控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植可减少脊髓损伤后空洞形成

背景：前期研究发现控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植可以有效地促进猕猴脊髓损伤后运动功能的恢复。 目的：验证控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植对猴脊髓损伤后组织结构的保护作用是否优于单纯细胞移植。 方法：将急性重度脊髓损伤模型恒河猴分为3组,联合移植组采用控释神经营养因子+神经元样细胞联合移植,单纯细胞移植组给予神经元样细胞移植,对照组给予磷酸盐缓冲液。制备脊髓组织石蜡标本,苏木精-伊红染色后显微镜下观察空洞形成情况,并应用图像分析系统计算空洞面积。 结果与结论：对照组脊髓结构严重破坏,空洞面积大、累及范围广;单纯细胞移植组脊髓结构保存较好,有小面积空洞,偶有较大空洞形成;联合移植组脊髓结构保存最好,仅存在小面积空洞。组间两两比较差异有显著意义(P < 0.01)。提示与单纯神经元样细胞移植比较,控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植对脊髓损伤后组织结构的保护作用更佳,可以在更大程度上减少脊髓空洞的形成可能是其作用机制之一。     

胶质细胞源性神经营养因子对猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响

背景：鉴于骨髓间充质干细胞体外分化为神经样细胞的最终研究目的,是将诱导后的细胞移植入体内参与损伤神经系统的修复过程,因此,保证移植细胞的活性显得十分重要。 目的：探讨胶质细胞源性神经营养因子对隐丹参酮体外诱导猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的保护作用。 方法：以隐丹参酮为诱导剂诱导第8代猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,应用流式细胞仪检测不同时段诱导细胞的凋亡百分比(每间隔0.5 h为1组,共12组)。选择细胞凋亡百分比较高的一个时段,观察添加不同质量浓度胶质细胞源性神经营养因子(0-100 μg/L,共11组)对诱导细胞凋亡的影响。 结果与结论：诱导后细胞凋亡百分比逐渐升高,约4 h时达到峰值,维持约1 h后下降(P < 0.05)。 随着胶质细胞源性神经营养因子质量浓度由0 μg/L提高到30 μg/L,细胞凋亡百分比逐渐下降(P < 0.05),当胶质细胞源性神经营养因子质量浓度超过30 μg/L后,细胞凋亡水平受胶质细胞源性神经营养因子质量浓度影响不再显著。结果可见胶质细胞源性神经营养因子在隐丹参酮体外诱导猴骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞过程中具有保护作用。     

胶质源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞与缺氧复氧神经细胞的共培养

背景：课题组前期研究表明,胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞能稳定地表达胶质源性神经营养因子 mRNA,但骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子分泌的胶质源性神经营养因子蛋白对缺氧复氧损伤的神经细胞是否有积极影响,尚不清楚。 目的：观察胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞对缺氧复氧神经细胞的保护作用。 方法：胶质源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞经诱导后与缺氧复氧神经细胞共培养,采用Hoechst33258和细胞免疫荧光染色分别检测神经细胞凋亡及生长相关蛋白43在共培养细胞中的表达。 结果与结论：骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子组的神经细胞凋亡率显著低于骨髓间充质干细胞组和缺氧组(P < 0.05),骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子组表达生长相关蛋白43的吸光度值明显高于骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞/胶质源性神经营养因子通过抑制缺氧复氧神经细胞凋亡和促进共培养细胞生长相关蛋白43表达发挥神经保护作用。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰骨髓基质干细胞移植脑出血大鼠 神经营养因子的表达

