sFv及重组人IFN—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体，观察其在成骨肉瘤细胞9901中的瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增交经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv-rhIFN－α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，成功构建表达载体pEGFP-sFv-rhIFN－α，并在该载体转梁人成骨肉瘤细胞9901后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实sFv-rhIFN－α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转梁人成骨肉瘤细胞9901中观察到sFv-rhIFN－α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体便于观察转染细胞中sFv-rhIFN－α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

sFv及重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的 :构建pEGFP sFv rhTNF α表达载体 ,观察其在成骨肉瘤细胞 990 1中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM T Easy测序后 ,以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv rhTNF α ,并将其亚克隆至pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,成功构建表达载体pEGFP sFv rhTNF α ,并在该载体转染人成骨肉瘤细胞 990 1后观察融合蛋白表达情况。结果 :酶切鉴定证实sFv rhTNF α融合基因片段已克隆到pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,并在转染人成骨肉瘤细胞 990 1中观察到sFv rhTNF α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论 :pEGFP sFv rhTNF α表达载体便于观察转染细胞中sFv rhTNF α融合蛋白的表达情况及蛋白定位 ,为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

重组人canstatin真核载体的构建及鉴定

目的 构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法 提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatin cDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatin cDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果 成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论 pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

乙醛脱氢酶1A1基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）真核表达载体,并鉴定其生物学功能。方法 通过基因克隆技术获得人ALDH1A1基因cDNA序列;测序正确后,将其连接到真核细胞表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-ALDH1A1表达载体,经酶切鉴定、测序正确后,用脂质体转染技术将pEGFP-N1-ALDH1A1表达载体转染人胃癌细胞株MKN-28细胞,利用免疫印迹法鉴定表达产物,紫外-可见分光光度法测定ALDH1A1活性的改变。结果 成功克隆到人ALDH1A1基因的全长cDNA,经测序与GeneBank序列完全一致;成功构建pEGFP-N1-ALDH1A1表达载体,经Western blotting鉴定显示ALDH1A1在MKN-28细胞中过表达,活性检测证实转染组的ALDH1A1活性较对照组明显升高。结论 成功构建并鉴定了ALDH1A1基因过表达的胃癌细胞模型,为下一步研究ALDH1A1在胃癌中作用机制打下了基础。     

GFP-hTRAIL融合蛋白表达质粒的构建与卵巢癌细胞内表达

目的构建GFP-hTRAIL融合蛋白表达质粒,测定其在卵巢癌细胞中的表达.方法以GFP基因为报告基因,hTRAIL为目的基因,将hTRAIL基因插入GFP基因上游,构建成GFP-hTRAIL融合基因表达质粒,并通过酶切和测序对重组体进行鉴定.经脂质体法转染培养的卵巢癌细胞,用荧光显微镜观察GFP 的表达.流式细胞仪分析转染后卵巢癌细胞的凋亡率.结果测序结果证实构建的为GFP-hTRAIL融合基因表达载体.质粒经脂质体转染后,有大约20% 的卵巢癌细胞表达融合蛋白.流式细胞仪结果表明转染该质粒可诱导卵巢癌细胞凋亡.结论构建了1个可以表达GFP-hTRAIL融合蛋白的新质粒,该表达载体的构建成功为进一步开展卵巢癌的基因治疗奠定了基础.     

ECM1-pEGFP—N2真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的表达

目的构建细胞外基质蛋白1基因（ECM1）的真核表达载体ECM1-pEGFP-N2，检测其在人乳腺癌细胞系MCF-7中表达。方法采用PCR方法，以ECMleDNA为模板，扩增出ECM1基因，用Bg1 Ⅱ和KpnⅠ双酶切ECM1基因和pEGFP-N2载体，连接酶切目的片段，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆酶切、测序鉴定；利用脂质体介导的转染技术转染MCF-7细胞，荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP，免疫组化检测ECM1蛋白表达。结果利用PCR克隆出约1．6kb的ECM1基因；PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果证实成功构建ECM1-pEGFP-N2真核表达载体；转染MCF-7细胞后，可在细胞内观察到报告基因产生的绿色荧光，用免疫组化方法可检测到ECM1蛋白。结论成功构建了ECM1-pEGFP-N2真核表达载体，并在MCF-7细胞中表达，为进一步研究ECM1的功能奠定了基础。     

胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位研究

目的：研究胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位。方法：采用聚合酶链反应（PCR）技术，从pGEM—T质粒上选择性扩增出包含完整ORF在内的人胃癌相关基因GCRG213的DNA片段，将目的片段两端分别引入限制性内切酶PstI和BamHI识别位点，克隆至真核表达载体pEGFP-N1。将测序正确的阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213采用脂质体瞬时转染COS-7细胞，激光共聚焦技术检测GCRG213基因在真核细胞内的蛋白定位。结果：经测序证实，GCRG213正确克隆入真核表达载体pEGFP—N1，组成阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213。测序正确的pEGFP-N1～GCRG213重组子经脂质体转染COS-7细胞，激光共聚焦显微镜观察GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。结论：GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。     

APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株HCT-116中的表达

 目的　构建并鉴定含有APC蛋白不同功能区域的真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5,转染人类结直肠癌细胞HCT-116,观察重组质粒在细胞内的表达。方法　根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,设计特异性引物扩增APC基因特异性的功能区域片段。将扩增出的5个APC片段克隆到pEGFP-N3载体的N端,经测序分析对重组质粒pEGFP-N3-APC1～5进行鉴定。使用脂质体转染法将重组质粒转染人类结直肠癌细胞HCT-116,通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测APC功能区域在细胞内的表达。以RT-PCR法进一步验证重组质粒在细胞中的表达。结果　构建5个pEGFP-N3-APC结构区域的重组真核表达载体,重组真核表达载体转染HCT-116细胞后,细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,5个重组质粒在HCT-116细胞中均可表达。结论　真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能,筛选结直肠癌基因治疗的有效且易于基因操作的靶标片段提供了基础。础。     

PIAS3绿色荧光蛋白表达载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建PIAS3绿色荧光蛋白真核表达载体,探讨外源性PIAS3对胶质瘤细胞U251周期和凋亡的影响。方法：利用RT-PCR扩增人全长PIAS3编码序列,并将其克隆到带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,得到重组质粒pEGFP-N1-PIAS3。应用脂质体法转染体外培养的人胶质瘤U251细胞株。荧光显微镜观察蛋白表达,用RT-PCR和Westernblot检测PIAS3的表达,Annexin V2FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞增殖周期变化。结果：转染PIAS3基因的细胞株外源目的基因和蛋白表达增强,瞬时转染48 h后,光镜下可见部分细胞变圆,部分细胞脱落死亡;对照组和未转染组无明显变化。流式细胞仪分析显示,pEGFP-N1-PIAS3转染组凋亡细胞增多,细胞凋亡率显著高于未转染组和pEGFP-N1转染组,P=0.0073;U251细胞转染pEGFP-N1-PIAS3后细胞周期阻滞于S期,S期细胞比例增高,P=0.025,G2期细胞比例降低。结论：外源性PIAS3使U251阻滞在S期,诱导胶质瘤细胞凋亡。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

靶向治疗肺癌双自杀基因HSV-TK/CD真核表达载体的构建

背景与目的：本研究构建CEA启动子和CMV增强子调控表达的HSV-TK和CD基因双顺反子真核表达载体CMVE—pCEA—TK—IRES—CD。方法：根据特异性引物PCR扩增获得CEA启动子（pCEA），巨细胞病毒的早期基因增强子（CMVE）序列，用基因重组的方法替换载体PIRES-EGFP通用启动子pCMV，得到重组质粒CMVE-PCEA-IRES-EGFP，转染重组质粒到表达CEA的肺癌细胞株中进行绿色荧光蛋白检测，确定启动子能有效启动报告基因在CEA阳性的肺癌细胞中的表达。用PCR扩增得到目的基因HSV—TK和CD，将目的基因HSV-TK和CD亚克隆到载体CMVE-pCEA-IRES-EGFP上，得到自杀基因HSV-TK／CD双表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，双自杀基因真核表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD已成功构建，嵌合启动子CMVE-pCEA调控下能启动下游报告基因在CEA阳性的肺癌细胞株的表达。结论：成功构建了嵌合启动子CMVE-pCEA启动的双自杀基因HSV—TK／CD真核表达载体，为下一步研究双自杀基因对于CEA阳性表达的肺癌的治疗奠定了基础。     

