人类流感病毒多重PCR分型方法的建立

目的建立一种可以同时检测人类A型流感病毒,B型流感病毒及A型流感病毒H1,H3,H5亚型的多重RT-PCR方法。方法根据人类流感病毒的特异性基因设计并合成多对特异性引物,建立可同时扩增出人类流感病毒亚型特异性片段的多重PCR的方法。同时,对该方法的特异性和敏感性进行了评价,并利用该方法对39份疑似swineH1N1的临床标本进行检测。结果该方法可同时扩增出A型流感病毒M基因203bp,B型流感病毒M基因296bp,A型流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为362bp（H1）,112bp（H3）,188bp（H5）,494bp（swineH1）。该实验最低可检测新甲型H1N1（A/Beijing/501/2009）病毒RNA0.5TCID50。该方法的特异性实验结果显示,在多重PCR检测中未检出非特异扩增的PCR产物。同时,使用该方法从39份疑似新甲型H1N1的临床咽拭子标本中检测出新甲型H1N1阳性的标本4份（10.2%）,季节性H1N1亚型2份（5.1%）,H3N2亚型12份30.7%,本次实验结果与WHO通过实时PCR方法检测的结果一致。结论本研究建立的多重PT-PCR方法快速、敏感,特异性强,可用于人类流感病毒的分型检测。     

3种重要脑炎病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

目的:建立针对西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalomyelitis virus,VEEV)和亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)的多重RT-PCR检测方法.方法:分别针对WNV的NS1基因、VEE的NSP2基因和HeV的G基因设计3对引物,建立了同时检测WNV,VEEV和HeV的多重RT-PCR方法.以不同滴度的病毒评估该检测方法的敏感性,同时以中国地区流行的与脑炎相关的黄病毒属和甲病毒属成员为模板验证该检测方法的特异性.结果与结论:所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增WNV,VEEV和HeV的454 bp,541 bp和723 bp基因片段,敏感度分别达到10 PFU/ml,100 PFU/ml和100 fg/ml;而对中国流行的与脑炎相关黄病毒和甲病毒如日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的扩增均为阴性.结果表明所建立的多重RT-PCR敏感性和特异性良好,可用于3种脑炎病毒的快速鉴定和甄别.     

应用一步和套式PCR法检测SARS患者标本中的SARS病毒核酸序列

目的：建立敏感、特异和快速的针对SARS病毒的RT-PCR方法，为SARS的早期诊断及防治提供依据。方法：采用一步和套式PCR法对SARS患者不同标本中的SARS病毒RNA进行扩增及序列测定。结果与结论：应用外引物和内引物可分别扩增出约380bp和150bp的单一条带，其大小与预期的相一致。应用套式PCR可使检测敏感性从l0-6提高到lO-15。采用这种方法从SARS患者粪便、痰、鼻咽拭子和血液标本中均可扩增出与预期大小一致的条带，且测序结果显示该扩增片段为SARS病毒的特异序列，表明本研究建立的RT-PCR方法敏感、特异，可用于SARS的快速检测.．     

基于多重PCR的呼吸道病毒纳米孔测序快速检测的方法学研究

目的 通过对多重PCR扩增条件的优化和纳米孔测序中病原微生物检测特异性及灵敏度的评价,建立一种由多重PCR和纳米孔测序技术相结合的检测技术体系,满足对呼吸道病毒现场快速检测鉴定的需求。方法 首先针对呼吸道病毒设计特异性引物,其次优化PCR扩增条件,建立快速测序体系,最后对不同浓度的病原体进行扩增与测序鉴定,评价检测体系的灵敏度。结果 优化后的多重PCR检测体系在退火温度为55℃、引物添加浓度为0.1μmol/L时,可同时检出25种呼吸道病毒,检测灵敏度可达1×10⁴拷贝/ml,整体检测时间在4 h以内。结论 该方法简单快捷,能够实时获取扩增片段的序列信息,特异性强,灵敏度较高,有望为呼吸道病原体的快速筛选和现场检测鉴定提供有力技术支撑。     

