L型结核菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系研究

目的探讨L型结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法对76株复制肺结核患者L型结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验,同时采用PCR和PCR-DS技术对L型结核菌株进行rpoB基因检测和序列分析。结果药敏结果提示28株L型结核分枝杆菌对利福平耐药,其中20株(71.4%)L型结核分枝杆菌rpoB基因发生突变。结论 L型结核分枝杆菌rpoB基因突变是造成结核分枝杆菌形成利福平耐药性的主要机制。     

耐药结核病的流行和监测

20世纪抗结核病药物相继问世，使结核病的治愈成为可能，但随之出现了结核分枝杆菌的耐药性。染色体自发突变导致对某种抗结核病药物耐药的发生频率为10^-6～10^18，由于不同药物耐药的突变位点不同，同时使用3种抗结核药的同时耐药频率为10^-18-10^20。因此，联用3种有效的抗结核药物时，发生抗结核药物耐药的概率极少。从这一点出发，可以认为耐药的发生是结核分枝杆菌基因突变被人为放大的结果。不合理的用药、治疗管理不善、药物供应不足和质量不佳以及间断用药等，刺激结核分枝杆菌发生耐药性，即获得性耐药（acquired drug resistance）；随后，耐药结核分枝杆菌在人群中传播，发生耐药结核分枝杆菌感染，即原发耐药（primary drug resistance）；耐多药结核病（MDR-TB）是指至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核病。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药性——一个不容忽视的问题

异烟肼是控制结核病的主要药物之一。2018年WHO报告的结核病初治病人中利福平敏感的异烟肼耐药率明显高于2017年的耐多药/利福平耐药率。我国结核病人的异烟肼总耐药率明显高于利福平总耐药率。异烟肼耐药容易导致治疗失败或复发。异烟肼耐药机制复杂,多个基因的突变均与异烟肼耐药有关,然而这些基因突变与表型的关系尚未完全清楚,直接影响了分子药敏快速诊断方法的建立。基因组学数据证明异烟肼耐药相关基因突变先于利福平耐药性相关基因突变发生。异烟肼耐药结核分枝杆菌容易诱发菌株获得额外耐药性,其机制可能与外排泵以及氧化应激机制有关。总之,结核分枝杆菌异烟肼耐药问题不容忽视,因此应该加强异烟肼作用机制、耐药机制、协同作用机制等方面的研究。     

类泛素-蛋白酶体系统和药物外排泵抑制剂对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性影响的研究

目的探讨类泛素-蛋白酶体系统对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的影响。方法采用刃天青显色法检测利福平对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),比较分析结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因的过表达或缺失突变对结核分枝杆菌利福平MIC的差异;检测分别加入羰基氰氯苯腙、利血平、维拉帕米和氯丙嗪4种外排泵抑制剂前后各菌株对利福平MIC的影响。结果结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的过表达均能增强单纯耐利福平结核分枝杆菌对利福平的耐药性,而Pup、Mpa、Dop和PafA基因的缺失均能显著降低单纯耐利福平结核分枝杆菌对利福平的耐药性,P值均0.05。4种药物外排泵抑制剂能不同程度的降低各过表达菌株对利福平的MIC,P值均0.05,并且,类泛素-蛋白酶体系统与外排泵抑制剂之间存在一定交互作用。结论类泛素-蛋白酶体系统对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的产生有影响;类泛素-蛋白酶体系统可能通过调控外排相关通路蛋白来影响结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的产生。     

两种分子检测技术对结核分枝杆菌临床分离株耐药性诊断价值的评价

目的评价荧光PCR探针熔解曲线方法和线性探针技术检测结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼耐药性突变的应用价值。方法回顾性分析2013年12月-2014年3月广州市胸科医院荧光PCR探针熔解曲线及线性探针检测142例结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼耐药突变情况,以表型药敏试验结果为标准,评价上述两种分子检测技术的检验效能。结果 142份结核分枝杆菌临床分离株中,以表型药敏试验结果为标准,荧光PCR熔解曲线法检测利福平耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为92.86%、96.49%和95.77%;对异烟肼敏感度、特异度和符合率分别为72.09%、100.00%和91.55%。以表型药敏试验结果为标准,线性探针法检测142份结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为82.14%、98.25%和95.07%;对异烟肼敏感度、特异度和符合率分别为67.44%、100.00%和90.14%。荧光PCR熔解曲线法和线性探针方法对利福平和异烟肼耐药性的检测结果比较,差异无统计学意义(P0.05)。荧光PCR熔解曲线法与表型药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的Kappa值为0.87,对异烟肼耐药性的Kappa值为0.72。线性探针法与表型药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的Kappa值为0.84,对异烟肼耐药性的Kappa值为0.67。结论荧光PCR探针熔解曲线方法和线性探针方法在检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性方面,具有同等的检验效能,可以早期快速诊断耐药结核病。     

