人胰岛素样生长因子-1基因转染对软骨细胞增殖的影响

背景各种生长因子对体外培养的软骨细胞均有不同程度的促增值作用,但半衰期较短,很难达到软骨缺陷治疗所要求的时效.目的探讨自行构建携带人胰岛素样生长因子腺病毒载体(Ad/CMV-hIGF-1)对软骨细胞增殖的影响.设计设立对照的实验研究.地点和对象实验在中山大学林百欣医学研究中心进行.体外培养人胚胎软骨细胞,采用对数增长期的第3代软骨细胞进行实验.干预自行构建携带hIGF-1基因的重组腺病毒并进行PCR,Western blot 鉴定.采用1,10,100及500不同感染复数单位(multiplicity of infection,MOI)的Ad/CMV-hIGF-1分别转染第3代软骨细胞,用磷酸盐(PBS)做阴性对照,hIGF-1生长因子(100μg/L)做阳性对照.主要观察指标采用四氮甲基唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测不同时间、不同组别软骨细胞吸光度.结果第2代重组腺病毒上清液中PCR鉴定含有hIGF-1基因,Western blot证实Ad/CMV-hIGF-1表达成熟的hIGF-1生长因子.不同病毒滴度转染对软骨细胞增殖的影响存在量效依赖关系,在1～100 MOI之间,软骨细胞吸光度随着病毒滴度增加逐渐升高,100 MOI软骨细胞吸光度约为PBS组的3倍;500 MOI Ad/CMV-hIGF-1时,软骨细胞吸光度较100 MOI下降,与1 MOI与10 MOI对软骨细胞增殖的影响近似.PBS组随着细胞体外培养时间延长,细胞增殖下降,hIGF-1生长因子、hIGF-1基因对软骨细胞增殖的影响存在时效关系,72 h达到峰值.结论成功构建Ad/CMV-hIGF-1;Ad/CMV-hIGF-1基因转染对软骨细胞增殖的影响存在量效、时效依赖关系.     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的：探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，并初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法：实验于2002-07／2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子Ⅰ／GS质粒。将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后，抽提纯化质粒，并对质粒进行测序鉴定。②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞，通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达。③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后，检测各混合液的吸光度，以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量。结果：①质粒鉴定结果：质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带，符合质粒的电泳图谱；质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合。②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达：质粒转染软骨细胞后，反转录-聚合酶链反应能见到298bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达；Western-blot可见7．6ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带。③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响：转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是（5．23&;#177;0．62）mg／L和（2．47&;#177;0．31）mg／L．两组比较，差异有显著性意义（t=2．88，P〈0．05）；转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为（9．92&;#177;1．04）mg／L和（4．56&;#177;0．51）mg／L，两组比较，差异有显著性意义（t=6．47，P〈0．05）。结论：胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达，并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖，具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力。转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。     

外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用

目的：观察腺病毒介导的绿色荧光蛋白(green fluorescent protem，GFP)标记软骨组织工程种子细胞的可行性，探讨外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用。方法：实验于2002-01／08在解放军第一军医大学实验室完成。腺病毒GFP表达载体以巨细胞病毒(CMV)为启动子转染体外培养软骨细胞作为种子细胞与poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)(PHBHH)复合后植入兔体内，术后一定时间取材，确定组织工程化组织的表型，观察GFP的表达。结果：以CMV为启动子的腺病毒GFP载体能有效转染体外培养软骨细胞，转染效率达53．66％。携带GFP的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞，6周和12周形成的组织工程化组织中检测到GFP表达，经苏木精一伊红染色、免疫组织化学检查和特殊染色确定获取的组织为软骨组织，且与未转染软骨细胞形成的组织工程化软骨组织形态学一致。结论：腺病毒介导的GFP能有效转染体外培养软骨细胞，外源性软骨细胞是体内组织工程化软骨组织形成的源细胞。     

