大鼠脑源性神经营养因子基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达序列,构建大鼠BDNF基因真核表达载体.方法 以RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-BN,以限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为783bp特异片段,重组质粒酶切后产生783bp和5.2 kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠BDNF基因序列完全一致.结论 成功克隆大鼠BDNF基因表达序列并构建了BDNF基因真核表达栽体pcDNA3-BN.     

真核表达载体pEGFP-C3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1，为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13．5d胚胎组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRI酶切位点的MASH1cDNA编码片段，经回收、纯化、酶切后，依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明：重组质粒PEGFP-C3含有MASH-Ⅰ片段，方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-Ⅰ。     

反义PCDNA3.1(+)/TIMP-1真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒。方法：用Trizol Reagent抽提肝组织中总RNA．采用两对套式引物，以逆转录巢式PCR方法扩增TIMP-1目的片段，双酶切纯化PCR产物及PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒。再将TIMP-1反向插入PCDNA3.1（＋）线性质粒，即构建成反义TIMP-1／PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定。结果：DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论：反义TIMP-1／PCDNA3．1（＋）真核细胞表达质粒构建成功。     

hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆

目的 克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(hPARP-1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM-T-S载体，为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法 采用RT-PCR方法，用正常人胚肺成纤维细胞(HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增hPARP-1基因片段，并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α，用蓝(白)斑试验筛选出阳性克隆，抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定，再行序列分析。结果 经RT-PCR获得507bp含限制性内切酶位点的阳性产物，T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实，克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为99．9％。结论 该实验成功地构建了含hPAR-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆，为亚克隆及缺陷细胞株的建立提供工具。     

CYP1A1基因cDNA全长的T载体克隆及序列分析

目的构建含KpnI、XhoI双酶切位点的人细胞色素(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法从培养的人乳腺癌细胞(MCF-7)中抽提总RNA,RT-PCR扩增CYP1A1基因cDNA全长,与pGEM-T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析。结果重组质粒pGEM-T-1A1 PCR后获得了1 568 bp产物,酶切鉴定证实目的片段成功插入至pGEM-T,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1mRNA的序列同源性为99.9%。结论成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体。     

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的　设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法　运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果　RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论　成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。     

构建干扰RhoA的短发夹RNA真核表达载体

目的利用pGenesil-1质粒构建针对RhoA的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法设计2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,胶回收酶切pGenesil-1大片段,T4DNALigase连接酶切大片段和DNA序列,得到质粒pGenesil-1-RhoA1和pGenesil-1-RhoA2.转化感受态细胞DH5a,扩增,提取重组质粒进行酶切鉴定。结果成功构建靶向RhoA的shRNA重组质粒载体.酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。结论表达靶向RhoA的shRNA表达框成功构建在重组质粒载体上。     

尿激酶受体反义RNA真核表达质粒的构建

目的构建尿激酶受体(UPAR)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究通过UPAR干预类风湿关节炎的发生发展提供实验基础。方法取冰冻保存的小鼠肝癌组织,应用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因(UPAR)cDNA片段。用CaCl2法诱导感受态细胞。将真核载体pcDNA3.1(-)在多克隆位点处用HindⅢ、BamHⅠ双酶切线性化,切胶纯化回收;将纯化回收的pcDNA3.1(-)线性化载体和UPAR基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(-)为载体的反义UPAR基因表达质粒;转化JM109大肠杆菌;酶切证实的阳性克隆行测序分析。结果琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18S条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9051,认为RNA纯度良好;RNA浓度为450mg/L;阳性克隆经双酶切后行10g/L琼脂糖电泳,在DNAMarker500bp和5.3bp附近可见两条明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功;DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论反义UPAR真核表达重组质粒构建成功。     

hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆及序列分析

目的：构建含限制性内切酶位点PstⅠ、KpnⅠ的hMSH2基因cDNA保守区域的pGEM-T-S载体,比较分析序列的变化,为以后的毒理学研究提供实验材料,方法：从人胚肺成纤维细胞HLF中抽提总RNA进行RT－PCR扩增,直接与T载体连接转化大肠杆蓖DH5α,用蓝／白斑试验筛选阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,再行序列分析。结果：经RT－PCR获得631bp含量制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实,克隆片段与genbank中该基因的序列同源性为99．5％。结论本文成功地构建了含hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆,该克隆可为DNA错配修复缺陷与致癌关系研究提供工具。     

重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒的构建

目的构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1IGF-1),为基因治疗脊髓损伤(SCI)提供前提。方法应用反转录聚合酶链反应(RTPCR)方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1(IGF1)基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFPN1上,以构建重组质粒pEGFPN1IGF1。结果实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以RTPCR方法获取编码IGF1基因的全序列cDNA。构建IGF1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实结果。结论构建重组质粒pEGFPN1IGF1成功,实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因的3′端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,既保留了IGF1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

