合过程。计量资料两组比较采用独立样本t检验,多组比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 CCK8检测显示,细胞加药后24 h、48 h、72 h、96 h,增殖均受到了明显抑制,与对照组相比差异均有统计学意义(t值分别为28. 458、81. 093、85. 328、100. 158,P值均0. 001)。流式细胞学凋亡检测结果显示,加药组肝癌SMMC7721细胞凋亡较对照组显著增加(t=-42. 629,P 0. 001)。Western Blot结果显示,与对照组相比,加药组Beclin1蛋白表达下调,自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达上调,P62表达上调。加药组细胞的自噬体向自噬溶酶体的流动受到了阻滞,与对照组相比,差异有统计学意义(F=31. 155,P 0. 001)。结论健脾消积方水提物能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,促进细胞凋亡;同时能上调Beclin1的表达,下调LC3和P62的表达并阻滞自噬流的形成。     

核因子-κB p65在肝细胞癌中的表达及意义

目的利用肝癌组织芯片观察核因子-κB(NF-κB)p65在癌组织及癌旁组织中的表达,探讨其对肝癌发生、发展的意义。方法肝癌组织芯片(HLiv H180Su05)包括81例癌组织和81例癌旁组织,手术时间为2006年5月-2007年5月,随访截止时间为2012年2月,其中复发46例,无复发35例;参考美国癌症联合会胆囊癌TNM分期(第7版)分为:Ⅰ期56例,Ⅱ期25例;有癌栓28例,无癌栓53例。利用免疫组化法检测NF-κB P65蛋白的表达及相关性。依据所检测蛋白在细胞内的定位,分别以检测蛋白表达部位的阳性信号强度和阳性表达细胞数2种观察标准进行综合评分。计数资料组间比较采用χ2检验,采用Kaplan-Meier法进行生存分析,采用log-rank时序检验比较生存率。结果 NF-κB p65蛋白在癌组织及癌旁组织表达定位于细胞质及部分细胞核,在癌组织及癌旁组织阳性率分别为90.12%、69.14%,差异有统计学意义(χ2=10.998,P=0.001);癌组织中NF-κB p65蛋白表达与临床分期、癌栓、有无复发无明显相关性(P值均0.05)。结论 NF-κB p65在肝癌组织中的表达高于癌旁组织,调控NF-κB功能的关键在于抑制Rel A(p65)对肝肿瘤的促进作用。由此推测,阻断NF-κB p65活性能够发挥抑制肿瘤细胞分化、生长的作用,为临床治疗提供了新的思路。     

17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 13 inhibits the progression and recurrence of hepatocellular carcinoma

Background: Our previous study showed that 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 13(HSD17 B13) is down-regulated in hepatocellular carcinoma(HCC). But its function in HCC remains unknown. This study aimed to reveal the function of HSD17 B13 and its clinical significance in HCC.Methods: m RNA levels of HSD17 B13 were analyzed in cohort 1(30 normal, 30 HBV cirrhosis, 60 HBVrelated HCC and 60 peritumoral tissue) by real-time PCR. HSD17 B13 protein was evaluated in cohort 2(15 normal, 33 HBV-cirrhosis, 12 dysplastic nodules, 34 HBV-related HCC, and 9 metastatic HCC) using immunohistochemistry. The association between HSD17 B13 and the survival of HCC patients was analyzed in cohort 3(n = 88). The inhibitory mechanism of HSD17 B13 on HCC was explored.Results: The m RNA of HSD17 B13 and its protein expression were significantly down-regulated in HCC compared to non-tumor specimens(P 0.001). The sensitivity, specificity and area under curve(AUC)values of HSD17 B13 expression levels for HCC detection were 81.7%, 83.7% and 0.856, respectively(P 0.001). Lower HSD17 B13 in peritumoral tissue was an independent risk factor of worse recurrence free survival of HCC patients(HR: 0.41; 95% CI: 0.20–0.83; P = 0.014). The study in Huh 7 and SK-HEP-1 cells showed that HSD17 B13 induced an accumulation of cells in G1 phase and reduction of cells in S and G2 phases via up-regulating the expression of P21, P27 and MMP2.Conclusions: Lower HSD17 B13 in peritumoral tissues was associated with worse recurrence free survival and overall survival of HCC patients. HSD17 B13 delayed G1/S progression of HCC cells. HSD17 B13 may be a therapeutic target for the treatment of HCC.     