结核分枝杆菌耐药机制

耐多药结核病和广泛耐药结核病在人类免疫缺陷病毒感染时代的不断增长是有效结核病控制的主要威胁。来自染色体自发突变的结核分枝杆菌耐药概率很低。疾病治疗过程中由于不稳定的药品供应、不合理的治疗方案以及差的患者依从性等人为选择因素导致临床耐药结核病大量发生。已经阐明主要的一线和二线药物包括利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氨基糖甙类和氟喹诺酮类的耐药分子机制。结核分枝杆菌菌株耐药性与毒性／传染性之间的关系需要进一步研究。理解结核分枝杆菌耐药机制将有助于快速分子诊断工具的发展并且可能进一步指导结核病治疗的新药的研制。     

结核分枝杆菌的耐药机制研究进展

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患慢性传染病,随着结核分枝杆菌自身演变和抗结核病药物的使用,导致结核分枝杆菌产生耐药性。目前根据结核病患者是否接受过抗结核病药物的治疗,将结核分枝杆菌的耐药性分为两种,一种是原发性耐药,另一种是获得性耐药。为了探索结核分枝杆菌的耐药机制,本文对原发性与获得性耐药机制进行阐述,为后续新型抗结核病药物的研发奠定理论基础。     

应用噬菌体报告系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性

早期诊断耐药结核分枝杆菌是防治耐药结核病的关键和基础。1993年起噬菌体报告系统（LRPs）陆续应用于结核分枝杆菌的鉴定及耐药检测，噬笛体生物扩增法（PhaB）也在国内被用于检测结核分枝杆菌的耐药性。我们利用新的重组噬菌体phAE142建立LRPs检测方法，检测了106株结核分枝杆菌对4种常用抗结核药物的耐药性，评价LRPs在结核病临床和流行病学研究中应用的可行性。     

结核分枝杆菌对利福喷汀与利福平交叉耐药的实验研究

目的 观察利福喷汀对结核分枝杆菌的杀菌效力及其与利福平的交叉耐药性，探讨利福喷汀对结核分枝杆菌的实验室耐药界限，为临床应用利福喷汀治疗结核病，包括治疗对利福平耐药的结核病提供依据。方法 用7H9液体培养基、苏通液体培养基、改良罗氏固体培养基测定利福喷汀和利福平对结核分枝杆菌标准株(H37Rv)及临床分离的利福平敏感株、利福平耐药株的最低抑菌浓度(MIC)。结果 在7H9液体培养基上对临床分离的19株利福平敏感株分别测定利福平和利福喷汀的MIC，有80％利福平敏感株利福平的MIC≥0．32μg／ml，而利福喷汀的MIC多分布在0．02～0．32μg／ml之间(占84％)；无论标准株H37Rv、利福平敏感株(19株)或是利福平耐药株(45株)，利福喷汀对结核分枝杆菌的MIC普遍比利福平低2～4倍；利福喷汀敏感株和耐药株的MIC差别较大，在MIC为5～10μg／ml处能最大限度地区分敏感菌和耐药菌。结论 利福喷汀与利福平存在着交叉耐药，但利福喷汀比利福平有更强的杀菌效力，部分结核分枝杆菌对利福平达到临床耐药时，仍未达到利福喷汀临床耐药，对利福平耐药的部分结核分枝杆菌对利福喷汀仍具有一定程度的敏感性，提示临床上对利福平耐药的结核病患者使用利福喷汀可能有一定效果；实验结果对利福喷汀临界耐药界限进行了初步筛查，为利福喷汀常规药敏试验的开展提供了基本试验数据。     

