抗人NGAL单克隆抗体的制备及其定量检测方法的建立

目的获得抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)特异性单克隆抗体并建立双抗体夹心ELISA免疫定量检测方法。方法通过杂交瘤技术制备了抗人NGAL高亲和力高特异性单克隆抗体,筛选能够结合天然NGAL的单克隆抗体并建立双抗体夹心ELISA系统。以重组人NGAL为检测对象,对系统线性范围、灵敏度、精密度和准确度(回收试验)进行全面分析和评价。通过对肾病患病组和对照组尿液标本检测初步研究其在临床上的分析性能。结果获得了8株能稳定分泌抗人NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,筛选得到F2和G2两株单克隆抗体可用于双抗夹心ELISA免疫检测。本方法线性范围为0～40 ng/ml,灵敏度为4.8 ng/ml,批内变异CV≤10.04%,批间变异CV≤9.76%,平均回收率为101.9%。临床标本检测显示肾病组与对照组有显著差异(P<0.01)。结论本研究制备了高亲和力特异性单克隆抗体并建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法灵敏度、精密度和准确性良好,能够检测体液标本中的天然NGAL蛋白,检测结果与临床基本符合,为其临床应用和推广奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型抗原的ELISA定量检测方法建立

目的:建立柯萨奇病毒A组16型(CA16)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CA16灭活疫苗的研发和生产过程的抗原定量检测。方法:以CA16中和单抗T26H12为包被抗体、NA14B9为标酶抗体,构建定量检测CA16抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对方法的特异性、灵敏度、精密度、准确性、线性和稳定性进行分析。结果:建立了双抗体夹心定量检测CA16抗原的ELISA方法。方法的线性相关系数R2=0.998,线性范围为8～128 ng/ml,定量限度为8 ng/ml;变异系数CV<15%;回收率介于87.0%～113.8%之间;37℃6天的回收率>80%;与CA16以外的其他样本没有交叉反应。结论:构建的CA16抗原ELISA定量检测方法的各项性能符合定量检测需要,可用于CA16疫苗的研发和生产过程的抗原活性的定量检测。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及其应用

目的:制备并筛选HSV-1单抗,建立定量检测HSV-1病毒颗粒抗原的双抗体夹心ELISA方法,用于HSV-1病毒颗粒的质控。方法:以HSV-1免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,以筛选的中和单克隆抗体1F6为捕捉抗体,HRP标记的2B1为检测抗体,构建定量检测HSV-1病毒颗粒抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对本方法的特异性、灵敏度、精密度、准确性和线性等性能进行验证。用本方法定量检测的病毒量与病毒滴度作回归分析。结果:构建的双抗体夹心定量检测HSV-1病毒颗粒抗原的ELISA方法,线性范围为0.125~2μg/ml,相关系数为R2=0.995 5,定量限度为0.125μg/ml,试剂的变异系数CV10%,抗原回收率介于85.6%~107.1%之间。与HSV-1以外的其他样本无交叉反应。本方法检测与病毒感染滴度具有很好的相关性。结论:成功构建了定量检测HSV-1含量的ELISA方法,为HSV-1病毒颗粒抗原定量检测提供快速手段。     

白喉和破伤风类毒素抗原ELISA检测方法的建立

目的建立定量检测白喉和破伤风类毒素抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。方法分别采用白喉、破伤风单抗包被酶标板,兔抗白喉、破伤风多抗作为二抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体作为酶标抗体,以平行线法建立定量检测白喉和破伤风类毒素抗原含量的夹心ELISA法,并进行方法学验证。结果两种定量检测ELISA方法的验证结果均符合规定。检测白喉类毒素抗原ELISA方法的定量限为8.90×10-4Lf/ml,回收率为98.35%,批内变异系数(CV)≤10.59%,批间CV≤13.51%;检测破伤风类毒素抗原ELISA方法的定量限为2.13×10~(-3)Lf/ml,回收率为107.28%,批内CV≤13.96%,批间CV≤10.06%。结论建立了白喉、破伤风类毒素抗原ELISA检测方法,该法特异性强、准确度高、重复性好,可用于白喉破伤风疫苗产品的质量控制和生产过程控制。     

基于光激化学发光技术开发的多表位检测cTnI的方法

目的建立一种多表位识别检测人血清心肌肌钙蛋白水平的光激化学发光免疫检测分析方法。方法采用双抗体夹心法,通过多表位识别建立检测人血清中心肌肌钙蛋白水平的方法,评估其分析灵敏度、回收率和批内精密度,并与Siemens(化学发光法)进行比较。结果心肌肌钙蛋白I的分析灵敏度为0.06 ng/ml,回收率为93.43%,批内精密度(CV)为0.62%~1.55%,与化学发光法的符合率好(r=0.99)。结论光激化学发光免疫分析方法多表位测定心肌肌钙蛋白I具有超高灵敏度、精密度和准确性,与化学发光法的符合率较好,适用于临床。     