腺病毒介导白细胞介素-10基因转染抑制血管平滑肌细胞的增殖及机制

目的：观察白细胞介素（interleukin，IL-10基因转染对血管平滑肌细胞增殖的影响，初步研究其相关机制。方法：不同感染复数（multiplicity of infection，MOI）的IL-10重组腺病毒（Ad／IL-10）转染原代培养的人脐带动脉平滑肌细胞（HUASMcs），用酶联免疫吸附试验检测培养上清中IL-10的表达，噻唑蓝法测定吸光度值（OD570值），绘制细胞生长曲线，流式细胞术分析细胞周期、细胞凋亡，实时荧光定量聚合酶链反应检测p21的表达。结果：MOI=100时培养上清中IL-10含量最高，为5．746ng／ml；转染72h、96h，MOI为100、150、200组与MOI为10、20组及空白对照组比较，显著抑制HUASMCs的增殖（P〈0．01）；与空白及空载体转染对照组比较，MOI100的Ad／IL-10转染组的Gn-1期细胞数、凋亡细胞的平均百分数均显著增加（P〈0．01），p21基因表达的拷贝数较低。结论：MOI为100的Ad／IL-10可有效抑制HUASMCs的增殖，此作用与细胞周期阻滞和凋亡有关，为ID-10基因转染治疗血管内膜增生提供了理论依据。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质千细胞后bFGF目的基因的表达情况，并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法：实验于2005—03／2006—02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，构建含bFGF基因的腺病毒表达载体，利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后，将细胞接种12孔培养板，培养至90％融合时弃上清，调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果，以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后，胰酶消化，置于6孔板内，每孔细胞数量5&;#215;10^5，2d后细胞贴壁生长于盖玻片上，分别转染Ad．bFGF、Ad．GFP，同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Westem—Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达，ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果：①pcDNA3／bFGF的鉴定结果：成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad．GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定：转染48h后，绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时，腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关（P〈0．05），当〉200时转染效率趋于稳定，均在96％以上。③Ad．bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况：bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad．bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒，阳性表达率为86％，而转染Ad．GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western—Blot示转染Ad．bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad．GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad．bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng／L，此后逐渐下降，但至转染第28天时仍显著高于空白对照（441ng／L，128ng／L，t=4．31，P〈0．01）。④转染Ad．bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响：骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论：采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中，并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的：研究转化生长因子β(TGF—β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用，为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法：利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的其核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组)，RT—PCR、Nonhem—Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF—β1调节体外培养软骨细胞II型胶原表达的变化。结果：TGF-β1基因转染软骨细胞后，其II型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强，且随着TGF—β1蛋白表达的丧失，其对软骨细胞II型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论：TGF—β1可以上调体外培养软骨细胞II型胶原的表达。     

