巢式聚合酶链式反应检测布鲁氏菌核酸DNA方法的建立

目的建立一种具有灵敏性高,特异性强的巢式聚合酶链式反应(PCR)方法检测血液标本中布鲁氏菌核酸DNA。方法使用细菌基因组提取试剂盒提取纯菌核酸DNA;使用血液等组织基因组核酸DNA提取试剂盒提取血液标本核酸DNA,对提取的核酸DNA先行常规PCR预扩增,以扩增的PCR产物为模板进行荧光定量PCR第二次扩增(即巢式PCR)。对纯菌提取的核酸DNA进行灵敏度和和特异性测试,构建巢式PCR的Ct值与核酸DNA拷贝数之关系曲线;检测临床血液标本核酸DNA,同时比较常规两种PCR方法检测结果。结果常规PCR检测的灵敏度为512个核酸DNA拷贝数;巢氏PCR检测有效范围为921.6 ng/μl^6.8 fg/μl,对应的Ct值为12.04~37.50,其指数关系为:y=(e-0.695x)×1012;R2=0.9986,巢式PCR扩增效率为2.28×109倍,检测限为2个布鲁氏核酸DNA拷贝数。巢式PCR的灵敏度为91.67%,特异度为93.10%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为93.10%。对一起羊养殖场采集的25份血液标本应用巢式PCR方法检测,结果阳性率为92.00%(23/25);27份健康人群血液标本没有检测出(无Ct值)。结论巢式PCR具有较好的灵敏性和特异性,特别适合于血液标本布鲁氏菌核酸DNA的检测。     

阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR 检测方法的研究

目的 建立阪崎肠杆菌的TaqMan PCR检测方法。 方法 将阪崎肠杆菌的菌悬液连续10倍稀释后与健康人新鲜粪便混匀,制备成1.2100 ~ 1.2108 cfu/ml梯度浓度的粪便模拟标本并提取DNA,用以评价阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性。 结果 实时荧光TaqMan PCR法对阪崎肠杆菌粪便模拟标本的检测灵敏度为1.2103 cfu/ml; 其线性检测范围为:1.2103 ~ 1.2108 cfu/ml;在稳定性评价中,对含菌量为1.2108、1.2106和1.2104 cfu/ml的粪便模拟标本进行实时荧光TaqMan PCR法重复检测10次,结果显示扩增反应Ct 值的变异系数(CV)为0.65%~1.47%;在特异性评价中,除了阳性对照其余样本均未见特异性扩增曲线。 结论 本研究建立了阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR法。     

肺炎链球菌多重巢式荧光PCR分型方法的建立和应用

目的建立一种敏感且节省标本的多重巢式荧光PCR方法，用于临床标本中肺炎链球菌的分型。方法以检测肺炎链球菌种属（lytA基因）和20组常见血清型的引物和探针为基础，分别采用92株不同血清型的肺炎链球菌菌株和系列稀释的参考DNA模板，建立多重巢式荧光PCR方法。 评价该方法的特异性和敏感性，同时与荧光PCR方法进行比较。 将该方法用于14份肺炎链球菌培养阳性和30份肺炎链球菌培养阴性的临床标本的检测，评价实际应用效果。结果多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法能准确鉴定/区分大部分菌株（90/92）的血清型。 前者的检测灵敏度为1～100 fg/μl，9种血清型的灵敏度高于荧光PCR方法（10～100 fg/μl）。 44份临床标本中，多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法分别检测出34和31份阳性（P＝0.778），2种方法的DNA模板使用量分别为15 μl和66 μl。结论多重巢式荧光PCR比荧光PCR方法节省标本且更加灵敏。     

侧流层析–重组酶聚合酶扩增技术快速检测土拉弗朗西斯菌

目的利用侧流层析–重组酶聚合酶扩增（LF-RPA）技术建立快速、敏感、特异的土拉弗朗西斯菌（土拉菌）检测方法。方法基于土拉菌特异性基因（tul4）设计重组聚合酶恒温扩增方法的引物及探针,优化反应时间和温度,同时评价该方法的灵敏度及特异性,并通过模拟血液样品评估此方法的实用性。结果该方法最佳反应条件是40 ℃,20 min,可检测核酸浓度最低为20 fg/μl,与实时荧光定量PCR（qPCR）方法相近,且不与7种非土拉菌发生交叉反应。 土拉菌模拟样本最低检测浓度为460 CFU/ml。结论该检测方法操作简单,特异性良好,敏感度高且无需大型精密实验设备,在临床及现场检测土拉菌中具有应用前景。     