背景：研究证实,细胞移植和神经营养因子相结合治疗脑损伤能促进大鼠神经功能的恢复。 目的：观察移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞对大鼠脑出血后神经营养因子表达的影响。 方法：通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,将48只模型鼠随机分为3组,骨髓基质干细胞组、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组和对照组于建模后第3天在脑出血部位分别移植骨髓基质干细胞、胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞以及生理盐水。 结果与结论：与对照组和骨髓基质干细胞组相比,胶质细胞源性神经营养因子/骨髓基质干细胞组大鼠神经功能恢复更好;与对照组相比,移植后1,2周其他2组各神经营养因子表达均显著增加(P < 0.05)。提示胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗脑出血大鼠比单纯骨髓基质干细胞有更好的神经保护作用。     

季铵盐壳聚糖三维支架复合GNDF载间充质干细胞向神经样细胞分化

背景：壳聚糖类水凝胶因其良好的生物相容性、可降解性及对药物的缓释作用,作为支架材料近年来在组织损伤修复领域逐渐成为研究热点。 目的：探索大鼠骨髓间充质干细胞在季铵盐壳聚糖温敏凝胶支架上生长、向神经样细胞定向分化的可行性,为治疗神经系统损伤寻找理想的组织工程材料。 方法：季铵盐壳聚糖与β-甘油磷酸钠复合制成温敏凝胶,扫描电镜观察凝胶的三维结构,MTT法评价凝胶浸提液对骨髓间充质干细胞活力的影响;将牛血清白蛋白加载于凝胶支架,紫外光谱吸收法分析凝胶支架对牛血清白蛋白的缓释效果。接种大鼠骨髓间充质干细胞于凝胶支架,扫描电镜观察在支架缓释胶质细胞源性神经营养因子作用下,骨髓间充质干细胞的生长、分化情况,免疫荧光技术检测神经元烯醇化酶的表达。 结果与结论：季铵盐化壳聚糖与甘油磷酸钠复合所得凝胶支架,其多孔性特点明显,有温敏特性,对蛋白的缓释效果良好,承载大鼠骨髓间充质干细胞后,对其增殖无明显不利影响。在凝胶支架缓释的胶质细胞源性神经营养因子作用下,骨髓间充质干细胞呈现神经样细胞形态,表达神经元特异性标记物神经元烯醇化酶。说明季铵盐壳聚糖温敏凝胶对胶质细胞源性神经营养因子的缓释效果良好,其凝胶支架具有多孔径、良好生物相容性特点,可承载大鼠骨髓间充质干细胞体外生长和向神经元定向分化。     

过表达胶质细胞神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

文题释义： 胶质细胞源性神经营养因子：作为轴突再生的一种重要神经营养因子,可诱导间充质干细胞向神经样细胞分化并对中枢神经系统退行性疾病、脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。 突触素：作为突触的特异性蛋白是突触形成过程中最重要的标志物,主要位于神经元胞体及轴突,可调节神经元轴突延伸,参与突触囊泡的介导转运、神经递质释放,对促进脊髓损伤后神经功能恢复起到重要作用。 背景：胶质细胞神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)在诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外定向分化及促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复过程中起到重要作用。 目的：观察过表达GDNF基因的BMSCs分化情况及其促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复的潜在分子机制。 方法：①以重组目的基因腺病毒转染BMSCs并分为Ad-GDNF-GFP转染组、Ad-GFP转染组、未转染组,免疫荧光鉴定各组细胞神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2的表达,Western blot检测各组细胞GDNF、Wnt3a、Wnt7a蛋白表达。②以改良Allen法制备大鼠脊髓损伤模型,将造模成功的45只SD大鼠随机分为3组,分别以过表达GDNF基因BMSCs(GDNF-BMSCs)、BMSCs、PBS移植至脊髓损伤局部。移植后4周采用BBB评分法评估大鼠运动功能恢复情况,苏木精-伊红染色观察脊髓形态变化,免疫组化检测损伤局部神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ及胶质纤维酸性蛋白表达,Western blot检测损伤局部Bcl-2、肿瘤坏死因子α蛋白表达。 结果与结论：①Ad-GDNF-GFP转染组BMSCs可向神经元样细胞形态转变并表达神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2;Wnt3a、Wnt7a蛋白表达量显著高于Ad-GFP转染组、未转染组;②移植后4周,GDNF-BMSCs移植组大鼠BBB评分明显提高、脊髓空洞面积显著缩小。GDNF-BMSCs移植组脊髓损伤局部胶质纤维酸性蛋白、肿瘤坏死因子α表达量显著低于BMSCs移植组及PBS移植组,而神经元特异性烯醇化酶、突触素Ⅰ及Bcl-2表达量显著高于BMSCs移植组、PBS移植组;③结果表明,Wnt信号通路参与过表达GDNF基因 BMSCs向成熟神经元分化过程,移植后通过降低脊髓损伤局部炎症反应、减少细胞凋亡及胶质瘢痕形成、促进轴突再生,提高BMSCs移植治疗脊髓损伤的疗效。 ORCID: 0000-0001-6467-730X(黄成) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓间充质干细胞尾静脉移植脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达