结核分枝杆菌对利福喷汀与利福平交叉耐药的实验研究

目的 观察利福喷汀对结核分枝杆菌的杀菌效力及其与利福平的交叉耐药性，探讨利福喷汀对结核分枝杆菌的实验室耐药界限，为临床应用利福喷汀治疗结核病，包括治疗对利福平耐药的结核病提供依据。方法 用7H9液体培养基、苏通液体培养基、改良罗氏固体培养基测定利福喷汀和利福平对结核分枝杆菌标准株（H37Rv)及临床分离的利福平敏感株、利福平耐药株的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。结果 在7H9液体培养基上对临床分离的19株利福平敏感株分别测定利福平和利福喷汀的MIC，有近80%利福平敏感株利福平的MIC≥0．32μg/ml，而利福喷汀的MIC多分布在0．02～0．32μg/ml之间(占84．2％)：无论标准株H37Rv、利福平敏感株(19株)或是利福平耐药株(45株)，利福喷汀对结核分枝杆菌的MIC普遍比利福平低2～4倍：利福喷汀敏感株和耐药株的MIC差别较大,在MIC为5～ 10μg／ml处能最大限度地区分敏感菌和耐药菌。结论 利福喷汀与利福平存在着交叉耐药。但是利福喷汀比利福平有更强的杀菌效力，部分结核分枝杆菌对利福平达到临床耐药时，仍未达到利福喷汀临床耐药。对利福平耐药的部分结核分枝杆菌对利福喷汀仍具有一定程度的敏感性,提示临床上对利福平耐药的结核病患者使用利福喷汀可能有一定效果；实验结果对利福喷汀临界耐药界限进行了初步筛查,为利福喷汀常规药敏试验的开展提供了基本试验数据。     

荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本结核分枝杆菌利福平耐药性的研究

目的:评价荧光PCR探针熔解曲线(fluorescent polymerase chain reaction probe melting curve, MeltPro)技术检测肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌耐药性的临床应用价值。方法:收集2021年5月至2022年5月北京市疾病预防控制中心结核病门诊收治的GeneXpert MTB/RIF检测阳性的初治肺结核患者的痰标本,对每份标本同时进行涂片镜检、分枝杆菌分离培养、MeltPro技术利福平耐药性检测。分析痰标本荷菌量对MeltPro技术耐药性检测结果的影响;培养阳性菌株行利福平比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”),比较比例法药敏试验、GeneXpert MTB/RIF和MeltPro技术检测利福平耐药率的差异;并以培养阳性菌株利福平比例法药敏试验结果为参考标准,评价MeltPro技术耐药性检测的效能。结果:研究共收集结核分枝杆菌阳性合格痰标本158份(例),经分枝杆菌分离培养获得阳性菌株130株。MeltPro技术检测痰标本结核分枝杆菌利福平耐药的成功率为79.1%(125/158),且随着痰涂片结果等级的升高,检测成功率由“阴性...     

新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型研究

目的分析新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型,为控制耐药性发展与耐药株传播奠定基础。方法收集患者痰液样本370例,鉴定结核分枝杆菌。对菌株进行耐药性分析及rpoB基因扩增及测序,分析耐药株基因型。结果 370例新乡地区患者中分离174株结核分枝杆菌,分离率为47.03%。其中,2016-2018年各分离结核分枝杆菌29、63和82株,分离率为36.25%、45.32%和54.30%。2016年29株结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素、氧氟沙星的耐药率分别为48.28%、44.83%、34.48%和27.59%;2017年63株结核分枝杆菌耐药率分别为61.90%、47.62%、38.10%、26.98%;2018年82株结核分枝杆菌耐药率分别为70.73%、57.32%、39.02%和35.37%。111株利福平耐药的结核分枝杆菌中,87株发生rpoB基因变异,基因突变率为78.38%。其中Ser→Leu在521位点突变58株(52.25%)和His→Leu在526位点突变22株(19.82%)是主要基因突变类型。此外,有24株(21.62%)未发生变异。结论 2016-2018年新乡地区患者结核分枝杆菌分离率逐年增高。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高,且逐年增高。利福平耐药株的耐药性产生的主要机制是rpoB基因发生位点突变。     

新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型研究北大核心CSCD

目的分析新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型,为控制耐药性发展与耐药株传播奠定基础。方法收集患者痰液样本370例,鉴定结核分枝杆菌。对菌株进行耐药性分析及rpoB基因扩增及测序,分析耐药株基因型。结果370例新乡地区患者中分离174株结核分枝杆菌,分离率为47.03%。其中,2016-2018年各分离结核分枝杆菌29、63和82株,分离率为36.25%、45.32%和54.30%。2016年29株结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素、氧氟沙星的耐药率分别为48.28%、44.83%、34.48%和27.59%;2017年63株结核分枝杆菌耐药率分别为61.90%、47.62%、38.10%、26.98%;2018年82株结核分枝杆菌耐药率分别为70.73%、57.32%、39.02%和35.37%。111株利福平耐药的结核分枝杆菌中,87株发生rpoB基因变异,基因突变率为78.38%。其中Ser→Leu在521位点突变58株(52.25%)和His→Leu在526位点突变22株(19.82%)是主要基因突变类型。此外,有24株(21.62%)未发生变异。结论2016-2018年新乡地区患者结核分枝杆菌分离率逐年增高。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高,且逐年增高。利福平耐药株的耐药性产生的主要机制是rpoB基因发生位点突变。     

噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性

目的　建立快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性的噬菌体生物扩增法 ,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法　应用噬菌体生物扩增法测定 5 2 4株结核分枝杆菌利福平耐药性 ,并与绝对浓度法结果进行比较 ,对不符合的菌株采用BactecMGIT 96 0测定其最低抑菌浓度 (MIC)。结果　噬菌体法测定 5 2 4株结核分枝杆菌临床分离株利福平敏感 30 1株、耐药 2 2 3株 ,绝对浓度法敏感 313株、耐药 2 11株 ;两法测定均为敏感 2 88株、均为耐药 198株。在 38株噬菌体法与绝对浓度法测定结果不符的菌株中 ,35株噬菌体法与MIC测定结果相符合。如以绝对浓度法药敏结果为判断标准 ,则噬菌体法测定利福平耐药性的敏感性为 93 8%、特异性为 92 0 %、阳性预测值为88 8%、阴性预测值为 95 7%、准确性为 92 7%。结论　噬菌体生物扩增法测定利福平耐药性只需 2天时间 ,操作简便 ,不需特殊仪器设备 ,可作为结核分枝杆菌利福平耐药性的快速筛选方法。     

药物驱动的依赖和剥夺效应可以作为结核患者治疗的工具吗?

Zhong等发表了关于利福平依赖型/增强型多耐药结核这一不常见的现象,引起大家高度兴趣1。但是,我们并不完全同意作者提出的观点。我们认为结核分枝杆菌菌株可以成为利福平依赖菌,当剥夺药物之后菌株会死亡,因此可以发展出新的化疗策略控制结核病,尤其是耐药性结核病。我们之前提出了增强对药物的依赖,当剥夺化疗药物之后将造成对药物的饥饿这一概念,可以在     

加替沙星联合2SHRZ／4HR方案治疗肺结核25例疗效观察

近年来，HIV和结核分枝杆菌双重感染以及耐药分枝杆菌的流行，导致结核病疫情严峻。2SHRZ/4HR方案（链霉素、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺联用2个月，异烟肼、利福平联用4个月）为从事煤炭行业人员的主要短期结核化疗方案。2006～2008年，我们采用加替沙星联合2SHRZ／4HR方案治疗肺结核25例，效果满意。现报告如下。     

基因芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性研究

目的　研究基因芯片在检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和异烟肼耐药相关的 4条基因上的 11个位点的 30种单核苷酸多态性设计制作芯片 ,用芯片检测结核分枝杆菌的基因突变 ,从而判断其耐药性。结果　用基因芯片在 110株异烟肼耐药株中检测出 85株 (73 3% ) ,在 30株异烟肼敏感株中检测出 2 2株 (73 3% ) ,在 94株利福平耐药株中检测出 77株 (81 9% ) ,在 4 6株利福平敏感株中检测出 4 0株 (87 0 % )。芯片检测结果与部分样本的测序结果完全相符。结论　用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性 ,该法快速、精确 ,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测。     

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

耐利福平作为筛选耐多药结核病指标的评估

目的探讨耐利福平作为耐多药结核病筛选指标的可行性。方法对结核分枝杆菌临床分离株采用美国BD公司BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪进行药敏试验,并对数据进行分析。应用诊断性试验评价指标评价耐利福平作为耐多药结核病筛选指标的科学性。结果在621株结核分枝杆菌临床分离株中,177株对利福平菌耐药,其中172株至少同时对异烟肼耐药,结核分枝杆菌的耐多药率为27.7%。若以至少同时耐异烟肼和利福平作为诊断MDR-TB的参考标准,以耐利福平作为MDR-TB筛选指标的敏感性为100%、特异性为98.9%、准确度为99.2%、阳性预测值为97.2%、阴性预测值为100%、阳性似然比为34.4、阴性似然比为0。结论我市耐多药结核病发生率高;耐利福平可以作为耐多药结核病的初步筛选指标。     

结核分枝杆菌RD区蛋白研究进展

由病原菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引发的结核病是一种严重危害人类健康的传染病。根据世界卫生组织的《全球结核病报告2017》年报指出:2016年新增结核病感染者1 040万例,其中死亡人数达到167万例,死于HIV共感染的人数37万。随着多耐药性菌株和HIV共感染等出现,使得结核病的预防和治疗形式愈加严峻,积极研发新型结核疫苗十分必要。结核分枝杆菌RD区编码蛋白在结核病新型疫苗研发及新型诊断方法建立中具有重要的潜在意义及应用价值。 本文主要介绍结核分枝杆菌基因组RD区及其编码蛋白的研究进展。