转基因同种异体组织工程软骨修复兔膝关节全层缺损

目的：观察转人胰岛素样生长因子Ⅰ基因同种异体组织工程软骨对兔膝关节软骨全层缺损的修复作用。 方法：实验于2004～08／2005—08在军事兽医研究所病毒室及长春生物制品研究所实验室完成。①取出生28d新西兰白兔的关节软骨，采用机械分离及Ⅱ型胶原酶消化法获得分离的兔软骨细胞，用单层培养扩增。②用脂质体法使胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染兔关节软骨细胞。③以经过转染的兔关节软骨细胞作为种子细胞，牛Ⅰ型胶原作为支架，体外构建转基因同种异体组织工程软骨。④5个月龄的新西兰白兔80只制备关节软骨缺损模型，分别移植入不同组别的移植物：空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组，分别于术后4，8，16，24周处死各组动物4只取材，观察兔膝关节软骨全层缺损的修复情况。结果：①G418培养液筛选结果：通过G-418对于兔关节软骨细胞的最小致死剂量的测定得出，G418对软骨细胞的最小致死剂量为0．4g／L。转染后软骨细胞经0．4g／L G418筛选，2周后得到抗G418的阳性细胞克隆，而未转染细胞在含G418的培养液中逐渐全部死亡，初步证明人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的转染成功。②原位杂交检测结果：转染软骨细胞胞浆中有氯化镍紫蓝色颗粒阳性杂交信号说明有人胰岛素样生长因子1mRNA的表达；未转染细胞则未见阳性信号。③免疫组织化学检测结果：在转染的软骨细胞胞浆中有棕黄色颗粒样阳性信号，说明有Ⅱ型胶原蛋白表达，证明稳定表达人胰岛素样生长因子Ⅰ的转染软骨细胞保持Ⅱ型胶原的表达。④软骨缺损修复后的组织学评价结果：在试验所观察的24周内，软骨基本稳定，而且转胰岛素样生长因子Ⅰ基因组织工程软骨显示出强烈的软骨基质分泌能力。转胰岛素样生长因子Ⅰ基因的同种异体组织工程软骨对软骨缺损的修复效果明显优于空白对照组和单纯软骨细胞附和支架组[空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组修复软骨的组织学评分：术后4周为（12．00&;#177;0．79），（11．00&;#177;0．81），（8．10&;#177;0．90），（5．80&;#177;1．03），（5．20&;#177;0．46）分；术后8周为（10．20&;#177;0．96），（10．10&;#177;1．19），（7．10&;#177;1．34），（4．90&;#177;1．15），（4．00&;#177;0．58）分；术后16周为（8．00&;#177;1．24），（8．50&;#177;1．79），（5．20&;#177;1．88），（4．00&;#177;1．82），（2．00&;#177;1．96）分；术后24周为（7．00&;#177;0．90），（6．50&;#177;2．13），（4．30&;#177;2．00），（3．00&;#177;2．13），（1．20&;#177;0．78）分，P〈0．05]. 结论：人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染兔关节软骨细胞后可以在细胞中表达，而且转胰岛素样生长因子Ⅰ基因的同种异体组织工程软骨对兔关节软骨全层缺损的修复效果明显。为进一步转基因组织工程软骨实验提供了依据。     

转化生长因子β与组织工程①：本刊中文部

1反转录病毒载体介导转化生长因子81基因体外转染免膝关节软骨细胞的表达,见2010年2期214．217页。2威灵仙干预体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及转化生长因子B1mRNA基因的表达,见2010年11期1901-1906页。3转化生长因子β1联合骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞的分化,见2010年24期4371-4375页。     

腺病毒介导骨形态发生蛋S2基因对免软骨细胞的影响

背景：研究证实骨形态发生蛋白2具有促进软骨细胞增殖、分化的能力。目的：进一步验证由腺病毒介导的骨形态发生蛋白2对兔软骨细胞增殖的作用。设计、时间及地点：对比观察，实验于2006-01／2007-12在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。材料：5．0月龄健康的新西兰白兔4只，体质量3．0～4．0kg，雄雌不限。携带骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体，由苏州大学附属第一医院骨科实验室保存。方法：取兔耳郭的弹性软骨进行细胞培养，再以腺病毒为载体转染骨形态发生蛋白2到软骨细胞内作为实验组，未转染的作为对照组。主要观察指标：采用阿利新蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量测定等方法观察软骨细胞增殖和分化。结果：实验组中的软骨细胞数量多，形态均一，融合率高，酸性黏多糖也较未转染组多。四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量检测结果示实验组均高于未转染组。结论：腺病毒介导的骨形态发生蛋白2能促进软骨细胞增殖、保持软骨细胞的分化表型。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对软骨细胞凋亡的抑制

目的：探讨胰岛紊样生长因子-Ⅰ(IGF-I)对软骨细胞增殖及白细胞介素-Ⅰ(IL-1)诱导软骨细胞凋亡的影响，揭示其抗损伤作用机制，为关节软骨损伤治疗提供理论依据。方法：分离培养人胚胎关节软骨细胞，采用四氮甲基唑蓝(MTT)法测定不同含量软骨细胞增殖活性的变化，利用光镜、电镜、DNA电泳及流式细胞仪测定作为凋亡检测指标。结果：IGF-I呈剂量依赖式促软骨细胞增殖，当IGF-I含量达50μg／L时，促软骨细胞增殖作用达最大值。IL-1组光镜、电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变，琼脂糖凝胶电泳示特征性的DNA梯状条带，IGF-I处理组未见明显凋亡征象。流式细胞仪检测发现，IGF-I处理后软骨细胞凋亡率显著降低。结论：IGF-I能促进软骨细胞增殖，对IL-1诱导的软骨细胞凋亡具有保护作用。     

