人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究

目的探讨人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法经1%TritonX100、0.01%胰酶0.02%EDTA、DNaseI及RNaseI处理制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性;人骨髓基质干细胞体外分离、培养、扩增后种植在去细胞瓣叶表面,观察细胞生长情况。结果猪主动脉瓣叶去细胞后获得完整无细胞的纤维网状支架,瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率差异无统计学意义(P>0.05);体外培养的人骨髓基质干细胞(MSCs)在去细胞瓣叶表面形成一层基本连续的细胞层。结论去除细胞成分的猪主动脉瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

应用猪主动脉去细胞瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜

目的　探讨应用猪去细胞瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。　方法　采用去垢剂、渗透压改变和核酸酶消化的方法制备猪主动脉瓣去细胞瓣膜支架 (实验组 ) ,用去内皮细胞主动脉瓣作对照 (对照组 ) ,并对两组含水量、可溶性蛋白含量、热皱缩温度、力学性能和组织相容性进行测定。培养犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞 ,将其种植于实验组去细胞支架上 ,观察细胞生长情况 ,并测定内皮细胞合成前列环素的功能。　结果　实验组瓣膜细胞成分完全从瓣膜中去除 ,与对照组新鲜瓣膜相比 ,含水量增高 (P<0 .0 5 ) ,可溶性蛋白含量减少 (P<0 .0 5 ) ,热皱缩温度和抗张强度无明显变化。实验组瓣膜组织相容性试验显示 ,材料组织相容性好 ,体内降解时间为 10周 ;犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞在瓣膜表面生长良好 ,内皮细胞具有合成分泌前列环素的功能。　结论　采用去垢剂、渗透压改变和核酸酶消化的方法制备猪主动脉瓣去细胞瓣膜支架 ,在去除细胞和可溶性蛋白质的同时保持了瓣叶的基本结构和力学性能 ;以其为支架体外构建组织工程心脏瓣膜的细胞不仅能在材料表面生长 ,还能合成、分泌血管活性物质 ,是具有生理功能的组织工程心脏瓣膜。     

去细胞猪主动脉瓣支架及兔骨髓干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉瓣支架(ace llu larized porc ine aortic va lve scaffo ld,APAV S)与兔骨髓干细胞(bone m arrow strom a l ce lls,BM SC s)体外构建组织工程瓣膜的可行性。方法采用去垢剂+核酸酶消化法处理,去除猪主动脉瓣细胞成分,并作去细胞前后的形态学检查和生物力学测定;在去细胞支架上种植兔BM SC s,行形态学检查和免疫组织化学染色观察。结果光学显微镜、扫描及透射电子显微镜下可见猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全被去除,获得完整无细胞的纤维网状支架。瓣叶去细胞前后的断裂强度(642±102g/mm2vs.636±127g/mm2)和断裂伸长率(62.2%±18.1%vs.54.4%±16.0%)差别无统计学意义(P>0.05)。种植的兔BM SC s在APAV S表面形成一层连续的细胞层。免疫组织化学检查α-平滑肌动蛋白抗体(+),CD 31(-)。结论种植兔BM SC s于APAV S上,可在体外构建组织工程心脏瓣膜。     

组织工程心脏瓣膜内皮细胞的整合素β1表达

目的体外构建组织工程心脏瓣膜（TEHV），初步探讨内皮细胞黏附生长的分子机制。方法猪主动脉瓣膜经胰酶-EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除猪主动脉瓣叶的细胞成分，测定瓣叶脱细胞后的生物力学特性；将扩增的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）种植在瓣叶上，体外静态构建TEHV，观察内皮细胞的生长状态。消化瓣膜内皮细胞，半定量RT-PCR检测内皮细胞整合素＆mRNA的表达，Western-Blot检测内皮细胞膜上整合素＆蛋白的表达。结果猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全去除，脱细胞瓣叶的生物力学特性同新鲜瓣叶相比无明显变化；种植的HUVECs在瓣叶表面生长状态良好，长成一层连续的细胞层。瓣膜内皮细胞可检测到整合素岛mRNA和蛋白的表达。结论脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架，HUVECs做种子细胞可以成功构建TEHV，瓣膜内皮细胞可以表达整合素岛。     