小婴儿社区获得性呼吸道感染的病毒源性观察

目的探讨社区获得性呼吸道感染的小婴儿病毒流行情况。方法收集社区获得性呼吸道感染小婴儿215例,抽静脉血3 mL,离心分离血清1 mL送检,进行呼吸道感染病原体的九联检以及优生十项等,即采用间接免疫荧光法,通过荧光显微镜观察结果,可同时检测人血清中呼吸道感染的主要病原体的IgM抗体。可检出的病毒包括：呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型以及风疹病毒、巨细胞包涵体病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等。记录各种病毒的检出情况,进行统计学分析。结果呼吸道合胞病毒阳性率为17.67%（38/215）,腺病毒阳性率为8.37%（18/215）,副流感病毒Ⅰ阳性率为2.33%（5/215）,副流感病毒Ⅱ阳性率为1.40%（3/215）,风疹病毒阳性率为1.86%（4/215）,巨细胞包涵体病毒阳性率为9.77%（21/215）,单纯疱疹病毒阳性率为1.40%（3/215）,细小病毒阳性率为0.93%（2/215）。结论在社区获得性呼吸道感染的小婴儿中,病毒感染占有一定比例。     

基因芯片技术检测10种烈性RNA病毒

目的 利用基因芯片技术检测包括披膜病毒科甲病毒属、黄病毒科黄病毒属、布尼亚病毒科汉坦病毒属及SARS病毒等10种烈性RNA病毒。方法 设计了甲病毒属的属保守区通用引物和黄病毒属的通用引物,与布尼亚病毒及SARS病毒的引物一起用于扩增靶核酸。另外,在通用引物所能扩增的区域内设计每种病毒的特异引物,利用该引物通过PCR反应制备cDNA克隆探针,在判定其特异性后,制备氨基化探针。对探针浓度、杂交温度、杂交时间、不同杂交液及杂交后芯片的洗涤方法进行了优化。结果核酸探针浓度为0．3ug／ul时,可获得杂交信号;在杂交液终浓度含20％甲酰胺、杂交60℃、1．5h的条件下,可分别获得以上10种病毒的特异杂交信号。利用多重PCR扩增靶序列时,可获得2种或4种混合病原体的特异性杂交信号。结论 利用基因芯片技术检测病毒性病原体是可行的,关键在于设计合适的引物及探针序列。     

6种核酸提取试剂盒对甲型H1N1流感病毒核酸提取效果的比较

目的研究5种国产病毒RNA提取试剂盒对甲型H1N1流感病毒检测的相对效率、耗时和成本,为各级实验室甲型H1N1流感病毒核酸提取检测提供技术参考。方法对滴度为105pfu/ml的甲型H1N1流感病毒参考株悬液作10-1~10-4系列稀释,采用德国Qiagen公司的QIAamp Viral RNAMini Kits和5种国产试剂盒对上述样本进行核酸提取,用复合探针实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对其提取效率进行平行检测,分析5种国产试剂盒与QIAamp Viral RNA Mini Kits提取效率的差异,同时对试剂盒提取时间及价格进行比较。结果对不同稀释度流感病毒样本的提取检测,各试剂盒存在显著差异,均以QIAamp Viral RNA Mini Kits提取效率最高。综合提取效率、耗时及成本等因素考虑,B试剂盒性价比最高。结论不同核酸提取试剂盒对病毒核酸的提取,可影响RT-PCR的检测效果,各实验室应根据自身条件及试验目的,合理选择性价比较高的试剂盒对临床样本进行核酸提取。     

支气管哮喘发作与病毒感染的关系

目的　探讨支气管哮喘发作与病毒感染的关系。方法　 62例支气管哮喘发作期患者于住院当日采集 2ml静脉血 ,采用酶联免疫吸附试验进行呼吸道病毒病原体检测。结果　呼吸道合胞病毒 (RSV)、腺病毒 (AdV)阳性率最高 ,分别为 3 0 .5 %、2 7.4%,其次为柯萨奇病毒(CVB)、EB病毒 (EBV) ,分别为 11.3 %、6.5 %,埃可病毒 (ECHOV)为 4.8%,副流感病毒 (PIV)及流感病毒B(IVB)均为 1.6%,流感病毒A(IVA )为 0 %。结论　提示腺病毒 (AdV)、呼吸道合胞病毒 (RSV)、柯萨奇病毒 (CVB)、EB病毒 (EBV)是最主要的导致哮喘急性发作的病原体。     