沉默减数分裂内切酶1(EME1)抑制肝癌细胞增殖的机制

目的 探讨减数分裂内切酶1(EME1)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法 筛选TCGA数据库肝癌样本中的差异表达基因。采用免疫组化和Western Blot分析EME1在肝癌组织中的表达丰度。通过短发夹RNA(shRNA)构建慢病毒并感染BEL-7404细胞干扰EME1基因表达,分为沉默组（shEME1）和对照组（shCtrl）。通过实时荧光定量PCR法和Western Blot检测两组EME1 mRNA和蛋白表达水平,Celigo计数法及MTT活性检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期,Caspase3/7活性检测细胞凋亡。两组间比较采用成组t检验。结果 TCGA结果显示EME1的mRNA表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的18.9倍（114.5±153.0 vs 8.0±7.2,t=5.00,P<0.001）;EME1的蛋白表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的7.0倍（免疫组化检测,8.4±2.6 vs 1.2±0.4,t=7.55,P<0.001）和2.5倍（Western Blot检测,249.0%±35.5%vs100.0%±77.8%,t=3.02,...     

亚低温通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路对肝缺血再灌注损伤大鼠模型的保护作用

目的探讨亚低温预处理肝缺血再灌注损伤(HIRI)大鼠模型的保护作用机理。方法将40只SD大鼠分为4组:假手术(Sham)组、HIRI组、亚低温处理(MH)组和MH+LY294002处理(MH+LY)组,每组10只,分别于肝缺血再灌注3、6、12、24 h后收集大鼠的血清及肝组织标本。采用Western Blot检测大鼠肝组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(p-Akt,Ser308)蛋白的表达水平。采用TUNEL法和Western Blot检测分析肝组织中细胞凋亡和凋亡相关蛋白的表达水平。采用ELISA试剂盒检测肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平。采用全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT、AST活性。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果 HIRI组p-PI3K、p-Akt的相对表达水平明显低于Sham组,差异均有统计学意义(q值分别为5. 217、5. 456,P值均0. 01);经亚低温处理后大鼠肝组织中p-PI3K、p-Akt的相对表达水平明显高于HIRI组,差异均有统计学意义(q值分别为10. 434、14. 116,P值均0. 01)。HIRI组、MH组和MH+LY组大鼠再灌注后3、6、12、24 h的血清AST、ALT活性明显高于Sham组,差异均有统计学意义(P值均0. 001)。TUNEL染色结果显示,HIRI组大鼠的细胞凋亡百分比[(42. 25±3. 50)%]明显高于Sham组[(3. 21±0. 5)%],差异均有统计学意义(q=10. 187,P 0. 01);相比于HIRI组,MH组明显下调了细胞凋亡百分比(12. 42±1. 3)%,差异有统计学意义(q=7. 784,P 0. 01),且HIRI组与MH+LY组的细胞凋亡百分比[(38. 19±2. 8)%]比较差异无统计学意义(q=1. 059,P 0. 05)。Western Blot检测结果显示,与Sham组相比,HIRI组中抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下调,差异有统计学意义(q=2. 101,P 0. 05),促凋亡蛋白Bax、fas和fasl表达明显上调,差异均有统计学意义(q值分别为11. 016、4. 735、10. 201,P值均0. 01),亚低温处理之后可明显下调HIRI对凋亡相关蛋白的调控作用。氧化指标检测结果显示,HIRI组、MH组和MH+LY组大鼠肝组织中SOD、GSH-Px的表达水平均明显低于Sham组,差异均有统计学意义(P值均0. 05),而MDA在HIRI组、MH组和MH+LY组大鼠肝组织中的表达水平均明显高于Sham组,差异均有统计学意义(P值均0. 05); MH组大鼠肝组织中SOD、GSH-Px的表达水平明显高于HIRI组,差异均有统计学意义(q值分别为2. 894、2. 731,P值均0. 05),但MDA的表达水平明显低于HIRI组,差异有统计学意义(q=5. 888,P 0. 05)。此外,亚低温+LY294002处理明显下调了MH组对肝组织中SOD、MDA和GSH-Px表达的调控作用,差异均有统计学意义(q值分别为2. 999、2. 944、2. 620,P值均0. 05)。结论亚低温对HIRI大鼠具有保护作用,其机制可能是通过激活PI3K/Akt通路发挥下调肝细胞凋亡和增强体内抗氧化作用。     

