中国汉族人群2型糖尿病患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与同型半胱氨酸水平的研究

目的 观察2型糖尿病患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因单核苷酸多态性不同基因型间同型半胱氨酸水平的变化.方法 应用荧光标记单碱基延伸分型技术及寡核苷酸微阵列芯片杂交技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因的3个标签单核苷酸多态性;应用酶循环法检测血清同型半胱氨酸水平.结果 2型糖尿病组同型半胱氨酸水平（13.37±9.37 μmol/L）明显高于健康对照组（11.56±4.01 μmol/L）（P〈0.05）.rs6541003多态性AA基因型中2型糖尿病组血清同型半胱氨酸水平（13.80±10.35 μmol/L）显著高于对照组（11.45±4.11 μmol/L） （P〈0.05）.2型糖尿病组rs1801133（11.64±5.21 μmol/L vs 15.83±13.08 μmol/L）和rs9651118（9.47±5.22 μmol/L vs 14.31±11.09 μmol/L）多态性CC基因型患者血清同型半胱氨酸水平均显著低于同组TT型（P〈0.05）.结论 我国汉族人群2型糖尿病患者的3个标签单核苷酸多态性的基因型可能与亚甲基四氢叶酸还原酶酶活性及同型半胱氨酸代谢有关.     

MicroRNA-155对3种可经输血传播RNA病毒复制的影响及机制探究

目的了解经血传播的RNA病毒感染细胞后对小分子非编码RNA-155 (miR-155)的诱导作用及miR-155对这类病毒复制的影响。方法在2×10~5/mL肝癌细胞系Huh7.5.1中分别感染3种RNA病毒HCV、DENV和ZIKV,感染复数(MOI)为0.2,感染后48 h,提取胞内RNA,通过荧光定量PCR (qRT-PCR)的方法,检测病毒感染后miR-155的相对表达变化;同时在2×10~5/mL Huh7.5.1细胞中转染10 pmol的miR-155模拟物(miR-155 mimic)使miR-155高表达,转染后12 h分别接种0.2 MOI的3种病毒,感染后48 h提取胞内RNA,通过荧光定量PCR检测3种病毒RNA的复制水平及宿主抗病毒先天免疫相关基因表达水平。结果与未感染病毒的Huh7.5.1细胞相比,HCV、DENV及ZIKV感染Huh7.5.1细胞48 h后,miR-155的相对表达分别升高了132倍、157倍和8倍。与转染阴性对照组相比,miR-155高表达的Huh7.5.1细胞中,HCV、ZIKV和DENV的复制分别降低了48%、54%和70%;miR-155高表达的Huh7.5.1细胞中,IFNβ及一些干扰素刺激基因的表达明显升高。结论 HCV、DENV和ZIKV感染Huh7.5.1细胞后,显著诱导细胞中miR-155的表达;miR-155在细胞中高表达后,通过调节宿主细胞中Ⅰ型干扰素及一些干扰素刺激基因的表达来抑制HCV、DENV和ZIKV的复制。     

5氮杂脱氧胞苷对乳腺癌MCF-7细胞中抑癌基因p16mRNA表达的影响

目的 探讨5氮杂脱氧胞苷(5-aza-cdr)对乳腺癌细胞中p16基因mRNA表达的影响.方法 分别用5-aza-cdr 5、10和20 μmol/L处理乳腺癌细胞MCF-7,未处理的MCF-7细胞作为对照.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对药物处理前后的细胞进行p16基因甲基化检测;绿色荧光染料实时反转录聚合酶链反应(SYBR Green qRT-PCR)检测p16 mRNA表达.结果 在未处理的MCF-7细胞中(对照)p16基因呈完全甲基化状态,随着5-aza-cdr浓度增加,甲基化水平逐渐减弱,至5-aza-cdr 20 μmol/L时p16基因甲基化状态完全被逆转;p16 mRNA表达水平也随着药物剂量的递增逐渐增加,5-aza-cdr 20 μmol/L处理组与5、10 μmol/L处理组以及未处理组比较差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 乳腺癌细胞MCF-7中p16基因的甲基化能被5-aza-cdr逆转,去甲基化后可以促进p16 mRNA表达.     