实时RT-PCR检测甲型H3N2流感病毒R292K耐药位点

目的建立快速检测甲型H3N2流感病毒神经氨酸酶（NA）奥司他韦耐药突变位点的实时RT-PCR方法。方法通过设计特异性靶向NAR292K突变位点的Taq-MGB探针进行实时RT-PCR反应,并利用模拟样本和临床标本进行灵敏性和特异性评价。结果与结论建立了快速检测NAR292K位点的实时RT-PCR检测方法;本方法灵敏性高,可检测低至500拷贝/μl;特异性好,与无耐药突变的甲型H3N2流感病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,为流感耐药监测提供了有效工具。     

原料血浆和凝血因子类产品中人细小病毒B19污染情况调查

目的：检测混合原料血浆和凝血因子类产品中人细小病毒B19（human parvovirus B19,B19病毒）核酸,分析我国原料血浆及凝血因子类产品中B19病毒的污染情况。方法针对B19病毒的保守区域NS1区合成引物及探针,采用TaqMan实时定量PCR法检测混合原料血浆和4类凝血因子类产品中B19病毒核酸。结果混合原料血浆的B19病毒核酸的阳性率为59．49％（116／195）,最高浓度可达1．35×1010拷贝／ml。因子Ⅷ、凝血酶、纤维蛋白原以及凝血酶原复合物的阳性率分别为93．55％（29／31）、100％（10／10）、85．71％（6／7）和88．89％（8／9）。结论我国混合原料血浆与凝血因子类产品中B19病毒的污染率较高,有必要进行原料血浆的B19病毒筛查,对于保障血液制品的病毒安全性具有重要意义。     

假病毒在丙型肝炎病毒研究中的应用

进行丙型肝炎病毒（HCV）研究的困难之一是缺乏方便实用的细胞培养体系，难以分离到大量的HCV。HCV假病毒是目前研究HCV感染早期阶段即病毒吸附、受体结合及与细胞膜融合等较理想的HCV替代模型。本文综述了HCV假病毒的构建方法及重要应用价值。     

含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备

目的：利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒（Marburg virus）、扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire Ebola virus）、苏丹型埃博拉病毒（Sudan Ebola virus）、拉沙热病毒（Lassa fever virus）和黄热病毒（Yellow fever virus）5种烈性病毒核酸片段的假病毒,为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法体外合成该5种病毒的目的基因片段,通过融合 PCR 技术将5个片段连接成一条基因,然后克隆到慢病毒表达载体上,并与其辅助载体共转染293T细胞;转染后分别于48、72 h 收集培养上清,用 DNase 和 RNase 进行消化处理及纯化浓缩,最后提取核酸,利用普通PCR 和实时荧光定量 PCR 鉴定假病毒是否包装成功。结果测序结果表明,体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中;载体转染293T 细胞后收集上清中的假病毒,提取核酸经上述两种 PCR 鉴定均可特异性检测到靶基因,表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。     

痘苗病毒检测方法的建立

目的：建立痘苗病毒的检测方法。方法：采用细胞病变法观察痘苗病毒感染的HeLa细胞，通过电镜直接观察病毒颗粒的形态特征，观察鸡胚绒毛尿囊膜上形成的痘斑并用分子生物学方法分析痘苗病毒HA基因片段。结果与结论：痘苗病毒感染HeLa细胞34h后出现典型细胞病变。在病毒感染细胞47h后的培养上清和胞浆中均可通过电镜观察到病毒颗粒。感染的鸡胚绒毛尿囊膜上出现痘宽。进一步采用PCR法扩增病毒的HA基因，RFLP限制性内切酶片段多态性分析和序列测定证明该序列与已知序列一致。所建立的痘苗病毒系列检测方法。为天花相关病毒的实验室诊断奠定了基础。     