上皮间质转化标志物E-cadherin和Vimentin在原发性肝癌中的表达及其临床意义

目的 检测上皮间质转化(EMT)标志物E-cadherin和Vimentin在原发性肝癌及相邻正常组织中的蛋白表达水平,探讨E-adherin和Vimentin表达差异与肝癌转移相关性及预测临床预后意义. 方法 收集30例原发性肝癌患者肝癌组织及相邻正常组织,Western blot荧光发光法定量检测E-cadherin,Vimentin蛋白在肝癌组织及相邻正常组织的表达,分析二者的蛋白表达相互关系及其与临床病理特征的相关性;同时采用免疫组织化学法检测Twist,Vimentin,E-cadherin在肝癌组织及相邻正常组织中的表达.数据统计采用配对t检验,Mann-Whitney U检验,spearman等级相关分析.结果 E-cadherin蛋白在原发性肝癌中肝癌组织较相邻正常组织表达显著降低,相对表达量为0.082±0.063对比0.226±0.215,差异具有统计学意义,t=-4.050,P＜0.01;其在门静脉癌栓患者肝癌组织中表达较无门静脉癌栓者降低(P=0.001),其在TNMⅢ期患者肝癌组织中表达较TNM Ⅰ/Ⅱ期表达降低(P=0.003);Vimentin蛋白在原发性肝癌中癌组织表达较相邻正常组织表达增高(P=0.002),Vimentin蛋白表达与E-cadherin蛋白表达呈负相关(r=-0.509,P=0.004),Vimentin蛋白表达与门静脉癌栓(P＜0.01)、TNM分期(P＜0.01)、Milan标准(P=0.005)存在相关性;免疫组织化学结果显示E-cadherin在癌组织中几乎不表达,在相邻正常组织细胞膜上高表达,Vimentin和Twist均在肝癌组织细胞中高表达,而在相邻正常组织不表达.结论 EMT标志物E-cadherin和Vimentin蛋白在原发性肝癌中的表达与患者门静脉癌栓、TNM分期等临床特征密切相关,E-cadherin和Vimentin可作为预测肝癌转移复发及评估临床预后的有效指标.     

HGF/cMet系统与肝癌细胞侵袭转移关系的实验研究

目的探讨HGF/cMet基因表达与肝癌细胞侵袭转移能力的关系.方法采用荧光定量PCR和Western Blot检测5株肝癌细胞系MHCC-1、HepG2、Huh7、SMCC-7721、Hep3B和永生化肝细胞株L02以及26份肝组织中cMet mRNA和蛋白质表达水平,同时采用免疫组化法检测26份肝组织中cMet蛋白质的表达.结果6株肝癌细胞cMet mRNA分别为7.9×106,3.4×106,2.1×106,6.5×105,3.8×105和5.8×103(copies/ml),5株肝癌细胞系cMet mRNA显著高于L02细胞系(P＜0.01),其中以转移能力较强的MHCC-1细胞系的cMet mRNA表达量最高;肝癌组织、癌旁组织及周围正常组织的cMet RNA分别为2.28×107、6.80×105、5.68×105,肝癌组织的cMet基因表达明显高于癌旁及周围正常组织(P＜0.01);在肝癌组织中,T1、T2、T3/T4期及NO、N1/N2的cMet mRNA分别为4.88×104、6.98×105、1.72×106、4.67×105、8.73×105,cMet的表达与肿瘤的大小及其侵袭能力明显正相关;Western Blot和免疫组化也显示不同肝细胞系蛋白质表达水平与cMet mRNA表达一致.结论HGF/cMet系统参与了肝癌的形成,并且在肝癌细胞的侵袭和转移的过程中起重要作用.     