重组人干扰素α-2b中残余假单胞菌菌体蛋白定量ELISA检测方法的建立

目的建立假单胞菌菌体蛋白的双抗体夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)定量检测方法,用于重组人干扰素α-2b中残余宿主菌菌体蛋白(HCP)含量的检测。方法采用带有不含干扰素基因空质粒的假单胞菌,按既定工艺发酵纯化并制备HCP,免疫小鼠和白兔后制备抗HCP多抗体,以抗HCP兔抗体为包被抗体,将抗HCP鼠抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)为酶联抗体,建立双抗体夹心ELISA法,并对该方法进行验证及应用。结果所建立的方法线性范围为2.5~80.0 ng/m L,相关系数R20.98,定量限为2.5 ng/m L;检测不同浓度的加样回收样品,回收率为85%~115%,变异系数均10%;与重组人干扰素α-2b和牛血清白蛋白(BSA)均无交叉反应;检测3批供试品,准确度及重现性良好。结论已建立假单胞菌菌体蛋白的双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法线性好,专属性强,灵敏度高,准确度和精密度较高,可用于重组人干扰素α-2b中HCP的质量控制。     

生物膜干涉技术、HPLC及ELISA在抗体定量检测中的比较分析

目的比较3种方法定量检测抗体样品的异同,为抗体药物研发和生产过程中不同类型的样品定量检测选择合适的方法提供依据。方法分别利用生物膜干涉技术、Protein G-HPLC以及双抗体夹心ELISA法建立定量检测抗体样品的方法,比较其检测的准确度、精密度及其检测特点。结果 3种方法检测同一抗体样品的含量基本一致,生物膜干涉技术检测值相对标准偏差最小(CV5%),HPLC次之(CV8%),ELISA法的CV值为5%~15%。结论生物膜干涉技术检测快速,结果精确,通量高,无需样品前处理,适合于样品筛选以及发酵原液、中间品等检测;Protein G-HPLC检测准确,线性范围宽,回收率高,认可度高,适合于样品含量的确证;ELISA法最低检测限值小,操作简单,仪器要求低,适合于微量样品的检测。     

基于光激化学发光技术开发的多表位检测cTnI的方法

目的建立一种多表位识别检测人血清心肌肌钙蛋白水平的光激化学发光免疫检测分析方法。方法采用双抗体夹心法,通过多表位识别建立检测人血清中心肌肌钙蛋白水平的方法,评估其分析灵敏度、回收率和批内精密度,并与Siemens(化学发光法)进行比较。结果心肌肌钙蛋白I的分析灵敏度为0.06 ng/ml,回收率为93.43%,批内精密度(CV)为0.62%~1.55%,与化学发光法的符合率好(r=0.99)。结论光激化学发光免疫分析方法多表位测定心肌肌钙蛋白I具有超高灵敏度、精密度和准确性,与化学发光法的符合率较好,适用于临床。     

人血清PCT直接化学发光免疫分析方法的建立及性能评价北大核心CSCD

目的:建立人血清PCT直接化学发光免疫分析方法并进行性能评价。方法:根据双抗夹心法原理制备磁微粒试剂、吖啶酯-抗体试剂与生物素化抗体试剂,3种试剂与血清PCT抗原反应后形成双抗夹心免疫复合物。利用磁场清洗复合物后,加入预激发液与激发液,化学发光免疫分析仪检测反应的发光强度,方程拟合后计算出样本中PCT浓度,并对线性范围、准确度、精密度、特异性及与干式免疫法试剂盒相关性进行性能评估。结果:本方法空白限为0.01 ng/ml,线性范围为0.02~100.00 ng/ml,准确度为95.65%,批内精密度为5.06%~5.35%,批间精密度为5.44%~5.69%,特异性均在可接受范围内,与干式免疫法试剂盒具有良好的相关性。结论:本方法各项性能指标均达到临床检验质量要求,与临床使用的干式免疫法试剂盒具有良好的相关性,有望实现临床转化应用。     

小鼠抗KLH多克隆抗体的制备及TDAR实验间接ELISA定量检测方法的建立北大核心CSCD

目的:通过制备小鼠抗KLH多克隆抗体,优化反应条件建立KLH特异性抗体ELISA定量分析方法,以期提供一种特异性好、灵敏度高及误差低的TDAR实验检测方法。方法:利用盐析沉淀和亲和层析纯化技术分离和纯化小鼠抗KLH特异性多克隆IgG抗体;以纯化后的抗体作为标准品,建立TDAR实验间接ELISA定量检测方法,并对该方法进行线性范围、特异性、变异系数(CV)及检测限验证。结果:以KLH包被浓度为80μg/ml,山羊抗小鼠IgG/HRP酶标二抗的稀释倍率为1∶20000条件进行间接ELISA定量分析的方法学验证,检测线性范围为390.63~25000 ng/ml,R^(2)=0.9848,线性良好;批内和批间CV均<10%;检测限为194.83 ng/ml。结论:通过制备抗KLH多克隆抗体,并优化实验反应条件来建立间接ELISA定量分析方法,其线性范围、特异性及批内、批间CV均满足实验要求,是一种高灵敏度的TDAR实验检测方法。     

