IL-4基因转染瘤苗体内抗肿瘤转移作用及其免疫机理的初步研究

将白细胞介素４（ＩＬ－４）基因转染Ｂ１６黑色素瘤细胞，筛选出高分泌克隆，体外扩增后经丝裂霉素Ｃ灭活制备成瘤苗，用以治疗实验性肺转移荷瘤小鼠，同时用低剂量白细胞介素２（ＩＬ－２）及低剂量环磷酰胺（Ｃｙ）辅助治疗。结果发现，经ＩＬ－４基因转染瘤苗治疗后荷瘤小鼠肺部转移结节明显减少，存活期明显延长，辅以ＩＬ－２治疗后效果更佳；同时辅以ＩＬ－２及Ｃｙ则治疗效果最佳。体内免疫功能研究发现，经ＩＬ－４基因转染瘤苗治疗后小鼠脾淋巴细胞诱导的ＣＴＬ及腹腔巨噬细胞杀伤活性明显升高，但脾脏ＮＫ及经诱导的ＬＡＫ活性变化不明显。脾淋巴细胞经诱导后分泌的细胞因子（包括ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ）中，ＴＮＦ和ＧＭ－ＣＳＦ在治疗各组有所升高。本实验结果表明，ＩＬ－４基因转染瘤苗能有效地激活体内抗肿瘤免疫功能并具有显著的抗肿瘤转移效果，将其与低剂量ＩＬ－２和低剂量Ｃｙ联合应用时抗肿瘤转移效果更佳。     

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响

目的：研究ＴＧＦ－β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α２（Ｉ）基因上游启动子活性的影响。方法：以含小鼠胶原α２（Ｉ）上游０．４、０．８、２．０ｋｂ启动片段为研究靶序列,以氯毒素乙酰枯转移酶（ＣＡＴ）作报告基因,应用基因技术研究小鼠胶原启动子活性。结果：ＴＧＦ－β可促进小鼠前胶原α２（Ｉ）基因妄动序列的启动活性,而中药抗纤复方可抑制其启动活性。结论：ＴＧＦ－β和中药抗纤复方都可作用于胶原α２（Ｉ）基因调控     

湖北汉族人群C4限制性片段长度多态性的研究

用限制性内切酶ＴａｑＩ和Ｃ４基因５￣＇末端探针ｐＡＴ－Ａ检测５８份湖北地区健康献血员基因组ＤＮＡ的Ｃ４基因限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ），观察到７．０ｋｂ、６．０ｋｂ和５．４ｋｂ三种Ｃ４基因片段，它们共组成三种常见的Ｃ４基因ＲＦＬＰ表型，即Ａ：７．０５－４ｋｂ（频率为２４．１４％））；Ｂ：７．０－６．０ｋｂ（频率为２０．６９％）和Ｃ：７．０－６．０－５．４ｋｂ（频率为５５．１７％，在所检测的样本中未观察到６．４ｋｂ的Ｃ４基因片段。     

hIL—13融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）中扩增出的０．３ｋｂ的ｈＩＬ－１３基因片段，经ＤＮＡ重组技术，插入到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２中，转化入感受态的大肠杆菌ＴＧ１中，成功地构建了ｈＩＬ－１３的基因工程表达菌株ｈＩＬ－１３「ｐＧＥＸ－４Ｔ－２／ＴＧ１。经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后表达的ＧＳＴ－ＩＬ－１３融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明分子量约３６ｋＤ、     

联合应用IL—2及IL—4基因转染瘤苗对实验性肺转移…

将ＩＬ－２基因转染的高分泌ＩＬ－２的Ｂ１６黑色素瘤细胞株（Ｂ２）及ＩＬ－４基因转染的高分泌ＩＬ－４的Ｂ１６黑色素瘤细胞株（Ｂ４）制备成新型瘤苗，用以治疗实验性肺转移荷瘤小鼠，并辅以低剂量环磷酰胺，结果表明，荷瘤小鼠存活期明显延长；肺部转移结节数明显减少；两种瘤苗联合治疗后的疗效较单独使用明显，当辅以低剂量环磷酰胺时治疗效果更加明显。体内免疫功能检测表明，经两种瘤苗联合治疗的荷瘤小鼠脾细胞ＮＫ及ＣＴ     