软骨细胞增殖与胰岛素和氢化可的松联合应用的关系

背景：关节腔内激素注射治疗关节炎能迅速缓解关节疼痛，但可发生进行性软骨损害。加用具有生长因子样作用的胰岛素，是否可产生对关节软骨细胞的保护作用？目的：观察胰岛素和氢化可的松联合作用对软骨细胞生长的影响。设计：分组对比观察，1种药物单独作用采用单因素方差分析，2种药物复合作用采用多因素实验设计资料方差分析的析因分析。单位：广州市创伤外科研究所。材料：4～6周龄的新西兰大白兔膝关节软骨。方法：实验于2000-02／2001-05在广州市创伤外科研究所完成。将软骨碎片分别用透明质酸酶，胰酶及Ⅱ型胶原酶消化，获得软骨单细胞悬液，予以不同作用及其不同剂量的药物干预。根据应用干预药物剂量的不同将其分为4组及相应亚组。对照组(不加氢化可的松和胰岛素)，胰岛素(0．035，0．35，3．5，35mg／L)组，氢化可的松(1，5，10，50，100mg／L)组，胰岛素(0．35mg／L)+氢化可的松(50mg／L)组，应用四氮甲基唑蓝比色分析法观察其对软骨细胞增殖的影响。主要观察指标：①胰岛素对软骨细胞增殖的影响。②氢化可的松对软骨细胞增殖的影响。③氢化可的松与胰岛素联合使用对软骨细胞增殖的影响。结果：①胰岛素可促进软骨细胞增殖：单独使用0．035mg／L即可发挥效应，当浓度增至0．35mg／L时，其促进作用达到最大值。②氢化可的松对软骨细胞增殖的抑制作用：单独使用10mg／L时即可发挥效应，随着浓度增大抑制作用显著，当浓度增大至100mg／L，软骨细胞几乎全部死亡。③0．35mg／L胰岛素与50mg／L氢化可的松联合使用：存在着负协同作用(F：164．9，P&;lt;0．01)。结论：低浓度胰岛素对软骨细胞的增殖有促进作用。但氢化可的松对软骨细胞的增殖有抑制作用。二者联合使用时，氢化可的松可拮抗胰岛素的作用。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

与软骨损伤修复有关的生长因子与基因治疗技术

软骨修复是一个极其复杂的过程，生长因子是软骨组织工程的重要工具，参与软骨细胞的增殖、分化和基质代谢活动，同时作为信号物质参与软骨修复的调节，在软骨修复的过程中起重要的促进作用。体外软骨细胞培养过程中软骨细胞表型的丧失以及植入体内后局部缺乏生长因子均影响软骨缺损的修复，通过基因转导技术修饰的软骨细胞既能够促进损伤软骨细胞的修复和增殖分化，又可以在体内软骨再生过程中持续、高效地在局部分泌生长因子，提高修复质量。     

Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导

背景：重组DNA技术的进展为骨组织工程研究的发展提供巨大动力,将其应用于组织工程骨构建可以显著提高骨修复的质量和效率。目的：拟将Ad-h BMP-2联合Ad-h TGF-β1转染骨髓间充质干细胞体外成骨诱导,观察二者在成骨过程中的相互关系。方法：以腺病毒Ad Max为基因转移载体,将携带转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2基因的高滴度腺病毒感染SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达,通过RT-PCR、ELISA、MTT实验及碱性磷酸酶水平检测等方法鉴定。结果与结论：腺病毒感染骨髓间充质干细胞后RT-PCR可检测出外源基因的表达,MTT实验和碱性磷酸酶活性检测双基因共转染的骨髓间充质干细胞增殖能力最强,碱性磷酸酶活性最高。结果表明联合应用Ad-h TGF-β1和Ad-h BMP-2转染可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨化,效果优于单用一种生长因子。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P<0.05),当>200时转染效率趋于稳定,均在96%以上。③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441ng/L,128ng/L,t=4.31,P<0.01)。④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