水痘-带状疱疹病毒抗原的ELISA定量检测方法的建立

目的:建立水痘-带状疱疹病毒(VZV)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于质控VZV灭活疫苗研发和生产中抗原含量.方法:以VZV中和单抗5F6C8为包被抗体、8H5D1为酶标抗体,构建定量检测VZV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对本方法的特异性、灵敏度、准确性、线性和稳定性等性能进行分析.结果:建立的双抗体夹心定量检测VZV抗原的ELISA方法,线性范围为0.4 μg～13 μg/ml,相关系数为R2=0.994,定量限度为0.4.μg/ml;变异系数CV＜ 15％、准确性回收率介于87.5％ ～ 111.6％之间,稳定性37℃6天的回收率＞80％.与VZV以外的相关病毒样本没有交叉反应.结论:构建的VZV抗原ELISA定量检测方法的各项性能符合定量检测需要,可用于VZV灭活疫苗的研发和生产过程的抗原含量检测.     

A型肉毒毒素双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的：建立A型肉毒毒素双抗夹心ELISA检测方法。方法：以高亲和力人源抗体ML01作为捕获抗体，以小鼠腹水诱生法制备的鼠源抗体BAS46为检测抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立A型肉毒毒素双抗夹心ELISA检测方法，并评价其灵敏度、重复性、检测线性范围和加样回收率等。结果：A型肉毒毒素双抗夹心ELISA检测法的灵敏度为2.56 pg/ml，变异系数为3.183%～12.030%，线性范围为0.244～62.500 ng/ml，回收率为90%～110%。结论：成功建立了A型肉毒毒素双抗体夹心ELISA检测方法，该方法快速、有效。     

定量检测破伤风类毒素酶联免疫吸附法的建立及初步应用

目的：建立定量检测破伤风类毒素（TT）抗原的双抗体夹心ELISA法,并探索其初步应用。方法：以TT抗毒素为包被抗体,大鼠抗TT多抗为检测抗体,采用相应酶标抗体检测TT抗原含量,建立双抗体夹心ELISA法,并进行方法学验证。结果：TT含量在0～0.062 5 Lf/ml范围内线性关系良好（r>0.99）。该方法与白喉类毒素、百日咳类毒素、百日咳丝状血凝素及百日咳黏附素无明显交叉反应,重复性好,特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求。该法准确检测范围为0.000 625～0.040 000 Lf/ml,定量限度为0.000 625 Lf/ml。采用该方法对TT抗原进行吸附率检测,分别采用该法和絮状单位测定法测定6批TT的絮状含量,2种检测方法高度相关（r=0.94）。结论：建立的定量检测TT的双抗体夹心ELISA法为破伤风疫苗生产过程中TT质量控制提供了有效技术手段。     

人肌酸激酶同工酶MB(质量法)化学发光免疫分析定量检测方法的建立及性能评价

利用化学发光免疫分析技术,建立一种人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)定量检测方法。采用基于化学发光免疫分析的双抗体夹心法(以纳米磁微粒为固相载体包被抗人CK-MB抗体,以另一抗体交联碱性磷酸酶为标记物)研制CK-MB化学发光免疫定量检测试剂盒。并进行一系列性能评估及临床相关性试验。该检测方法的线性范围为(0.1~300)ng/ml;空白限为0.1 ng/ml;批内精密度和批间精密度均小于5%;准确度:添加回收率在(100±5)%以内;在正常人血清中添加100 ng/ml的CK-BB及10000 ng/ml的CK-MM,对测定结果没有产生影响;当样本中存在高浓度的甘油三酯、血红蛋白、胆红素以及RF和HAMA时测试偏差在±15%范围以内;试剂在37℃放置72h后。稳定性良好,各性能指标均达到要求;相关性试验结果r0.98,一致性结果良好。参考值范围为:(0.42~6.34)ng/ml。本研究建立的CK-MB化学发光免疫分析定量检测方法的各项性能指标均达到了临床检测要求,可用于临床血清CK-MB检测。     

双抗体夹心ELISA定量检测重组人干扰素α1b方法的建立与评价

目的 建立双抗体夹心ELISA法定量检测重组人干扰素α1b的方法.方法 筛选具有不同抗原结合位点的抗重组人干扰素α1b单克隆抗体,分别作为包被抗体和辣根过氧化酶标记抗体,建立双抗体夹心ELISA法定量检测不同批次重组人干扰素α1b含量,评价该法的检出限、精确度、重复性、特异性.结果 所建立的ELISA最低检出限为10 ng/ml,检测线性范围10～100 ng/ml,R2 =0.992,测定值与实际值偏差＞5％,板间变异系数均小于10％.结论 该方法灵敏度高,特异性强,准确性和重复性好,可用于重组人干扰素α1b成品的定量检测.     

