肠道病毒71抗原ELISA检测方法构建及其应用

目的 建立肠道病毒71型(EV71)抗原的ELISA检测方法.用于EV71的抗原定量、TCID50试验及EV71免疫原性与免疫保护性的关系分析.方法 以高亲和力的EV71中和单抗K8G2和Y8H2-HRP构建检测EV71抗原的双抗体夹心ELISA方法.比较本方法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50.分析EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的关系.结果 本试剂定量检测抗原的线性范围为0.125 ～4.0 U/ml,R2 =0.9911,试剂不与EV71之外的受试物反应,试剂的回收率为0.89 ～ 1.16,变异系数小于15％,37℃9 d的热回收率大于85％.本法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50的相关系数r=0.990.21株EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的相关系数r=0.930.结论 构建了EV71抗原ELISA检测试剂,可用于EV71的抗原含量检测、TCID50分析,为特异比活与免疫血清中和性关系研究提供了一些有价值的信息.     

柯萨奇病毒A组16型疫苗免疫后中和抗体检测方法的比较

目的 采用3种方法检测灭活的柯萨奇病毒A组16型(CA16)疫苗的免疫保护性抗体水平,旨在构建评价疫苗免疫保护的检测平台.方法 CA16候选株疫苗(3726,4430和4432)按0、4、6、8周,经腹腔接种小鼠、大鼠和豚鼠,采集0、4、6、8周和10周血样.通过竞争抑制ELISA、细胞微孔病变实验和乳鼠攻毒保护实验评估免疫血清中和抗体水平,利用SPSS16.0软件分析3种检测方法相关性.结果 血清中和抗体在首次加强免疫2周后达到峰值;竞争抑制ELISA和细胞微孔病变实验测得中和效价的相关系数为0.861;竞争抑制ELISA和乳鼠攻毒保护的相关系数为0.8;细胞微孔病变实验和乳鼠攻毒保护的相关系数为0.89.结论 竞争抑制ELISA检测中和抗体与“金标准”相比具有灵敏、快速、大量、低廉等特点,具有广阔的应用前景.     

戊型肝炎病毒核酸阳性血浆经输血传播感染恒河猴的研究

目的了解戊型肝炎病毒(HEV)核酸阳性血浆对灵长类动物的感染性和致病性。方法对抗-HEV IgM阳性而IgG阴性志愿献血员血浆进行HEV RNA检测，并将存在病毒血症献血员的10ml血浆静脉输入健康恒河猴，观察其对恒河猴的感染性和致病性。结果从1份抗-HEV IgM阳性而IgG阴性志愿献血员血浆中分离出HEV基因IV型RNA片段。该份血浆输入恒河猴后，恒河猴出现典型急性肝炎生物化学和病理表现，病毒血症，血清抗-HEV IgM和IgG抗体阳转。结论HEV病毒血癌献血员血浆输入可以引起灵长类动物的HEV感染以及急性肝炎，提示HEV经输血传播的可能性。     

人丙氨酸氨基转移酶(ALT2)的表达、单克隆抗体制备及鉴定

目的:克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT2),以此作为抗原免疫动物获得针对ALT2的单克隆抗体(mAb)株,用于ALT的免疫诊断。方法:通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT2)基因,并将其克隆至pET-28a表达载体中,带有组氨酸标签的ALT2蛋白经镍亲和层析纯化,纯化的ALT2作为抗原免疫小鼠制备mAb,通过Western blot和ELISA方法测定mAb的亲和力和特异性。结果:利用大肠杆菌成功表达ALT2蛋白,以镍亲和层析纯化获得ALT活性超过10 000 U/L的ALT2目的蛋白,以此蛋白免疫小鼠后得到5株mAb。结论:经过初步筛选获得2株高特异性的mAb,为研制ALT2蛋白定量检测试剂提供了重要工具。     

集美大学2002级福建籍新生肝炎感染现状

目的了解集美大学2002级福建籍新生甲、乙、戊3型肝炎感染情况.方法采用血清流行病学调查方法.结果学生中抗HAV-IgG,HBsAg和抗HEV-IgG阳性率分别为77.08%,15.23%,17.15%,地区差异明显;HAV,HEV无性别差异,而HBV以男性为高;农村HAV和HBV感染率均高于城镇,而HEV感染率无城乡差别.结论应该加强对本地区大学生的甲、乙肝预防,急需研究出一种有效的戊肝疫苗.     