登革病毒的感染及复制研究进展

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属,是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒。其包膜蛋白E与细胞受体的结合介导病毒进入细胞,随后在感染细胞浆内复制。随着对非结构蛋白的深入研究,发现NS1、NS2A、NS3、NS4A及NS5蛋白均参与了病毒复制合体的形成,在成熟病毒颗粒的最终形成过程中,需要NS2B／NS3蛋白酶对C蛋白前体的切割及缩主细胞的糖基转移酶对prM、E蛋白糖侧链的正确加工。本文综述了登革病毒受体、病毒的复制及装配过程等方面的最新研究进展。     

戊型肝炎病毒感染的血清流行病学研究

用检测戊型肝炎病毒持异性抗体抗-HEV的试剂盒,检测了206份戊型肝炎病人的急性期血清,17份散发性非甲非乙型肝炎病人的急性期血清,20份甲型肝炎病人急性期血清及30份健康人血清。抗-HEV的阳性率分别为90.8%,5.9%,0.0%和O.0%。表明戊型肝炎病人的急性期血清普遍存在抗-HEV,首次从血清学上证实了我国存在戊型肝炎病毒感染,并且可以看出散发性非甲非乙型肝炎中,约有5.9%属于戊型肝炎。     

微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立

目的建立特异、敏感、实用的登革病毒Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎病毒及黄热病毒检测及分型方法。方法在系统分析上述病毒基因组序列基础上,分别设计针对6种病毒的特异性包被探针,扩增、克隆、测序后包被聚乙烯微孔板。随后设计检测用PCR引物,并于引物5′端标记生物素,对待检样品进行扩增后用检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并对包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间等反应条件进行优化。结果初步建立了微孔杂交快速检测上述病毒的方法,试验结果直观,阳性标本吸光度(A)值在0.5以上,阴性结果A值在0.1以下,S/N值在10.0以上。结论PCR-ELISA方法敏感、特异,为上述病毒的快速诊断提供了新的方法。     

埃博拉病毒生物学特性研究进展

埃博拉病毒病是一种能够引发埃博拉出血热的人畜共患烈性传染病。2014年蔓延西非三国的埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）已经成为全球性公共卫生新的重大威胁。该文综述了EBOV的结构特征、传播特点、作用方式、动物模型等方面的研究进展,旨在对EBOV生物学特性的全面了解及针对该病新型疫苗和抗病毒药物的研制奠定基础。     

我国登革2型病毒prM-E基因与SFV病毒载体重组RNA的构建

目的：构建我国登革２型病毒４３株ｐｒＭ－Ｅ基因的甲病毒（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ,ＳＦＶ）重组ＲＮＡ,为登革新型疫苗的研究奠定基础。方法：首先将含有多种稀有限制酶位点的接头插入ｐＳＦＶ载体的多克隆位点,再把ｐｒＭ－Ｅ基因克隆至该载体中。将获得的重组质粒ＤＮＡ经体外转录后,通过电穿孔法将其转录的ＲＮＡ产物导入宿主细胞,并采用间接免疫荧光法检测ｐｒＭ－Ｅ基因的表达。结果：已获得含多种酶位点的ｐＳＦＶ病毒载体,并且所构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ,在宿主细胞中的表达产物可与登革２型病毒特异抗体起反应。结论：构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ可表达我国登革２型病毒株的特异蛋白。     

乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒检测及其意义

目的分析传染病乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒4项检测结果,分别探讨其在入院患者诊断中的意义。方法对3560例住院患者的传染病4项检测结果进行回顾性分析,所有患者均采用酶联免疫法检测HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、梅毒抗体实验进行检测,分析检查结果。结果 （1）4项检测结果中,HBsAg、抗-HCV阳性率最高,分别为9.12%、5.73%;其次为梅毒（0.76%）、抗-HCV＋HBsAg（0.45%）,无HIV感染病例。（2）以感染科（26.81%）、烧伤科（21.94%）最多,其次为妇产科（15.07%）、创伤科（11.00%）、外科（6.8%）、内科（6.5%）、儿科（5.6%）。结论传染病4项阳性率在住院患者中较为常见,及时检查能降低医源性阳性率,避免发生医疗纠纷,减少医院内感染。