Snail1外源性过表达诱导HepG2细胞上皮间叶样表型转化的实验研究

目的探讨Snaill蛋白诱导肝癌细胞发生上皮间叶表型转化并增强其侵袭转移能力的效应。方法利用重组腺病毒载体pAdEasy-SNAI1高效感染HepG2肝癌细胞株,诱导外源性Snail1蛋白过表达,以空载腺病毒pAdEasy-GFP作为对照。利用RT-PCR、Westernblot和细胞免疫组织化学的方法,检测转染后HepG2细胞Snail1、E—eadherin、N-eadherin、Vimaentin的mRNA转录和蛋白表达水平。随机运动实验及侵袭实验检测HepG2细胞转染目的基因后运动侵袭能力的改变。结果①pAdEasy-SNAI1高效感染HepG2细胞,与对照组相比SNAI1mRNA和Snail1蛋白表达均显著增强（分别为1．591±0．090、0．414±0．031,0．995±0．009、0．423±0．002。P〈0．01）,Snai1蛋白在胞浆和胞核着色明显强化。②实验组HepG2细胞,在mRNA和蛋白水平E-cadherin表达均显著受到抑制（分别为0．528±0,037、1．668±0．065,0．284±0．003、1．067±0．011,P〈0．01）,N—cadhrein、Vimentin表达则明显上调（N—eadhrein：0．945±0．029、0．600±0．015,0．655±0．007、0．226±0．007,P〈0．01;Vimentin：1．630±0．123、0．291±0．024,0.692±0,009、0．219±0．005,P〈0．01）;③实验组随机运动实验中各观察时相点细胞空白区均小于对照组;侵袭实验中,实验组穿膜细胞数多于对照组（59．4±7．48、23．9±4．15,P〈0．01）。结论外源性Snail1蛋白过表达能诱导HepG2细胞出现EMT样变化,细胞运动、侵袭能力增强。     

不同妊娠期妇女血微量元素水平变化分析

目的探讨不同妊娠期妇女血液微量元素变化情况。方法用原子吸收光谱分析法分别测定294例孕妇和47例健康妇女（对照组）Se、Mn、Fe、Cu、Zn水平。结果Se,与对照组（79．524±10．55μg／L）比较,早孕组（72．16±9．48μg／L）、中孕组（72．40±11.58μg／L）,P〉0．05,晚孕组（56．76±13．85μg／L）,P〈0．01;Mn,与对照组（15．00±3．25μg／L）比较,早孕组（14．10±3．73μg／L）、中孕组（15．57±3．49μg／L）,P〉0．05,晚孕组（24．24±5．43μg／L）,P〈0．01;Fe,与对照组（18．64±3．76μmol／L）比较,早孕组（22．20±4．68μmol／L）、晚孕组（12．68±4．31μmol／L）,P〈0．01,中孕组（17．76±6．13μmol／L）,P〉0．05;Cu,与对照组（16．28±2．69μmol／L）比较,早孕组（23．28±5．62μmol／L）、中孕组（25．48±3．45μmol／L）、晚孕组（28．82±4．36μmol／L）,P〈0．01;Zn,与对照组（12．83±1．16μmol／L）比较,早孕组（10．85±2．17μmol／L）、中孕组（9．71±1.70μmol／L）、晚孕组（7．81±1．36μmol／L）;P〈0．01。结论健康孕妇微量元素水平反映了微量元素之间协同、拮抗作用。随着妊娠期的推移,Fe的下降导致Mn的水平上升,Se的水平下降;而Cu的水平不断上升导致Zn水平不断下降,妊娠晚期各元素水平上升或下降尤为显著。     