Nucleophosmin基因表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的克隆Nucleophosmin(NPM)的编码序列,构建含Nucleophosmin基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌多药耐药中的作用奠定基础。方法根据已发表的Nucleophosmin基因的核苷酸序列设计合成一对引物,以人乳腺癌组织抽提的RNA为模板进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,用限制性内切酶酶切重组质粒pEGFP/NPM和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pEGFP/NPM导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组织化学法和RT-PCR鉴定其表达。结果 RT-PCR扩增出长894bp的特异性片段,经克隆至pEGFP-N1后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pEGFP/NPM在HepG2细胞中有稳定表达。结论成功克隆了NPM的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pEGFP/NPM/1,有助于对NPM基因在肝癌多药耐药中的机制做进一步研究。     

AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1( )AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1( ),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1( )AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。     

反义阻断hMMS2基因表达以抑制细胞生长

将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因h MMS2的 c DNA特定反向克隆到本室改建的真核细胞表达载体 p MAMneo- amp-中 ,构建了表达h MMS2反义 RNA的重组质粒 .将此反义表达重组质粒 (p MAM- anti- h MMS2 )用改良的磷酸钙法转染人羊膜 FL细胞 ,建立 FL- h MMS2 -细胞系 .比较该细胞系及 FL细胞和转染了空载体 p MAMneo-amp-的 FL细胞 (FL- MAMneo细胞 )的生长速度 ,发现 FL- h MMS2 -细胞系在地塞米松诱导下h MMS2基因表达被反义抑制后导致细胞生长受阻 ,提示 h MMS2基因为细胞生长所必需 .     

慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因克隆与真核细胞表达的研究

目的 为研究慢性粒细胞白血病(CML)的肿瘤基因疫苗，克隆和表达CML的bcr—abl融合基因片段。方法 根据bcr—abl(b3a2)融合基因序列自行设计一对寡核苷酸引物，以CML K562细胞株的总RNA为模板，通过RT—PCR扩增包含bcr-abl融合位点周围450bp的基因片段，并将其克隆进pGEM—T easy载体。经序列测定证实其阅读框架正确后，将bcr—abl融合基因片段正向插入真核细胞表达载体pcDNA3．1。以脂质体介导重组质粒pcDNAbcr—abl转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，用间接免疫荧光法(IFA)检测基因表达情况。结果 成功构建了包含融合位点基因片段的bcr—abl融合基因真核细胞表达载体pcDNAbcr—abl，pcDNAbcr—abl转染的CHO细胞的免疫荧光强度高于K562阳性对照细胞。结论 bcr—abl融合基因片段在真核细胞中能高效表达，pcDNAbcr—abl真核细胞表达载体的构建为进一步研究bcr—abl融合基因在CML防治中的作用奠定了基础。     

hMSH2反义核糖核酸表达质粒的构建

利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）, 特异地扩增HeLa细胞中hMSH2 cDNA的最保守区域, 并将其克隆到TA载体, 从重组质粒两端进行序列分析, 证实为目的片段. 将该目的片段反向克隆到哺乳动物表达载体pREP9的 BamHⅠ和KpnⅠ位点之间, 筛选后得pREP9-hMSH2反义表达重组质粒. 用磷酸钙-DNA共沉淀法将重组质粒DNA及载体DNA分别导入HeLa细胞, 经G418筛选, 扩大培养. 凝胶阻滞实验证实转染有pREP9-hMSH2重组质粒的HeLa-MSH2细胞抽提物中G·T和A·C错配结合蛋白质表达明显降低, 为研究hMSH2基因功能提供了一有效细胞系.     

猪干扰素-γ基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆猪的干扰素-γ基因(PoIFN-γ),构建重组真核表达质粒,转染细胞。方法从猪的肝脏组织中提取出基因组DNA,以其为模板通过长链PCR扩增出干扰素-γ全基因。将猪干扰素γ基因克隆到真核表达载体PCI-neo载体中,组装成真核表达载体PCI-neo-PoIFNγ。利用脂质体转染法将重组载体PCI-neo-PoIFN-γ转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,在G418的存在下进行筛选培养。结果构建出重组真核表达质粒,获得转染细胞系。结论成功克隆了猪的干扰素-γ基因,获得了转染细胞系。     

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的：构建 pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。     

人甲状腺过氧化物酶膜外区基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

摘要 目的：尝试克隆人甲状腺过氧化物酶（hTPO）膜外区基因并构建其杆状病毒表达载体,为其在昆虫细胞中的表达打好基础。方法：PCR扩增hTPO膜外区基因,并将其先后重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,以hTPO-pFastBAC1质粒转染E.coli DH10Bac大肠杆菌,获得重组hTPO杆状病毒表达载体（hTPO-Bacmid）,分别以多种方法鉴定其正确性。结果：经PCR及酶切、基因测序等方法证实得到的重组hTPO-pGEM3zf(+)质粒、hTPO-pFastBAC1质粒和hTPO-Bacmid均与预期相符。结论：成功的克隆了hTPO膜外区基因,并将其正确重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,后者经位点特异性转座整合至Bacmid,成功的构建了重组hTPO杆状病毒表达载体,为进一步实现hTPO在昆虫细胞中的真核表达作好了准备。