中国人C4Qo表型的C4DNA限制性片段长度多态现象：静息基因的机制初探

对１７例中国人Ｃ４Ａ／Ｃ４Ｂ表型中含有Ｑ０的个体的基因组ＤＮＡ进行了ＨｉｎｄⅢＲＦＬＰ的检测。从五型Ｃ４Ａ／Ｃ４Ｂ（３，０／１，１；３；０／２．１；３．３／１．０：３．２／１．０；３．０／１．０）中共检出５种ＲＦＬＰ片段组合Ａ：３２－２５－１５ｋｂ；Ｂ：３２－１５ｋｂ；Ｃ：２５－１５ｋｂ；Ｄ：３２－１５－８．５ｋｂ；Ｅ：２５－１５－８．５ｋｂ）。根据代表Ｃ４Ａ基因缺失的８．５ｋｂ片段的有无，测出大约５０％的Ｃ４ＡＱ０是由基因缺失造成的。此外，本文还对Ｃ４ＡＱ０时Ｃ４Ｂ长、短基因的分配，Ｃ４ＢＱ０时Ｃ４基因的变动情况等进行了分析与讨论。     

湖北汉族人群C4性片段长度多态性的研究

用限制性内切酶ＴａｑＩ和Ｃ４基因５＇末端探针ｐＡＴ－Ａ检测５８份湖北地区健康献血员基因组ＤＮＡ的Ｃ４基因限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ），观察到７．０ｋｂ、６．０ｋｂ和５．４ｋｂ三种Ｃ４基因片段，它们共组成三种常见的Ｃ４基因ＲＦＬＰ表型，即Ａ：７．０－５．４ｋｂ（频率为２４．１４％）；Ｂ：７．０－６．０ｋｂ（频率为２０．６９％）和Ｃ：７．０－６．０－５．４ｋｂ（频率为５５．１７％）。在所检测的样本     

肿瘤抗原冲击致敏的IL—2基因修饰的巨噬细胞治疗肾癌的实验 …

目的：观察体外肿瘤抗原冲击致敏的白细胞介素２（ＩＬ－２）基因修饰的巨噬细胞对肾癌小鼠的治疗其相关的免疫机理。方法：通过重组腺病毒的介导，将ＩＬ－２基因转入新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞，经肿瘤抗原冲击致敏后回输治疗原位肾癌小鼠，ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测脾脏ＮＫ和ＣＴＬ活性。结果：ＩＬ－２基因修饰的巨噬细胞经肿瘤抗原冲击后体内回输可使肾癌小鼠肺转移结节明显减少，存活期明显延长，４０％肾癌小鼠达到长期存活。     

白细胞介素4基因转移的肿瘤细胞体内诱导杀伤细胞活性及细胞因子产生的实验研究

观察了小鼠接种高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞后体内免疫效应细胞（包括ＣＴＬ、ＮＫ细胞及ＬＡＫ细胞）抗肿瘤活性及其分泌的细胞因子（包括ＩＬ－２、ＩＦＮ－ｒ、ＴＮＦ及ＧＭ－ＣＳＦ）水平的变化，荷瘤后第１５天小鼠脾细胞ＮＫ活性及经诱导后的ＬＡＫ活性有所降低，而经诱导后的ＣＴＬ杀伤活性显著升高，荷瘤小鼠腹腔内巨噬细胞杀伤活性及其分泌的ＩＬ－１水平也明显升高；在荷瘤后第４天及第１２天出现两个高峰，实验结果表明，高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞体内生长受抑制是因为ＩＬ－４基因的导入及ＩＬ－４的分泌使体内ＣＴＬ及巨噬细胞杀伤活性提高，因而使机体抗肿瘤免疫功能得以增强。     

人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达

目的 克隆并原核表达α４亚基笥段。方法 从ＩＬ－６细胞系中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法分两段扩增人整素分子α４亚基片段２．０ｋｂ ｃＤＮＡ,将两片段连接,并将其中的１．７ｋｂ基因片段亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－ＫＧ中,ＩＰＴＧ诱导表达。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了α４的两段ＣＤＮＡ,序列分析表明：与文献报道的μ４ＣＤＮＡ序列基本一致。两片段成功连接后将其中的１．７ｋｂ亚克隆至表达载体ＰＧＥＸ－     

狂犬病毒5aG株核蛋白基因的克隆及序列分析

用ＲＴ、ＲＡＣＥ、ＰＣＲ等方法，从中国狂犬疫苗株（５ａＧ）病毒感染的鼠脑组织中扩增病毒核蛋白基因，用双链测序法进行了全基因核酸序列分析。结果表明：该基因开放阅读框架全长１３５３ｂｐ，编码４５０个氨基酸。与其它３株狂犬病毒核蛋白相比，核酸序列同源性为９０％～９６％，氨基酸序列同源性为９５％～９６％。表明核蛋白保守性较好。     