背景：骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤有治疗作用,但其机制尚不完全清楚。 目的：应用免疫组织化学方法观察骨髓间充质干细胞静脉移植损伤脊髓局部脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达,分析骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的作用途径。 方法：运用改良Allen法制备T10脊髓外伤性截瘫大鼠模型,假手术组6只,脊髓损伤组24只随机分为对照组和骨髓间充质干细胞移植组。骨髓间充质干细胞移植组、假手术组接受骨髓间充质干细胞单细胞悬液1 mL(1×10⁶ cells)自大鼠尾静脉缓慢注射移植,对照组静脉注射PBS 1 mL。 结果与结论：脊髓损伤后损伤局部的脑源性神经营养因子、神经生长因子表达增加,骨髓间充质干细胞静脉注射移植后能促进脊髓损伤局部脑源性神经营养因子、神经生长因子更进一步的表达,这可能是促进神经结构及神经功能恢复的因素之一。     

异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

背景:脊髓损伤的修复目前尚无良好的治疗手段,细胞移植能促进神经轴突再生及脊髓功能恢复,为治疗脊髓损伤提供了可能,但因脊髓损伤模型及移植方式不同,其治疗效果并不相同。目的:验证异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤的治疗作用。方法:全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞。健康SD大鼠随机分为3组,细胞移植组、对照组和假手术组。细胞移植组和对照组采用改良Allen重物打击法制造大鼠脊髓损伤模型,假手术组仅暴露脊髓。术后4周,每周进行运动功能评分ELISA检测脊髓损伤组织中脑源性神经营养因子、神经生长因子表达;免疫荧光染色检测脊髓组织中NF200和胶质纤维酸性蛋白表达。结果与结论:与对照组比较,细胞移植组大鼠运动功能明显改善,脊髓组织中脑源性神经营养因子、神经生长因子蛋白含量明显增高(P0.05);移植组大鼠脊髓囊腔较小,NF200表达明显增加,胶质纤维酸性蛋白表达减少。提示异体骨髓间充质干细胞移植能增加损伤脊髓神经生长因子含量,抑制胶质瘢痕形成,促进神经轴突再生,改善大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化