外周血淋巴细胞布鲁氏菌核酸DNA检测的实验研究

目的基于目前布鲁氏菌病诊断现状,针对试管凝集滴度小于1∶100且布鲁氏菌病相应症状未持续1年患者,探讨其外周血淋巴细胞中布鲁氏菌DNA用于临床诊断的可能性。方法收集患者的血液,分离其外周血淋巴细胞和血清,分别提取其核酸,利用布鲁氏菌鉴定引物B4/B5进行普通PCR扩增,检测患者体内是否存在布鲁氏菌DNA。结果2017年1月1日至2018年2月28日期间共收集布鲁氏菌病患者血液样本278份,其中82份样品试管凝集检测滴度为小于1∶100,且患者病程未持续1年。 82份样品中分离自患者外周血淋巴细胞核酸中检测到布鲁氏菌核酸阳性样品为50份,而对应血清布鲁氏菌核酸阳性样品为15份,两者差异有统计学意义（P＜0.05）。 在血清抗体5个滴度段中SAT阴性、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200,SAT阴性组患者全血淋巴细胞中布鲁氏菌核酸DNA检测率最高,1∶200组患者血清布鲁氏菌核酸DNA检出率最低。结论全血外周血淋巴细胞核酸布鲁氏菌DNA检测可用于血清抗体检测阴性患者的初步诊断,为布鲁氏菌病的诊断提供新的补充方法。     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

应用实时荧光定量PCR方法检测血小板制品细菌污染

目的应用实时荧光定量PCR方法检测血小板制品中细菌的探讨。方法选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏杆菌,用改良的Chelex-100法抽提细菌基因组DNA,进行荧光定量PCR检测。并应用过滤法去除反应体系中潜在的细菌及其基因组DNA污染。结果针对16srRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,与人类淋巴细胞及病毒等的基因组无交叉反应。在金黄色葡萄球菌检测中,应用过滤法后最低含菌量组与阴性对照组Ct值有极显著差异(P<0.001)。该方法对金黄色葡萄球菌的最低检出量为0.3CFUs/PCR,与阴性对照Ct值有显著差异(P<0.01),在大肠埃希氏杆菌中该法可检测出0.1CFUs/PCR,与阴性对照Ct值有显著性差异(P<0.01)。结论改良Chelex-100法抽提细菌基因组及后续的荧光定量PCR分析用于检测血小板制品中的细菌污染,检测实验缩短到3-4h,操作简单,灵敏性高,特异性好,为在临床标本大规模检测中的应用提供理论基础和实验数据。     

实时荧光PCR检测结核杆菌DNA的分析灵敏度验证及临床应用

目的以结核杆菌DNA检测为切入点,建立实时荧光PCR定性方法分析灵敏度验证的方法并进行评价。方法取5个低浓度标本分别平行检测16次,计算每个标本的检出率,分别以浓度的对数(以10为底)、Ct值和检出概率作曲线拟合,得到结核杆菌DNA荧光PCR检出率为50%和95%所对应的浓度及Ct值,并据此建立结果报告策略。以巢式PCR和实时荧光PCR同时检测52例临床标本,评价所建立的结果报告策略的适用性。结果结核杆菌DNA检出率为50%和95%所对应的浓度分别为69copy/mL,2.46×10~3 copy/mL。所建立的结果报告策略为结果大于2.46×10~3 copy/mL时报告阳性,结果小于2.46×10~3 copy/mL而大于69copy/mL时进行复查,如果复查为阳则报告阳性,如果复查结果为阴性时报告为阴性,结果小于69copy/mL报告为阴性。52例临床标本经检测后,荧光PCR检出6例阳性,巢式PCR检出4例阳性,计算kappa值经u检验(kappa=0.78,u=3.58,P0.05)表明两种方法报告的结果具有良好的一致性。结论依据检出概率-浓度曲线制定结核杆菌-DNA荧光PCR定性方法结果报告策略具有较好的临床适用性,依据最低检出限制订结果报告策略可应用于基于定量数据的定性PCR。     

实时荧光定量PCR方法检测青藏高原喜马拉雅旱獭血样中布鲁氏菌DNA

  目的   应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法检测青藏高原喜马拉雅旱獭血样中布鲁氏菌DNA。  方法   2019—2020年收集青海省青藏高原喜马拉雅旱獭全血,进行布鲁氏菌病血清学试验,包括虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）微量法、胶体金免疫试验（GICA）,阳性标本进行real-time PCR检测。 分析real-time PCR方法的灵敏度、特异度等指标,评价其结果的准确性。  结果   共收集全血1 466份,RBT检出阳性64 份,GICA检出阳性28份,SAT检出阳性18份。64 份RBT阳性标本进行real-time PCR检测,其中56份标本及阳性对照菌株有特异的荧光扩增曲线,8份标本及阴性对照无特异的扩增曲线。 real-time PCR与SAT、GICA比较灵敏度为100%,与RBT比较特异度为99.93%,Kappa值为0.81,高度一致。  结论   与传统方法相比,real-time PCR方法具有快速、特异等优点,可以用于青藏高原喜马拉雅旱獭样本检测。     