2011年云南楚雄地区狂犬病疫情分子流行病学研究

目的 针对2011年发生于云南楚雄地区的狂犬病疫情开展分子流行病学调查分析.方法 通过直接免疫荧光试验(DFA)和RT-PCR方法对采集样本进行检测.采用DNAstar中MegAlign软件和MEGA 3.1软件Neighbour-joining(NJ)方法分别进行病毒样本N基因的同源性分析和系统进化分析.结果 在23份脑组织或脑脊液标本中,11份实验室检测结果为阳性,阳性率为47.8％.核蛋白(N)基因同源性结果表明,来自犬只的病毒样本与基因Ⅰ型Asia 1a亚型病毒同源性最高,核苷酸同源性为99.2％ ～ 99.4％之间,与Asia 2c基因亚型病毒核苷酸同源性为88.5％～89.6％.进化树分析结果表明,本研究分离到的病毒样本与Yunnan-ZT07处于同一进化分支内.结论 引发本次疫情的狂犬病毒属于基因Ⅰ型Asia 1a亚群,且此次疫情可能与2007年云南昭通流行毒株Yunnan-ZT07的输入关系密切.     

Molecular characterization of the full-length genome of a rabies virus isolate from India

Rabies is an important public health problem in South East Asia, with cases in this part of the world contributing to about 70% of the global burden. A large number of rabies cases occur in India, however, there is no organized system of surveillance and hence there is a lack of reliable data. Moreover, comprehensive molecular epidemiological studies have not been performed on Indian virus isolates. In this study, we determined the complete nucleotide and deduced amino acid sequence of a primary isolate of rabies virus obtained from the brain of an infected patient. Comparison of the genomic sequence with those of the ten fully sequenced rabies strains available in GenBank showed nucleotide homology ranging from 97% with AY956319 to 81% with AY705373. Amino acid homology of nucleoprotein ranged from 99.7% with AY352493 to 92% with DQ875051. In case of the glycoprotein gene, the homology ranged from 98.8% with AY956319 to 87.2 % with AY705373. An extensive nucleoprotein, glycoprotein, and full-length genome-based phylogenetic analysis was performed along with sequences available from the GenBank. Phylogenetic analysis of the complete genome sequence indicated that this isolate exhibited close homology with the ex Indian strain AY956319. Primer sequences and the scheme of amplification can be availed from the authors on request.     

中国狂犬病固定毒aG株N,NS和M蛋白基因的核苷酸序列测定

报告了中国狂犬病固定毒ａＧ株核衣壳蛋白（Ｎ蛋白），核蛋白壳磷酸蛋白（ＮＳ蛋白，又称Ｍ１蛋白）和基质蛋白（Ｍ蛋白，又称Ｍ２蛋白）蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸推导序列。各基因编码区的全长分别是：Ｎ基因１３５２，ＮＳ基因８９４和Ｍ基因６０９个核苷酸。ａＧ和ＣＶＳ株的Ｎ，ＮＳ和Ｍ基因的核苷酸序列都具有高的同源性，分别为９１．９５％，９０．２７％和９０．８０％。     

湖南3县(市)狂犬病病毒分子生物学研究

目的研究湖南省狂犬病高发区和无病例区动物携带狂犬病的分子生物学特征。方法用直接免疫荧光法检测犬唾液及犬、猫脑标本，以RT．PCR法复核阳性进行遗传学分析。结果武冈市和洞口县送检的82只和17只犬中，分别有12只和1只检测到狂犬病毒抗原与核苷酸阳性，阳性率分别为14．63％和5．88％。凤凰县67份大脑标本未检测出病毒。28份猫脑组织标本也未检测出狂犬病毒。用RT-PCR法扩增阳性大脑组织（编号为Wg13，Dk13）的狂犬病毒N基因，两株病毒之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为99、4％及99．1％；Wg13株与中国疫苗株CTN株和aG株的核苷酸同源性（氨基酸）分别为89．4％（98．2％）、86．1％（95．1％）；Dk13株与中国疫苗株CTN株和aG株的核苷酸同源性分别为89．1％（98．0％）、86．1％（94．9％）。与其他国家分离到的狂犬病毒相比，两株病毒与印度尼西亚的同源性最大，分别为92．8％、93．2％，而与印度、日本及斯里兰卡等其他国家同源性相对较小。结论两株狂犬病毒均为I型狂犬病毒。其N基因的核苷酸序列与当前使用的疫苗株相比，两株病毒与CTN疫苗株分在同一组，同源性较大。     