背景：近年来,研究表明外源性神经营养因子或化学诱导剂可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化,但外源性诱导剂诱导作用短暂且化学性物质不可避免的对细胞活力造成负面影响,一定程度上限制了骨髓间充质干细胞的基础研究与临床应用空间。 目的：以载胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因重组腺病毒(Ad-rGDNF-GFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞,观察目的基因在靶细胞内的表达、对细胞的营养作用及对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响。 方法：转染组中以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞,感染复数分别为10,50,80,100,150,200;对照组加入等量的培养液作为对照。转染后12 h,倒置荧光显微镜观察2组中绿色荧光蛋白的表达情况;转染后72 h,流式细胞仪测定转染组中转染效率;MTT法测定2组中细胞活力;转染后5,10 d,PCR检测转染组中胶质细胞源性神经营养因子mRNA的表达;转染后5 d免疫荧光鉴定2组中神经元烯醇化酶的表达情况,转染后10 d鉴定微管相关蛋白2的表达。 结果与结论：转染后12 h,细胞中可观察到绿色荧光蛋白的表达,随时间延长荧光强度逐渐加强。以感染复数=100时绿色荧光蛋白的表达强度、稳定性较好,转染后3 d,转染效率近90%;转染后转染组细胞活力增加;转染5 d后,骨髓间充质干细胞表达神经元烯醇化酶,细胞伸出神经样细胞突起;转染10 d后,胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达显著增强,骨髓间充质干细胞表达神微管相关蛋白2,细胞突触样结构明显且相互连接成网,呈现典型神经样细胞形态。说明以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞,感染复数=100时,可获得较高的转染效率,胶质细胞源性神经营养因子表达后明显提高了骨髓间充质干细胞活力,并诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞定向分化。     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脊髓损伤

背景:干细胞治疗神经组织损伤的关键在于移植具有再生能力的干细胞,通过多种作用机制,重建中枢神经系统的结构和功能。目的:立体定向移植骨髓间充质干细胞观察其对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制。方法:密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞,于细胞移植前掺入10mg/L的BrdU进行标记。将成年雌性Wistar大鼠以动脉瘤夹闭法制备大鼠脊髓损伤模型后随机分为对照组、生理盐水组与移植组。移植组大鼠致伤后第7天,通过立体定向途径移植骨髓间充质干细胞到脊髓损伤中心,生理盐水组给予等量生理盐水,对照组大鼠不做处理。于大鼠脊髓损伤前及损伤后第7,14,30,60,90天进行BBB评分;损伤后第90天处死大鼠,观察其脊髓组织中有无BrdU阳性细胞、Brdu+神经元特异性烯醇化酶、Brdu+胶质纤维酸性蛋白、Brdu+碱性成纤维细胞生长因子、Brdu+脑源性神经生长因子免疫组织化学双染阳性细胞及单染阳性细胞。结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组(P0.05);生理盐水组BBB评分在损伤后30d内恢复速度慢于对照组(P0.05),至第90天与对照组比较差异无显著性意义(P0.05)。②移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1cm处均可见BrdU染色阳性细胞及免疫组织化学双染阳性细胞。移植组神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子单染阳性细胞数明显高于对照组和生理盐水组(P0.05)。结果提示,骨髓间充质干细胞移植可以促进脊髓损伤大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关。     

低频电磁场促进骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

背景：骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤被视为一种有前途的治疗方法,如何更有效地促进骨髓间充质干细胞在脊髓损伤区存活,加速脊髓损伤肢体运动功能的恢复是目前研究的重点。前期研究发现,低频电磁场能够促进骨髓间充质干细胞的增殖分化,低频电磁场是否可应用于骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤还需进一步研究。 目的：探讨低频电磁场对移植骨髓间充质干细胞脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响。 方法：采用脊髓压迫法制备64只T10不完全性脊髓损伤大鼠模型,随机等分为对照组、骨髓间充质干细胞组、电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组。造模成功后,骨髓间充质干细胞组和电磁场+骨髓间充质干细胞组大鼠脊髓损伤原部位注射大鼠全贴壁法分离培养BrdU标记的骨髓间充质干细胞,对照组和电磁场组注射a-MEM培养液。造模术后24 h,电磁场组和电磁场+骨髓间充质干细胞组予60 min/d的低频电磁场刺激(频率50 Hz、强度5 mT)。 结果与结论：骨髓间充质干细胞移植后第21天,电磁场+骨髓间充质干细胞组BBB评分与其他组相比,差异有显著性意义(P < 0.05),与其他各组比较,电磁场+骨髓间充质干细胞组移植细胞后,大鼠BrdU阳性细胞在脊髓损伤区域生长并与脊髓组织融合,存活细胞数量较其他组多;空洞面积小;损伤区胶质纤维酸性蛋白表达更少,而基质金属蛋白2表达更多;脊髓损伤大鼠下肢运动功能恢复最快(P < 0.05)。提示低频电磁场促进了移植骨髓间充质干细胞脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复,可能与低频电磁场有利于损伤区移植骨髓间充质干细胞的存活,上调基质金属蛋白2的表达并减少胶质瘢痕的形成有关。     