三氧化二砷联合丁硫氨酸亚砜胺对K562/ADM细胞的作用及其机制研究

目的 研究三氧化二砷（As2O3）联合γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫氨酸亚砜胺（BSO）对肿瘤多药耐药细胞株K562／ADM细胞的诱导凋亡效应，及对P糖蛋白（P—gp）和mdr1mRNA表达的抑制作用，探讨谷胱甘肽（GSH）的含量变化与As2O3作用效果的关系。方法As2O3（0．5、2．0、5．0μmol／L）单独及联合100μmol／LBSO作用于K562／ADM细胞，应用MTT比色法检测K562／ADM细胞的增殖活性；膜联蛋白V／碘化丙锭（AnnexinV／PI）标记法观察K562／ADM细胞的凋亡效应；分光光度法检测K562／ADM细胞内GSH含量变化；流式细胞术（FCM）检测P—gp水平变化；RT—PCR方法检测mdr1mRNA的表达变化。结果 K562／ADM细胞内的GSH含量为（81．13±3．91）mg／g蛋白，在BSO降低GSH含量后，临床剂量（0．5、2．0μmol／L）As2O3联合BSO（100μmol／L）24h内即可抑制K562／ADM细胞的增殖活性，诱导K562／ADM细胞发生凋亡，处理48h凋亡率分别为（59．29±6．01）％，（65．06±8．29）％；72h凋亡率分别为（82．15±9．28）％，（92．72±9．41）％；其诱导凋亡效果均明显强于单用As2O3，临床剂量和高剂量（5．0μmol／L）组。K562／ADM细胞P—gp表达阳性率为98．1％，mdr1mRNA的相对表达水平为1．85±0．13，临床剂量As2O3联合BSO处理48h，其抑制mdr1mRNA表达的作用效果以及处理72h对P—gP的抑制作用均明显强于单用高剂量As2O3组。结论 GSH的含量变化与As2O3的作用效果密切相关，As2O3联合BSO可有效诱导K562／ADM细胞发生凋亡，有效抑制P—gP及mdr1mRNA的表达。     

稀土化合物氯化镧对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞分泌-一氧化氮的影响

目的探讨氯化镧（LaCl3）由对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠巨噬细胞（RAW264．7）分泌一氧化氮（nitric oxide，N01的影响。方法RAW 264．7细胞随机分成四组：空白对照组（培养基中不含LaCl3和LPS），氯化镧组（含LaCk2．5，5，10，20μmol／L培养24h）、氯化镧＋LPS组（分别以含LaCl3 2．5、5、10、20μmol／L的培养基培养24h后．更换含LPS 1mg／L的培养基继续培养24h）及LPS组（含LPS 1mg／L的培养基培养24h）。采用硝酸还原酶法测定各组细胞培养液上清一氧化氮（NO）的含量。结果LPS组培养上清NO浓度为52．82±12．60μmol／L与空白对照组（2．90±2．36μmol／L）和LaCl3组[（6．50±4．67μmol／L、9．52±4．47μmol／L、11．14±7．42μmol／L、6．74±2．00μmol／L]比较有显著性差异（P〈0．05）；LaCl3＋LPS组NO的浓度分别为26．00±5．83μmol/L（2．5μmol／L LaCl3＋LPS）、29．86±7．26μmol／L（5μmol／L LaCl3＋LPS）、34．62±6．24μmol／L （10μmol／L LaCl3＋LPS），与LPS组相比显著减少（P〈0．05），20μmol／L LaCl3＋LPS）组NO的产生为45．61±6．68μmol／L与LPS组比较无显著性差异。结论一定浓度的LaCl3可抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO的水平。     