去细胞猪主动脉瓣移植于犬腹主动脉内构建组织工程瓣

目的 探讨在犬腹主动脉内构建组织工程心脏瓣膜的实验方法。方法 将预种犬血管间质细胞和内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣叶(猪瓣),移植于6条犬的腹主动脉内,于术后4,6,8和10周对移植瓣叶进行形态、组织结构及免疫组化染色观察。结果 (1)移植术后4周时瓣叶周边有多层细胞长入,新细胞外基质形成,原支架组织部分吸收。(2)10周末猪瓣组织完全吸收,为宿主细胞及新合成的细胞外基质取代。基质中间质细胞主要为成纤维细胞和肌纤维母细胞。细胞外基质成分主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原和少量弹力纤维,并含有中性和酸性黏多糖。(3)内皮细胞覆盖于瓣叶表面。结论 (1)移植于犬腹主动脉内的去细胞猪瓣于移植术后10周末基本构成组织工程瓣叶;(2)腹主动脉内异位移植是一种可供选择的实验研究方法。     

种植人体活性细胞的生物心脏瓣膜

目前,种植人体活性细胞的生物心脏瓣膜主要有组织工程心脏瓣膜和种植人体活性细胞的猪主动脉瓣两种。组织工程心脏瓣膜是在人体可吸收的聚二醇酸纤维支架上种植人体同种活性细胞,先种植成纤维细胞,再种植单层内皮细胞包裹瓣叶。种植人体活性细胞的猪主动脉瓣是在清除原有细胞的组织内重建人体同种活性细胞。清除新鲜猪主动脉瓣呐原有细胞的方法是将瓣膜先经高、低渗溶液处理,然后用酶溶液处理。细胞经培养分离后,将成纤维细胞植入经处理的瓣膜组织,再植入内皮细胞。种植人体活性细胞的生物心脏瓣膜不会促使受者产生有害的免疫反应,并具有再生能力。     

去细胞组织工程同种心脏瓣膜的生物学特征

目的　构建去细胞组织工程同种心脏瓣膜 ,对比研究同种心脏瓣膜去细胞前后的生物学特征。方法　取液氮保存的人同种主动脉带瓣管道 ,采用低渗液 -去污剂 ( 1%DOA) -核酸酶去细胞法 ,测定去细胞前后组织学、组织厚度、组织含水量、热皱缩温度、组织基因组DNA含量、胶原蛋白含量。结果　同种心脏瓣膜、管壁及肌肉组织中去除所有细胞成分 ,保留了完整的细胞外基质。与去细胞前相比 ,管壁组织的含水量 [( 75 4 4± 1 84 ) %对 ( 82 0 5± 0 71) % ,P <0 0 5 ]明显增加 ,组织基因组DNA含量显著下降(瓣叶下降 91 14 %、管壁下降 91 5 3% ) ;瓣叶组织含水量、组织厚度、热皱缩温度及组织胶原蛋白含量差别无显著性。结论　低渗液 -去污剂 ( 1%DOA) -核酸酶去细胞法方便有效 ,去细胞的同种组织工程心脏瓣膜生物学特性稳定 ,符合机体要求 ;且为受体细胞化组织工程心脏瓣膜的研制提供了可靠的天然纤维支架材料     

内皮祖细胞和去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣膜的研究

目的将内皮祖细胞(EPCs)诱导分化为内皮细胞后种植在去细胞猪主动脉瓣膜(APV)上,以期为组织工程瓣膜(TEHV)的研制提供一个新的思路。方法采用去垢剂联合胰蛋白酶法去除猪主动脉瓣膜细胞。采用密度梯度离心法从羊骨髓中分离出EPCs,并诱导分化后,免疫组织化学染色鉴定。将诱导分化得到内皮细胞种植到APV上。采用光镜和电镜检测猪主动脉瓣膜的去细胞效果。对内皮细胞在APV上的生长效果进行观察。结果猪主动脉瓣内的细胞完全去除。EPCs经定向诱导后,具有表达CD-31,CD-34,von Willebrand因子等内皮细胞特征。诱导分化后的EPCs可以在APV表面黏附生长,并且表达CD-31和yon Willebrand因子。结论EPCs可以定向诱导分化为内皮细胞并可以在APV上种植生长。     