转基因同种异体组织工程软骨修复兔膝关节全层缺损

目的:观察转人胰岛素样生长因子I基因同种异体组织工程软骨对兔膝关节软骨全层缺损的修复作用。方法:实验于2004-08/2005-08在军事兽医研究所病毒室及长春生物制品研究所实验室完成。①取出生28d新西兰白兔的关节软骨,采用机械分离及Ⅱ型胶原酶消化法获得分离的兔软骨细胞,用单层培养扩增。②用脂质体法使胰岛素样生长因子I基因转染兔关节软骨细胞。③以经过转染的兔关节软骨细胞作为种子细胞,牛Ⅰ型胶原作为支架,体外构建转基因同种异体组织工程软骨。④5个月龄的新西兰白兔80只制备关节软骨缺损模型,分别移植入不同组别的移植物:空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组,分别于术后4,8,16,24周处死各组动物4只取材,观察兔膝关节软骨全层缺损的修复情况。结果:①G418培养液筛选结果:通过G418对于兔关节软骨细胞的最小致死剂量的测定得出,G418对软骨细胞的最小致死剂量为0.4g/L。转染后软骨细胞经0.4g/LG418筛选,2周后得到抗G418的阳性细胞克隆,而未转染细胞在含G418的培养液中逐渐全部死亡,初步证明人胰岛素样生长因子I基因的转染成功。②原位杂交检测结果:转染软骨细胞胞浆中有氯化镍紫蓝色颗粒阳性杂交信号说明有人胰岛素样生长因子ImRNA的表达;未转染细胞则未见阳性信号。③免疫组织化学检测结果:在转染的软骨细胞胞浆中有棕黄色颗粒样阳性信号,说明有Ⅱ型胶原蛋白表达,证明稳定表达人胰岛素样生长因子I的转染软骨细胞保持Ⅱ型胶原的表达。④软骨缺损修复后的组织学评价结果:在试验所观察的24周内,软骨基本稳定,而且转胰岛素样生长因子I基因组织工程软骨显示出强烈的软骨基质分泌能力。转胰岛素样生长因子I基因的同种异体组织工程软骨对软骨缺损的修复效果明显优于空白对照组和单纯软骨细胞附和支架组犤空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组修复软骨的组织学评分:术后4周为(12.00±0.79),(11.00±0.81),(8.10±0.90),(5.80±1.03),(5.20±0.46)分;术后8周为(10.20±0.96),(10.10±1.19),(7.10±1.34),(4.90±1.15),(4.00±0.58)分;术后16周为(8.00±1.24),(8.50±1.79),(5.20±1.88),(4.00±1.82),(2.00±1.96)分;术后24周为(7.00±0.90),(6.50±2.13),(4.30±2.00),(3.00±2.13),(1.20±0.78)分,P<0.05犦。结论:人胰岛素样生长因子I基因转染兔关节软骨细胞后可以在细胞中表达,而且转胰岛素样生长因子I基因的同种异体组织工程软骨对兔关节软骨全层缺损的修复效果明显。为进一步转基因组织工程软骨实验提供了依据。     

血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定

目的:基因重组腺病毒具有较高的转染率,且宿主范围广.实验拟构建携带人血管内皮细胞生长因子165基因的重组腺病毒载体(Ad.VEGF165),为后续基因转染、微囊化基因工程细胞及其动物模型研究提供实验基础.方法:实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成(国家级重点实验室).①实验材料:pAxCAwt.VEGF165由长海医院胸心外科研究所惠赠.②实验方法:采用脂质体转染法,将pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC共转染人胚肾293细胞,扩增后获得载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷犁重组腺病毒.⑧实验评估:应用聚合酶链反应及酶切证实重组腺病毒中的目的基因.并根据50%组织培养感染剂量法计算病毒滴度.结果:①重组腺病毒Ad.VEGF165的构建:采用脂质体法可使pAxCAwt.VEGF165与DNA-TIC有效转染人胚肾293细胞,扩增出载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒.②重组腺病毒Ad.VEGFl65的鉴定:聚合酶链反应的产物进行Nco I酶切鉴定,可得到597 bp、146 bp 2个片段,与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致,计算病毒滴度为2.2×1015pfa/L.结论:采用pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC系统经脂质体转染法成功构建的复制缺陷的重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全.     