测定尿激酶含量夹心法ELISA的建立

采用两种识别不同抗原决定簇的抗尿激酶(UK)单克隆抗体建立了测定人 UK 含量的夹心法ELISA.本法灵敏度为0.15ng/ml,批内 CV4.3%,批间 CV8.7%,平均回收率98%.应用本法测定了部分正常细胞和肿瘤细胞株培养上清中的 UK 含量,肿瘤细胞培养上清 UK 量明显高于正常细胞.测定82名正常人血浆中 UK 含量,其结果为1.31±0.6ng/ml.     

D2蛋白酶双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

目的:建立一种定量测定D2蛋白酶的双抗体夹心ELISA方法.方法:用棋盘滴定法确定捕获抗体、检测抗体的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限和定量限;检测该方法的准确性(回收率)、精密性和特异性,并与Bradford法检测结果进行比较.结果:包被抗体和捕获抗体的最佳包被效价分别为1:4 000和1:5 000;检测的线性范围为(28～1180)μg/L,检测限为4.6μg/L.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为5.64%和7.17%,回收率为92.44%～105.26%,与碱性蛋白酶、蛋白酶K等其他蛋白无交叉反应,与Bradford法检测结果具有良好的相关性.结论:该方法灵敏度高,重复性好,为后期D2蛋白酶规模发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

抗人Apo B100单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗人载脂蛋白B100(Apo B100)单克隆抗体(mAb),建立人Apo B100双抗体夹心ELISA检测方法。方法:将人Apo B100抗原免疫小鼠,通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株。将细胞株用无血清培养基扩大培养并纯化上清获得抗体,测定抗体亲和力、亚型、特异性及表位,最后建立双抗体夹心ELISA方法。结果:获得4株抗人Apo B100的杂交瘤细胞株(4-1-2、4-2-2、4-3-2、4-6-3),其分泌的抗体不与其他相关蛋白交叉反应,亲和力达到1×109L/mol。用4-3-2和4-6-3建立的双抗体夹心法的检测范围为(1.3～80)ng/mL,灵敏度1.24 ng/mL,批内变异系数均小于10%,批间变异系数均小于15%,回收率在90%以上。结论:成功制备了抗人Apo B100mAb,建立了定量检测人Apo B100的双抗体夹心ELISA方法,为Apo B100检测及疾病的诊断奠定基础。     

肠道病毒71型抗原含量检测方法的建立及初步验证

目的 建立肠道病毒71型(EV71)抗原含量检测方法并进行初步验证,用于疫苗研制及生产过程中抗原含量的检测.方法 以抗EV71单克隆抗体为包被抗体,酶标抗EV71多克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA方法,以本室自制EV71抗原参考品为定量标准,建立抗原标准曲线,确定定量限度及最佳定量范围,并对该方法的准确度、精密度和特异性进行初步验证.结果 建立了双抗体夹心检测EV71抗原含量的ELISA方法,定量限度为0.23μg/ml,最佳定量范围为7.32～0.23μg/ml,相关系数为R2=0.9976;准确性较好,回收率在90%～110%之间;精密性较好,变异系数小于10%;除与EV71样品有特异性反应外,与其他样品无交叉反应.结论 建立了检测EV71抗原含量的双抗体夹心ELISA方法并进行了初步验证,为疫苗研制过程中抗原含量测定提供了简便、快捷的检测手段.     

蛋白酶K单抗研制及其双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

目的 研制蛋白酶K单克隆抗体并构建定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法 ,用于生物制品中蛋白酶K的检测。方法 用杂交瘤技术制备抗蛋白酶K的单抗,用棋盘法优化ELISA条件,建立定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法,分析其特异性、精密性和准确性。结果 经免疫、融合、克隆、筛选到稳定分泌蛋白酶K单抗的杂交瘤细胞。获得1株阻断蛋白酶K活性的单抗5G6,以5G6为包被抗体、4D3为酶标抗体,构建蛋白酶K定量检测的ELISA方法。本方法线性相关系数R=0.99,线性范围为293.4~2 500 pg/ml;定量限度为293.4 pg/ml;变异系数为CV<15%;回收率介于89.3%~129.2%之间,37℃6 d的回收率>80%;与蛋白酶K以外的其他蛋白无交叉反应。结论 获得阻断蛋白酶K活性的单抗,构建出灵敏、特异的蛋白酶K定量检测方法。