肝细胞癌中microRNA-888基因家族的表达特征及临床意义

目的初步探讨microRNA-888(miRNA-888)基因家族成员在肝细胞癌中的表达特征及其意义。方法选取湖南中医药大学第一附属医院在2012年1月-2017年12月病理确诊为肝细胞癌的患者72例,另收集72例健康自愿者的肝组织作为正常对照组。运用实时定量PCR和原位杂交分析肝癌组织中miRNA-888家族中miRNA-888、miRNA-891a、miRNA-891b、miRNA-892a和miRNA-892b的表达情况,初步探讨miRNA-888、miRNA-891b和miRNA-892a的表达与肝癌临床病理特征的关系。计量资料2组间比较采用t检验;计数资料组间比较采用χ2检验。结果 miRNA-888、miRNA-891b、miRNA-892a在肝癌组织中的表达明显高于正常肝组织(2. 53±0. 75 vs 0. 46±0. 08,t=14. 02,P 0. 001; 2. 26±0. 38 vs 1. 19±0. 21,t=7. 75,P 0. 001; 5. 44±1. 01 vs 1. 06±0. 30,t=35. 27,P 0. 001);原位杂交分析进一步验证了miRNA-888、miRNA-891b和miRNA-892a 3种miRNAs主要表达定位于肝癌组织中的细胞核,与正常肝组织表达水平比较差异均有统计学意义(3. 91±0. 92 vs 1. 21±0. 42,t=22. 65,P 0. 001; 2. 92±0. 76 vs 0. 83±0. 21,t=22. 92,P 0. 001; 3. 81±0. 99 vs 1. 30±0. 32,t=20. 47,P 0. 001)。miRNA-888和miRNA-891b高表达在组织学分级和临床分期的比较中差异有统计学意义(χ2值分别为6. 25、4. 44、4. 76、6. 05,P值均0. 05),而miRNA-892a高表达在Ⅲ、Ⅳ期肿瘤中表达更明显(χ2=8. 50,P 0. 001)。结论 miRNA-888、miRNA-891b及miRNA-892a在肝癌组织中表达明显增加; miRNA-888,miRNA-891b和miRNA-892a表达升高与肝癌恶性程度更高密切相关。     

肝细胞癌变过程中核因子-κB及其基因的动态表达与定量分析

目的 观察肝癌形成过程中核因子-κB(NF-κB)及NF-κB mRNA动态表达与作用机制.方法 雄性SD大鼠以2-乙酰氨基芴制备肝癌模型,经病理组织学分析肝细胞形态学变化,定量观察NF-κB动态变化,以巢式PCR分析NF-κB mRNA的表达.并以自身配对法收集经手术切除后的肝癌及其癌周组织,定量分析肝癌组织中NF-κB表达及病理学特征. 结果诱癌后在肝细胞呈颗粒样变性,不典型增生,肝细胞癌形成,NF-κB及基因表达呈梯度增加.NF-κB阳性表达呈棕黄色颗粒状染色,癌组织NF-κB点灶状表达,定位于胞质和细胞核,癌周组织NF-κB主要定位于胞质,未见细胞核阳性.癌变过程中NF-κB mRNA表达明显增强.人肝癌组织NF-κB(69.3±40.2)pg/mg,明显高于癌周组织(21.0±17.2)pg/mg(t=6.54,P＜0.01).癌组织NF-κB表达阳性率为100%,癌周组织为68.6%(X2=13.05,P＜0.01).其表达与肿瘤分化程度,肿瘤数目和肿瘤直径无关. 结论 NF-κB异常表达与肝癌的发生发展有关,表达抑制有助于肝痛治疗.