高灵敏度等温扩增法可视化检测血液中的病毒核酸

目的探讨便携式、可灵敏、快速检测血液标本中病毒核酸的方法。方法以HBV病毒为例,针对其基因组保守序列设计特异性引物,采用环介导等温扩增法(LAMP)对待测HBV标本做核酸目标序列扩增,以高灵敏双链DNA嵌合荧光染料为指示剂,根据荧光信号指示扩增反应产物的有无;将本法与实时荧光PCR法对临床标本做HBV检测的对照分析。结果建立了血液病毒核酸的可视化检测方法,研制出扩增检测一体化仪器;灵敏度达到可在<1 h完成10 cp/管的HBV核酸扩增反应和产物检测。62例实时荧光PCR检测为HBV阳性的临床标本,本法亦都检测为阳性;而从42例实时荧光PCR检测为HBV阴性的临床标本中,本法检出了6例HBV阳性。结论所建立的方法和装置可实现高灵敏度单管快速检测血液病毒核酸,为特殊现场环境中的血液安全性筛查提供了新的手段。     

Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the omp25 gene for rapid detection of Brucella spp

A novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was established to detect Brucella species DNA in milk and blood samples of animals and humans. This LAMP assay based on the sequence of highly repetitive omp25 gene was able to detect 9fg/μl Brucella spp. DNA with high sensitivity, which was 10 times higher than the nested PCR. The LAMP was evaluated for its specificity using 19 strains of six Brucella species and 28 related non-Brucella micro-organism strains as controls. The target 19 Brucella strains were all amplified, and no cross-reaction was found with all the non-Brucella micro-organism strains. Both nested PCR and LAMP assays were then used to detect Brucella spp. DNA in 78 milk samples and 113 blood samples from animals and 11 blood samples from humans, and the established LAMP assay yielded 99.0% concordance rate with the nested PCR. The LAMP assay should be a potential tool with high convenience, rapidity, sensitivity and specificity for the diagnosis of Brucellosis.     

食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究

目的 利用叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide,EMA）实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术,建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法。方法 根据志贺菌ipaH基因保守序列设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件。用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性。用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性。同时用本研究方法和常规分离培养法,对30件模拟样品进行实样验证。结果 志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值（Ct）=32.10~3.19log（菌量）（R2=0.994）。最低检测浓度为2.20 CFU/反应。对死菌DNA抑制效率99.97%。31株志贺菌Ct值最低为15.04,最高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均35或无Ct值（呈一条直线）。重复试验Ct值变异系数3。30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致,但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5 h,而常规分离培养方法则需要3～5 d。结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法,建议在食品检测中推广应用。     

利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测人及动物粪便中的沙门菌

目的为了快速检测、鉴定沙门菌属细菌,提高食源性疾病暴发应对能力,本研究建立了针对沙门菌属的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法,并对其特异性、敏感性和检测下限进行评价。方法筛选针对沙门菌的属特异基因,并建立该基因的qPCR检测体系,利用肠道不同种属细菌、不同亚种及血清型沙门菌属细菌、动物及人粪便样本评价该体系的特异度、灵敏度及检测下限。结果获得沙门菌的属特异基因ttrA,建立基于该基因的qPCR检测方法。发现该方法对纯DNA的最低检测下限为2拷贝/反应。对沙门菌属以外的肠道致病菌无扩增,对1 100株不同亚种及血清型的沙门菌的扩增结果均为阳性,对150份沙门菌致腹泻患者的粪便增菌液和210份动物带菌粪便增菌液均检测阳性。结论本研究建立的基于单一基因的沙门菌属快速分子检测方法具有特异度高、灵敏度高的特点,可用于快速筛查、鉴定沙门菌及由其引起的感染性腹泻。     

实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在肺结核诊断中的应用价值。方法应用FQ-PCR对临床诊断肺结核及其他肺部疾病患者的临床标本进行结核分枝杆菌DNA定量检测,同时与涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法作比对。结果 189例临床诊断肺结核患者FQ-PCR检测123例阳性,提示敏感度为65.1%(123/189),而涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法分别为40.2%(76/189)、63.5%(120/189)。94例其他肺部疾病患者及20例健康对照者FQ-PCR检测均为阴性,特异度为100.0%。结论 FQ-PCR敏感度和特异度均高,检测过程简单、易标准化、全过程仅需4～5h,可用于结核病的快速诊断。     

Development of a polymerase chain reaction assay to detect the presence of Streptococcus pneumoniae DNA

In this study, we have developed a chemically sensitive and specific polymerase chain reaction (PCR) assay to detect the presence of Streptococcus pneumoniae genomic DNA. The target DNA sequence was a 322-base pair segment of the S. pneumoniae DNA polymerase I gene (pol I). PCR products of pure cultures of a set of pneumococcal serotypes commonly associated with human infection could be amplified in water and in blood cultures of clinical isolates containing S. pneumoniae. We were able to detect 2 fg of purified S. pneumoniae DNA. There were no false-positive reactions when the assay was performed on samples containing the following clinically encountered bacteria: Haemophilus influenzae type B, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas spp. nontypeable H. influenzae, Staphylococcus aureus, coagulase-negative staphylococci, and Streptococcus pyogenes. The addition of EDTA and citrate-anticoagulated whole blood to the PCR reaction mixture inhibited the PCR assay, whereas the addition of lithium heparin, sodium heparin, and sodium polyanetholesulfonate-anticoagulated whole blood to PCR reaction mixture did not interfere with the ability to detect the presence of S. pneumoniae DNA.