人类细小病毒B19核酸检测方法的建立及方法学验证

目的：建立人类细小病毒B19实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测方法,并对该方法进行方法学验证。方法：针对B19病毒三种基因型的高度保守区设计特异性引物和探针,建立B19 Q-PCR标准曲线。并分别从检测限和定量限、型别覆盖能力、特异性、定量范围及定量线性、精密度、回收率、不同机型、以及不同混样模式进行方法学验证。结果：当B19病毒定量参考品范围为2.0×101～1.0×108 IU·mL-1时,R2＞0.99,扩增效率＞97.2%,线性范围相关性良好。定量下限为20 IU·mL-1,检测下限为10 IU·mL-1,针对B19 病毒3种基因型样本均能检出,具有相同的定量下限和检测下限。特异性结果显示,本方法检测甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型、人巨细胞病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、梅毒螺旋体等核酸阳性血浆,均无非特异反应,且在上述病原体存在的情况下,B19病毒的定量下限和检测下限均能稳定检出,不受干扰。回收率结果显示,本方法回收率在50%-150%之间,RSD＜30%。此外,本方法的精密性变异系数均小于3%,在ABI 7500 和伯乐CFX-96 机型上,相关技术指标均能达标。且采用48混和96混检测模式检测终浓度104IU·mL-1和20 IU·mL-1的样本,定量要求符合标准。结论：本方法线性范围广、灵敏度高、特异性和精密度好,回收率高,且可用于不同品牌的荧光定量PCR仪,适用范围广,检测模式灵活,可用于人血浆B19病毒核酸筛查,本研究将为血液制品质量标准提高提供技术储备。     

水痘-带状疱疹病毒抗原的ELISA定量检测方法的建立

目的:建立水痘-带状疱疹病毒(VZV)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于质控VZV灭活疫苗研发和生产中抗原含量.方法:以VZV中和单抗5F6C8为包被抗体、8H5D1为酶标抗体,构建定量检测VZV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对本方法的特异性、灵敏度、准确性、线性和稳定性等性能进行分析.结果:建立的双抗体夹心定量检测VZV抗原的ELISA方法,线性范围为0.4 μg～13 μg/ml,相关系数为R2=0.994,定量限度为0.4.μg/ml;变异系数CV＜ 15％、准确性回收率介于87.5％ ～ 111.6％之间,稳定性37℃6天的回收率＞80％.与VZV以外的相关病毒样本没有交叉反应.结论:构建的VZV抗原ELISA定量检测方法的各项性能符合定量检测需要,可用于VZV灭活疫苗的研发和生产过程的抗原含量检测.     

血小板生成素研究进展

血小板生成素（TPO），即C－Mpl配体，是巨核细胞增殖、成熟，也是血小板产生的主要调节因子。TPO纯化后，TPO各个领域的研究发展迅速。本文综述TPO在基因、蛋白结构，信号转导、表达调控和临床应用等领域的研究进展。     

蛋白酶K单抗研制及其双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

目的 研制蛋白酶K单克隆抗体并构建定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法 ,用于生物制品中蛋白酶K的检测。方法 用杂交瘤技术制备抗蛋白酶K的单抗,用棋盘法优化ELISA条件,建立定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法,分析其特异性、精密性和准确性。结果 经免疫、融合、克隆、筛选到稳定分泌蛋白酶K单抗的杂交瘤细胞。获得1株阻断蛋白酶K活性的单抗5G6,以5G6为包被抗体、4D3为酶标抗体,构建蛋白酶K定量检测的ELISA方法。本方法线性相关系数R=0.99,线性范围为293.4~2 500 pg/ml;定量限度为293.4 pg/ml;变异系数为CV<15%;回收率介于89.3%~129.2%之间,37℃6 d的回收率>80%;与蛋白酶K以外的其他蛋白无交叉反应。结论 获得阻断蛋白酶K活性的单抗,构建出灵敏、特异的蛋白酶K定量检测方法。     

氢氧化铝佐剂对重组大肠杆菌表达的戊型肝炎239抗原的吸附研究

目的:探索氢氧化铝佐剂对重组大肠杆菌表达的戊型肝炎239抗原(HEV239)的吸附力种类以及在戊肝疫苗制备研究中的应用。方法:用兰格缪尔吸附方程计算在不同浓度氯化钠(NaCl)或乙二烯乙二醇(EG)条件下,HEV239在氢氧化铝佐剂表面的最大吸附量(Γm),根据Γm随NaCl或EG浓度变化趋势判断吸附作用力的种类。配制添加多羟基化合物且含不同浓度磷酸盐的试验疫苗,计算Γm并绘制其随磷浓度变化的曲线。ELISA法定量检测并计算含不同浓度磷的试验疫苗与羊淋巴液作用12h后抗原的吸附率。结果:HEV239的Γm随离子强度(NaCl浓度)或疏水物质浓度(EG体积)增加而降低,也随磷酸盐浓度增加而降低。疫苗在羊淋巴液中的抗原吸附率随磷酸盐浓度增加而降低,最终达到稳定水平。结论:HEV239在氢氧化铝佐剂表面的吸附受到静电引力和疏水作用力的双重影响。利用此机理向疫苗中添加磷酸盐和多羟基化合物可降低疫苗抗原在制剂中的吸附量和在羊淋巴液中的吸附率。