MDR1启动子/荧光素酶质粒的构建及其在朊蛋白高表达胃癌细胞中的活性检测

目的：构建含MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测其在朊蛋白高表达胃癌细胞系中的活性表达。方法：PCR克隆人MDR1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pMD18-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-Enhancer载体中,建立含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL-MDR1,并经测序及酶切确定扩增序列;脂质体基因转染法将pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系SGC7901-PrP,并测定其荧光素酶活性。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,pGL-MDR1转染入朊蛋白高表达胃癌细胞系的荧光素酶活性,较转染入pcDNA3.1空载体细胞系相比升高3-5倍。结论：成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒;上调朊蛋白表达可激活MDR1的转录活性。     

PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的 通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与PTEN融合蛋白真核表达载体的构建和表达,观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响。方法 （1）以RT—PCR方法扩增人的PTEN基因,经T—A亚克隆筛选后连入真核表达载体pEGFP—N1,构建融合蛋白表达载体。采用阳离子聚合物转染试剂,将重组质粒DNA瞬时转染至SHG-44细胞,检测融合蛋白的表达。（2）G418筛选出稳定转染的细胞（SHG-44-Z）,并扩增培养,通过细胞形态学、生长曲线观察PTEN基因对细胞形态和增殖的影响,免疫组织化学法检测对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。结果 （1）重组质粒阳性克隆的测序结果与GenBank报告序列一致。瞬时转染的SHG-44细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光,流式细胞仪可检测到荧光表达量为17．8％,免疫细胞化学法检测到外源PTEN蛋白表达。证实pEGFP—PTEN融合蛋白表达载体构建成功,并在胶质瘤细胞得以正确表达。（2）转染组SHG-44-Z细胞株的生长增殖受到明显抑制,第7天细胞计数为未转染组细胞数的27．8％,且GFAP表达上调。结论携带绿色荧光蛋白的PTEN基因真核表达载体的构建,为进一步研究PTEN的作用机理及抑癌效应奠定了基础。     

ABCE1基因pEGFP重组表达载体构建及转染小细胞肺癌细胞

目的:构建ABCE1基因的pEGFP重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1,并将其转染至小细胞肺癌细胞(NCI-H446),观察其表达,并检测转染前后细胞增殖情况.方法:RT-PCR扩增ABCE1基因cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1重组获得重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1.经酶切,电泳,DNA测序鉴定后应用Fugene-HD将重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1及空载体pEGFP-C1分别转染NCI-H446细胞,观察pEGFP-C1-ABCE1和pEGFP-C1在小细胞肺癌细胞的表达,MTT法检测转染ABCE1基因对小细胞肺癌细胞增殖的影响.结果:ABCE1基因cDNA片段成功重组到pEGFP-C1载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的cDNA片段为ABCE1基因.荧光显微镜观察转染pEGFP-C1- ABCE1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白主要在胞浆表达而转染pEGFP-C1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白在胞浆及胞核均有表达.MTT实验提示转染pEGFP- C1-ABCE1的细胞与转染pEGFP-C1和未转染的同类细胞相比增殖能力明显增加.结论:成功构建了pEGFP-C1-ABCE1真核细胞重组表达载体,并将该载体转染入小细胞肺癌细胞,该载体的绿色荧光主要在NCI-H446细胞胞质表达,提示ABCE1基因可能主要在胞质表达.该基因与小细胞肺癌的增殖活性有关.     

CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的： 应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的CYP2E1 基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制 研究。     

带TAP标签的癌蛋白SET真核载体的构建及其表达

背景与目的: 为研究三氯乙烯诱导的差异蛋白SET在肝细胞L-02中的相互作用,构建带串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1/SET-TAP。 材料与方法: 从L-02肝细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增SET基因,从质粒中扩增得到TAP基因,采用重叠PCR法将基因SET与TAP连接成SET-TAP,双酶切后纯化序列定向克隆至pcDNA3.1/zeo(+)并转化E.coli DH 5α ,取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,重组质粒瞬时转染L-02肝细胞进行表达,Real Time-PCR和Western blotting检测融合蛋白的表达。 结果: 经双酶切和DNA测序鉴定,证实pcDNA3.1/SET-TAP真核表达载体构建成功,将该载体转染L-02细胞后,融合蛋白在肝细胞中获得高效表达。 结论: 该结果为研究SET在三氯乙烯致肝细胞毒性的蛋白质相互作用以及三氯乙烯致机体损伤的机制奠定了基础。