一种狂犬病实验室诊断用单克隆抗体制备新路线的探索

目的 探索采用合成肽作为免疫原制备狂犬病实验室诊断用单克隆抗体的可行性.方法 以狂犬病病毒CVS-11核蛋白355-369位B细胞线性抗原表位合成肽与钥孔戚血蓝蛋白（Keyhole Limpe hemocyanin,KLH）大分子耦联后免疫BALB/c小鼠,利用经典杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体.采用间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和间接荧光试验（indirect fluorescent assay,IFA）筛选和鉴定杂交瘤细胞株.结果 经过对杂交瘤细胞株上清的间接ELISA和IFA筛选获得阳性杂交瘤细胞株2B1D11,该杂交瘤细胞株产生的抗体经纯化后在IFA中可以有效检出感染犬脑组织和BHK-21细胞的狂犬病病毒.结论 采用合成肽作为免疫原制备狂犬病实验室诊断用抗体在技术上是可行的.     

狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立和阳性对照的制备

目的 建立狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法,制备狂犬病病毒(rabies virus,RV)的假病毒颗粒阳性对照.方法 在RV的N基因保守区设计引物和探针,建立反转录实时荧光定量PCR检测方法,克隆得到噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因(MS2),将其重组到质粒pET-28b(+)中,再将RV的N基因片段重组到MS2下游,经原核表达得到RV假病毒颗粒.结果 实时荧光定量PCR检测RV重组质粒最低检测限为15拷贝/μl,重组表达质粒经原核表达可形成耐RNase的RV病毒样颗粒.结论 建立了反转录实时荧光定量PCR检测RV核酸的方法,成功构建了可耐受RNase且无传染性的RV阳性对照.     

狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白基因的克隆及其重组蛋白在昆虫细胞中的表达

目的从国内狂犬病疫苗ａＧ株中克隆狂犬病病毒糖蛋白（ＧＰ）基因和核蛋白（ＮＰ）基因，应用杆状病毒－昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达。方法从狂犬病病毒感染细胞上清液中提取病毒ＲＮＡ，应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＧＰ基因和ＮＰ基因。扩增的基因与转移质粒连接并转化大肠杆菌，得到重组转移质粒。将其与野生杆状病毒（ＡｃＭＮＰＶ）线性ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，通过有限稀释法筛选含有ＧＰ基因和ＮＰ基因重组病毒。初步检测了重组蛋白的抗原性。结果用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到ＧＰ基因和ＮＰ基因，通过重组转移后重组病毒感染的细胞经免疫印染实验表明可分别表达ＧＰ和ＮＰ重组蛋白。重组蛋白的分子量分别为５８×１０３和５３×１０３。用重组病毒感染的细胞免疫小鼠后可诱导动物产生特异性抗体。结论可以应用杆状病毒－昆虫细胞表达系统表达狂犬病病毒ＧＰ和ＮＰ重组蛋白，为开发基因工程化狂犬病疫苗提供有意义的资料     

小鼠对表达狂犬病毒3aG株糖蛋白的重组复制缺陷型腺病毒的免疫应答

目的研究表达狂犬病毒3aG株糖蛋白(GP)的重组复制缺陷型腺病毒Ad/GP＇及Ad/GP免疫小鼠后所产生的特异性体液免疫应答,体外脾细胞增殖反应,及免疫小鼠对狂犬病毒致死性颅内攻击的保护力。方法1×10     

中国狂犬病毒RdRp基因特点

目的 测定中国狂犬病毒人用疫苗株aG和减毒株CTN181的RdRp编码(L)基因序列并初步研究其结构和功能特点.方法 RT-PCR法获得若干交叉重叠小片段,序列拼接得到完整RdRp编码基因序列,利用生物学软件进行同源性和种系发生分析,并对RdRp保守功能序列和位点进行预测分析.结果 中国狂犬病毒aG和CTN181株的L蛋白分别由6387和6384个核苷酸编码的2128和2127个氨基酸组成,前者比后者在起始部位多编码一个Met.结构功能分析发现在L蛋白上存在若干可能对RNA合成、mRNA聚腺苷酸化和磷蛋白磷酸化以及甲基转移酶的功能起决定作用序列;种系发生树显示中国疫苗株aG相对独立于WHO推荐使用的其他疫苗株.结论 完整L基因结构揭示,对于全面了解中国狂犬病毒分子特征,发现新的功能位点,开发以RdRp为靶标的新型抗病毒药物研究以及弹状病毒科种系发生分析提供了有力的工具.