高强度超声治疗对荷U14宫颈癌小鼠脾细胞Th1、Th2亚群细胞因子mRNA表达水平的影响

目的探讨高强度超声治疗对荷U14宫颈癌小鼠脾细胞Th1、Th2亚群细胞因子mRNA表达水平的影响。 方法实验分为4组：HIU治疗组（A）、手术治疗组（B）、荷瘤对照组（C）及正常对照组（D）。于种植肿瘤后7 d,分别接受相应治疗;17 d,制备并培养小鼠脾淋巴细胞,应用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术检测A、B、C、D各组小鼠脾淋巴细胞细胞因子mRNA的表达水平。 结果A组小鼠脾淋巴细胞IL-2 mRNA相对含量（0.752±0.101）较B（0.430±0.064）、C（0.188±0.049）、D（0.392±0.053）各组明显增高（P〈0.05）。A组小鼠脾淋巴细胞IFN-γmRNA相对含量（0.507±0.076）较B（0.233±0.045）、C（0.087±0.010）、D（0.218±0.049）各组明显增高（P〈0.05）;A组小鼠脾淋巴细胞IL-4 mRNA相对含量（0.213±0.049）较C（0.745±0.067）、D（0.310±0.064）各组明显降低（P〈0.05）;A组小鼠脾淋巴细胞IL-10 mRNA相对含量（0.093±0.032）较B（0.231±0.053）、C（0.657±0.111）、D（0.308±0.086）各组明显降低（P〈0.05）。 结论HIU固化的U14肿瘤细胞可能激活机体免疫功能,促使Th2占优势向Th1占优势逆转,从而提高小鼠抗肿瘤免疫功能,抑制肿瘤生长。     

米非司酮逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的研究孕激素拮抗剂米非司酮对白血病多药耐药细胞K562／A02的逆转作用及其机制。方法MTT法检测米非司酮作用72h后K562／A02细胞增殖及其对阿霉素杀伤敏感性的变化；流式细胞术检测米非司酮作用前后K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达和细胞内柔红霉素的浓度；免疫组化法观察米非司酮作用前后K562／A02细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达；RT—PCR检测米非司酮作用后对K562／A02细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶（GcS）mRNA表达的影响。结果2．5、5．0和10．0μmol／L米非司酮不抑制K562／A02细胞的增殖，但上述浓度的米非司酮作用后K562／A02细胞对阿霉素的敏感性较前分别增强了1．68、4．17和10．71倍。K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达为（49．03±5．32）％，10μmol／L米非司酮作用72h后降低到（28．60±2．13）％（P〈0．01）；K562／A02细胞内柔红霉素的浓度为（61．07±8．61）％，而10μmol／L米非司酮作用后升高到（92．72±3．48）％（P〈0．01）。经10μmol／L米非司酮作用后，bcl-2蛋白表达由（56±9）％降低到（37±6）％（P〈0．05）；Bax蛋白由（40±5）％升高到（87±10）％（P〈0．01）；caspase-3蛋白则由（36±7）％升高到（89±6）％（P〈0．01）。RT—PCR结果显示K562／A02细胞GcS mRNA的表达较K562细胞明显升高，10μmol／L米非司酮能明显降低K562／A02细胞内GcS mRNA的表达。结论米非司酮可逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，且具有剂量依赖性。10μmol／L米非司酮能明显逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，其机制与降低P糖蛋白的水平，调节凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达，降低GcS mRNA有关。     

BMP-2,BGP mRNA表达量及ALP活性的变化对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨细胞的影响

目的建立骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养体系，探讨BMSCs诱导条件下骨向分化能力和骨形成蛋白-2（BMP-2）、骨钙素（BGP）mRNA表达量及ALP活性的变化对成骨细胞增殖分化的影响。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离大鼠BMSCs，观察细胞形态学特征；应用成骨诱导体系诱导BMSCs向成骨细胞进行分化；通过细胞形态学观察、组织化学染色鉴定，酶联免疫分析仪和RT—PCR分别定量检测7d和14dALP活性及BMP-2，BGP mRNA表达。结果用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得高纯度的BMSCs；经骨向诱导7d和14d后，ALP和矿化结节染色阳性；骨向诱导组：14dALP活性82±1．0U／L，mRNA表达BMP-2为6．04±0．02，BGP为3．21±0．02，分别较7d（33±2．0U／L，1．40±0．01，1．1±0．01）显著增高（P〈0．01）。未诱导组：ALP活性低（12±1．0U／L），BMP-2，BGP mRNA未表达，无矿化结节形成。结果显示：随培养时间延长，BMP-2增高的同时ALP活性及BGP表达量也明显增高，细胞形态发生改变并向成骨方向分化，表明与形成成骨细胞有关。结论将BMSCs成功诱导分化为成骨细胞，并建立了体外分离培养体系。提示BMP-2，BGP mRNA表达量的增加及ALP活性增高，与细胞骨向分化具有较高的相关性。