脱细胞猪主动脉瓣膜与可降解聚合材料共同构建复合组织工程瓣膜

目的对新型复合组织工程瓣膜进行体外生物力学和动物体内移植试验，为临床应用过渡提供依据。方法以脱细胞猪主动脉瓣作为支架，用可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（3一hydroxybutyrate—co-3-hydroxyhexanoate，PHBHHx）涂层，构建新型复合组织工程瓣膜。（1）复合组织工程瓣膜、新鲜猪主动脉瓣和脱细胞猪主动脉瓣各12枚，用单轴生物拉伸机进行体外生物力学测试；（2）小尾寒羊10只，其中5只在全身麻醉非体外循环下接受复合组织工程瓣膜，移植到羊的肺动脉瓣位；其余接受脱细胞猪主动脉瓣作为对照。术后18周处死动物，取出移植瓣膜，进行组织学、免疫荧光染色、扫描电子显微镜检查和钙含量测定。结果复合组织工程瓣膜保持了自然瓣形态，抗拉强度显著提高（P〈0．05）；瓣膜柔软，表面光滑无血栓；免疫荧光染色检测，瓣膜新生内膜中内皮细胞呈CD31阳性反应，沿瓣表面连续排列，间质细胞呈现单克隆鼠抗人平滑肌actin（sMA）阳性反应；复合组织工程瓣膜钙含量明显低于脱细胞猪主动脉瓣（P〈0．05）。结论复合组织工程瓣膜具有自然瓣膜的三维形态结构，良好的生物力学特性、生物相容性和细胞引导性，初步具备组织工程瓣膜雏形。     

去细胞组织工程同种心脏瓣膜的生物力学研究

目的　观察去细胞组织工程同种心脏瓣膜的生物力学特性。方法　取液氮保存的人同种主动脉带瓣管道 ,采用低渗液 去污剂 (1%去氧胆酸 ) 核酸酶法去除了同种心脏瓣膜组织中所有的细胞成分 ,组织基因组DNA含量下降 91% ,保留了完整的细胞外基质。测定去细胞前后组织厚度、组织含水量、热皱缩温度、应力应变曲线、破坏强度及组织伸长比。结果　与去细胞前相比 ,只有管壁组织的含水量去细胞前与去细胞后比较明显增加 (P <0 .0 1) ,瓣叶组织含水量、组织厚度、热皱缩温度、应力应变曲线、破坏强度及组织伸长比差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　去细胞组织工程同种心脏瓣膜的生物力学特性稳定 ,符合机体的要求 ,且为受体细胞化组织工程心脏瓣膜的研制提供了可靠的天然的纤维支架材料。     

Tissue Engineering für Herzklappen und Gefäße

Current prosthetic substitutes for heart valves and blood vessels have numerous limitations such as limited durability (biological valves), susceptibility to infection, the necessity of lifelong anticoagulation therapy (prosthetic valves), and reduced patency in small-caliber grafts, for example. Tissue engineering using either polymers or decellularized native allogeneic or xenogenic heart valve/vascular matrices may provide the techniques to develop the ideal heart valve or vascular graft. The matrix scaffold serves as a basis on which seeded cells can organise and develop into the valve or vascular tissue prior to or following implantation. The scaffold is either degraded or metabolised during the formation and organisation of the newly generated matrix, leading to vital living tissue. This paper summarises current research and first clinical developments in the tissue engineering of heart valves and vascular grafts.     

骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞作为组织工程瓣种子细胞的对比

目的 诱导分化骨髓间充质干细胞(BMSC)及内皮祖细胞(EPC),进行BMSC及EPC作为组织工程瓣膜(TEHV)种子细胞的对比.方法 分离扩增BMSC及EPC,分别定向诱导分化为内皮细胞,比较两种细胞在形态学、增殖能力、黏附力以及细胞冻存和复苏率方面的特点与区别.结果 光镜下,两种细胞均为贴壁生长细胞,BMSC的形态为梭形或多角型,EPC的形态为圆形及不规则形状,第2代诱导的BMSCs、EPCs的倍增时间分别为34 h和35 h,诱导后的BMSC冻存和复苏率以及黏附力与EPC之间差异无统计学意义;电镜示两种细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上.免疫组织化学结果显示两种细胞种植后的瓣膜上均有间质细胞生长.结论 BMSC和EPC诱导后可分化为内皮细胞,两者之间差异无统计学意义,都是合适的TEHV种子细胞.     