骨髓间充质干细胞向脊髓损伤区的迁徙

背景：骨髓间充质干细胞移植到脊髓损伤区域后,如何观察其在体内的生存和转归情况,一直是让人困扰的问题。 目的：观察骨髓间充质干细胞在大鼠脊髓损伤区内的迁徙情况。 方法：36只Wistar大鼠随机分为2组,实验组制作脊髓损伤模型1周后,经尾静脉移植用DAPI标记的骨髓间充质干细胞(1×109 L-1) 1 mL,连续注射2 d。对照组未行脊髓损伤,与实验组同一时间同法行骨髓间充质干细胞移植。分别于移植后5,10,15 d,制作损伤脊髓冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞的迁徙情况。 结果与结论：实验组于移植后5 d,在脊髓损伤组织血管内出现少量荧光标记的骨髓间充质干细胞,10 d后有血管外弥散,15 d后有广泛弥散。对照组均未见DAPI标记的骨髓间充质干细胞。结果表明骨髓间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后,能透过血脊髓屏障向损伤脊髓组织迁徙。     

骨髓间充质干细胞移植脊髓损伤小鼠运动功能的恢复

背景：研究证实,移植的骨髓间充质干细胞可被定向诱导分化为神经细胞,重建神经环路,促进轴突再生,恢复脊髓功能。 目的：进一步验证骨髓间充质干细胞在脊髓损伤修复中的作用。 方法：C57BL/6小鼠40只随机分为4组,假手术组不打击脊髓;其余小鼠采用重物撞击法建立脊髓损伤模型。损伤后的第7天,治疗组用微量注射器,经眶静脉丛注入骨髓间充质干细胞悬液;对照组注入等量 DMEM培养基;模型组不做处理。通过苏木精-伊红染色法判断脊髓损伤程度。通过免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞分化形成的神经细胞。通过荧光显微镜观察移植细胞生长状态;通过改良Tarlov评分法评价小鼠运动功能恢复程度。 结果与结论：骨髓间充质干细胞诱导分化7 d后的细胞呈NF和神经胶质纤维酸性蛋白阳性表达。模型组小鼠双下肢呈瘫痪状态,假手术组行动正常(P < 0.01)。细胞移植后2周,治疗组小鼠运动功能缺失症状逐渐恢复,对照组小鼠恢复不明显 (P < 0.05);细胞移植4周后,细胞移植组小鼠Tarlov评分与假手术组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。说明骨髓间充质干细胞移植可提高脊髓损伤小鼠的运动能力。     

蛛网膜下腔移植磁标骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤

背景：干细胞移植可以重建中枢神经系统的结构和功能,近年来引起了广泛的关注。 目的：探讨超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞对兔脊髓损伤神经功能恢复的作用。 方法：采用密度梯度离心法和贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞。制作兔脊髓损伤模型,并在蛛 网膜下腔置管以备移植。将实验白兔随机分为3组：标记组移植超顺磁性氧化铁标记细胞;未标记组移植未标记细胞;对照组不移植细胞只注射PBS液。 结果与结论：两移植组在细胞移植14 d后运动功能BBB评分高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.05);但两组间差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞移植后1,7,14,21,28,35 d,脊髓损伤区域局部组织上出现大量含蓝色铁颗粒的细胞。经蛛网膜下腔移植标记骨髓间充质干细胞可定向迁移到脊髓损伤区域,并能促进脊髓损伤神经功能恢复。