腺病毒介导细胞外信号调节激酶2表达对去分化软骨细胞增殖及胞外基质合成的影响

目的：观察腺病毒介导细胞外信号调节激酶2的过度表达对去分化软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响，以及腺病毒介导细胞外信号调节激酶2用于修饰去分化软骨细胞的可行性。 方法：实验于2004-09／2005-05在暨南大学组织移植与免疫研究中心进行。SD大鼠5只，周龄为3-5周，此处请核对体质量为（150&;#177;20）g，分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞，利用Adeasy系统构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体。流式细胞仪检测不同感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率，Western blot检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1／2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达，^3H-TdR,^3H-proline和^35 S-sulfate同位素掺入检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染对大鼠肋生长板软骨细胞增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响。 结果：①成功构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体重组腺病毒。②100感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率大于90％。③携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染的第5代大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1／2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达均显著增加，分别是Ad-CMV组的15．58和1．85倍。④同位素检测结果表明携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体的感染促进^3H-TdR、^3H-proline和^35S-sulfate的掺入，分别是对照组的2．52，1.61和1．53倍（P〈0．05）。 结论：腺病毒介导细胞外信号调节激酶2基因的过度表达促进去分化大鼠肋生长板软骨细胞的增殖和细胞外基质成分的合成。     

反转录病毒载体介导转化生长因子β_1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达

背景:将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤.目的:以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β_1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响.方法:采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞.载体经PLNCX_2 Hind Ⅲ/Not Ⅰ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed_2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX_2-RFP.转化生长因子β_1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX_2-RFP连接,构建PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度.将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染:对照组(不做任何转染)、转染PLNCX_2组、转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化.收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β_1表达.结果与结论:重组基因PLNCX_2-TGFβ_1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ_1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×10~6CFU.稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功.持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃.转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX_2组(P<0.05),对照组、转染PLNCX_2组间差异无显著性意义.对照组与转染PLNCX_2组均无转化生长因子β_1表达,转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组转化生长因子β_1质量浓度为(28.08±3.73)ng/L.提示反转录病毒载体PLNCX_2介导的人转化生长因子β_1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃.     

碱性成纤维细胞生长因子转染兔关节软骨细胞的研究

背景：软骨细胞体外培养困难和表型难以维持是软骨组织工程研究的一大难题。目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)基因转染兔关节软骨细胞后对培养的关节软骨细胞形态、分裂增殖及代谢等方面的影响。设计：完全随机对照实验研究。地点和方法：实验在解放军第一军医大学热带军队卫生学系完成，对象为兔软骨细胞(3周龄新西兰新生兔购于第一军医大学实验动物中心)。干预：将bFGF基因克隆于真核表达载体pHβ0AP-1中，构建重组真核表达载体pHβ-bFGF，转染兔关节软骨细胞。G418筛选阳性克隆，检测阳性细胞bFGF基因的表达水平。测定培养软骨细胞的DNA含量、糖醛酸含量、软骨细胞增殖情况及进行细胞周期分析。主要观察指标：DNA含量、糖醛酸含量、软骨细胞增殖情况及细胞周期分析。结果：bFGF基因转染软骨细胞表型未见显著变化；bFGF基因转染组、载体对照组、空白对照组DNA含量分别为(77．37&;#177;6．21)，(40．39&;#177;4．33)，(33．77&;#177;4．25)μg／瓶(P&;lt;0．01)，糖醛酸含量分别为(308．8&;#177;10．2)，(77．9&;#177;8．7)，(80．2&;#177;10．5)μg／瓶(P&;lt;0．01)，软骨细胞G1期分别为59．3&;#177;2．1，69．5&;#177;4．0，73．1&;#177;3．9(P&;lt;0．05)。结论：bFGF转染关节软骨细胞后，可显著促进细胞分裂增殖并缩短细胞周期，为软骨组织工程研究提供新的技术路线及理论基础。