人-猪异种生物瓣瓣膜材料的实验构建

目的　探讨用组织工程的方法实现异种生物瓣瓣膜材料的内皮化 ,制备新一代的生物瓣瓣膜材料。方法　取自肉联厂宰杀后 2小时内 4℃冰水保存的 8只猪心 ,在无菌条件下取出主动脉瓣分成 4组 :1组戊二醛 (GA) ,2组环氧氯丙烷 (EC) ,3组环氧氯丙烷 +左旋谷氨酸 (EC+L - GA) ,4组环氧氯丙烷 +左旋谷氨酸 +细胞提取液 (EC+L -GA +CE)。再将新生儿脐带 (离体后 6小时内 )用胰蛋白酶消化制备种子细胞 ,接种于加入 M199(10 %的胎牛血清 +2 0 %的混合血清 +黏附蛋白 +内皮细胞生长因子 )的培养液中进行种植 ,每日用倒置相差显微镜观察细胞生长情况 ,并进行内皮细胞 因子的定性检测、细胞生长覆盖密度的检测、光学和电子显微镜观察。　结果　倒置相差显微镜观察 :1组未见细胞生长 ,2组可见有细胞呈散在性生长覆盖 ,但较 3、4组的细胞数及覆盖率明显降低 (P<0 .0 1)。光镜和电镜观察 :1组未见有内皮细胞生长 ;2组可见有散在的内皮细胞生长 ;3组内皮细胞局部生长并可见细胞脱落 ;4组内皮细胞生长于原瓣叶的无细胞纤维支架上 ,并呈单层紧密排列 ,少见有细胞脱落或丢失 ,细胞沿纤维嵌合排列 ,细胞下组织呈间隙稀疏构成 ,有少量的基质成分和散在的胶原纤维 ,细胞沿纤维间隙排列、嵌合生长 ,形成空间三维排列生长的内皮     

脱细胞天然支架生物力学性能变化及预处理改善组织相容性的实验研究

目的观察脱细胞猪主动脉瓣的生物力学性能变化,探讨不同预处理改善天然支架组织相容性的效果。方法新鲜猪主动脉瓣经酶加去污剂法去除细胞,力学测试仪检测其最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量的变化,苏木精-伊红（HE）染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和扫描电镜观察其病理形态学变化;将脱细胞瓣膜分别予磷酸缓冲液、多聚赖氨酸和未灭活胎牛血清包被处理,然后种植大鼠主动脉肌成纤维细胞,甲基噻唑基四唑试验检测细胞黏附率,HE染色和扫描电镜观察形态学变化。结果酶加去污剂法能完全脱去瓣膜细胞,基本维持胶原纤维的空间结构,但其最大负荷、最大应力及弹性模量下降,最大应变上升（P〈0．05）;胎牛血清预处理去细胞瓣能显著提高肌成纤维细胞的黏附率,促进细胞生长、分化和增殖,并在瓣膜表面形成连续的细胞层（F值=129．26,P=0．000）。结论酶加去污剂法可较完全去除猪主动脉瓣膜细胞并保持细胞外基质的三维结构,但其生物力学性能有所下降;胎牛血清预处理能改善脱细胞瓣天然支架的细胞黏附、生长和繁殖。     

Tissue engineering of heart valves: in vitro experiences

BACKGROUND: Tissue engineering is a new approach, whereby techniques are being developed to transplant autologous cells onto biodegradable scaffolds to ultimately form new functional tissue in vitro and in vivo. Our laboratory has focused on the tissue engineering of heart valves, and we have fabricated a trileaflet heart valve scaffold from a biodegradable polymer, a polyhydroxyalkanoate. In this experiment we evaluated the suitability of this scaffold material as well as in vitro conditioning to create viable tissue for tissue engineering of a trileaflet heart valve. METHODS: We constructed a biodegradable and biocompatible trileaflet heart valve scaffold from a porous polyhydroxyalkanoate (Meatabolix Inc, Cambridge, MA). The scaffold consisted of a cylindrical stent (1 x 15 x 20 mm inner diameter) and leaflets (0.3 mm thick), which were attached to the stent by thermal processing techniques. The porous heart valve scaffold (pore size 100 to 240 microm) was seeded with vascular cells grown and expanded from an ovine carotid artery and placed into a pulsatile flow bioreactor for 1, 4, and 8 days. Analysis of the engineered tissue included biochemical examination, enviromental scanning electron microscopy, and histology. RESULTS: It was possible to create a trileaflet heart valve scaffold from polyhydroxyalkanoate, which opened and closed synchronously in a pulsatile flow bioreactor. The cells grew into the pores and formed a confluent layer after incubation and pulsatile flow exposure. The cells were mostly viable and formed connective tissue between the inside and the outside of the porous heart valve scaffold. Additionally, we demonstrated cell proliferation (DNA assay) and the capacity to generate collagen as measured by hydroxyproline assay and movat-stained glycosaminoglycans under in vitro pulsatile flow conditions. CONCLUSIONS: Polyhydroxyalkanoates can be used to fabricate a porous, biodegradable heart valve scaffold. The cells appear to be viable and extracellular matrix formation was induced after pulsatile flow exposure.