花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体的制备与应用

目的制备与鉴定抗花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体,建立双单抗ELISA法,检测食品中花生过敏原。方法以花生主要过敏原Ara h1为抗原免疫Balb/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA法和Western blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性。建立双单抗夹心ELISA法检测食品中的花生过敏原。结果共获得抗Ara h1细胞株4株,分别命名为2G9、5G4、5B5、2C7,效价均高于1∶106。经抗体亚型鉴定,4株抗体均为Ig G1型。Western blot的结果表明4株抗体均能识别Ara h1,其中2G9与5G4结合能力较强。在特异性检测实验中,2G9和5G4与其他种类过敏原无交叉反应。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现花生Ara h1蛋白的检出低限为:5 ng/ml,标准曲线在~80 ng/ml范围内线性良好。利用此法检测了10种食品,结果显示在5种含有花生成分的食品中均检测到了花生过敏原。结论获得高效价抗体4株,建立了高效、高特异性的食品中花生过敏原的检测方法,为食品中花生过敏原的检测提供了依据。     

抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。方法利用重组Derf1蛋白为免疫原,免疫BALB／c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,其Ig亚型均为IgG1,且6株单抗均具有良好的效价。ELISA和Western—blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组Derf1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Derf1检测及纯化方法奠定了基础。     

平榛主要过敏原Corh1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb)。方法用重组Cor h 1蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白A亲和层析法纯化抗体。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该McAbs的特性和交叉性。结果获得4株可稳定分泌鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的McAbs,其Ig亚型均为IgG1,均具有良好的效价;ELISA和Western Blotting分析表明该4株单抗均能识别重组Cor h 1蛋白,其中3株单抗能够识别天然平榛提取物。结论成功制备了4株鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体,为建立平榛主要变应原Cor h 1检测及纯化方法奠定了基础。     

一对高亲和力抗人肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的 获取抗人肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的单克隆抗体（McAb）.方法 以人cTnI作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了抗人cTnI高亲和力、高特异性单克隆抗体.随后采用间接ELISA法测定抗血清效价,用protein G亲和纯化法纯化抗体,抗原竞争ELISA法鉴定抗体亲和力,SDS-PAGE法鉴定纯度,Western blotting鉴定抗cTnI单克隆抗体的特异性,竞争ELISA法分析抗原结合位点.结果 筛选出9株稳定分泌抗cTnI的单抗杂交瘤细胞株,其中A3、A9两株免疫球蛋白亚类均为IgG2a,分泌的抗体纯度高,与CK-MB、cTnT无交叉反应,效价均为：1：1024000,亲和力分别为4.21×10^8mol/L、1.07×10^8mol/L,抗原结合位点不同.结论 成功制备出了一对高亲和力、高特异性抗人cTnI单克隆抗体.     

C-myc单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备与鉴定鼠抗C-myc蛋白单克隆抗体。方法利用C-myc蛋白做免疫原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆、单克隆抗体Ig亚型鉴定,获得2株能够稳定分泌抗C-myc特异性抗体的杂交瘤细胞株,再将杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔诱使小鼠产生腹水。结果获得2株可稳定分泌抗C-myc抗体的杂交瘤细胞株,命名为SHH-1H11,SHH-2A9,Ig亚型分别为IgG1亚类和IgM。细胞培养上清效价分别为1:10240、1:5 120;小鼠腹水效价分别为1:64 000、1:32 000。结论制备的C-myc单克隆抗体仅与C-myc蛋白反应,与其他蛋白没有交叉反应,表明获得的单克隆抗体的特异性很高。     

自制NSE单抗的鉴定及其双抗夹心ELISA方法的建立

目的:制备并鉴定NSE(Neuron-specific enolase)单克隆抗体,建立可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA方法。方法:用本实验室已表达纯化的NSE融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用WB、IP、IF、IHC等方法对获得的NSE单抗进行鉴定及亚型检测。利用辣根过氧化物酶标记纯化后的NSE单抗,建立一个可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA法。结果:通过分析和鉴定,选定2株可稳定分泌抗NSE抗体的杂交瘤细胞株,效价达4.2×107～6.5×107,亚型为IgG2b。免疫印迹结果显示,该抗体不仅能识别细胞内源NSE蛋白,还能识别分泌到细胞培养上清液中的NSE蛋白,此外还可用于免疫荧光及免疫组化检测。文中所建立的双抗夹心ELISA法,最低检测极限为8.85 ng/ml。结论:成功获得了效价高、灵敏度好及特异性强的NSE单抗,建立了一个双抗体夹心ELISA检测系统,具有良好的临床应用前景。     

抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的制备抗3-硝基酪氨酸(3-NT)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性。方法用化学合成方法将3-NT与OVA用戊二醛偶联合成的人工抗原3硝基酪氨酸-戊二醛-鸡卵白蛋白(3NT-G-OVA)作为免疫原,皮下注射免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,扩大培养并对抗体进行免疫学鉴定与分析。结果获得1株稳定分泌抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗亚型为Ig G2a;纯化后的抗体效价为1∶(6.14×106);单抗亲和力常数为7.81×107(L·mol-1);Western blot检测证明该单抗与含有3-硝基酪氨酸的蛋白能特异地结合。结论制备了1株具有较高免疫学活性和特异性的抗3-NT单克隆抗体,并可用于Western blot检测病人样本中的蛋白硝基化水平。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

重组人碱性成纤细胞生长因子单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)单克隆抗体,鉴定其特性,建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法以rhbFGF为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗rhbFGF杂交瘤细胞株,制备抗rhbFGF单克隆抗体,采用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗体亚类,间接ELISA法检测抗体效,Western blot鉴定抗体特异性。HRP标记McAb并建立夹心ELISA检测方法。结果获得2株(分别命名2D3、5F7)可分泌特异性McAb的强阳性细胞株,腹水抗体效价在10-5以上,IgG亚类均为IgG1,轻链为K链。Western blot证明2株McAb特异性良好,双抗体夹心ELISA检测rhbFGF最低检测限达到2 ng/ml。结论成功制备高效价的抗rhbFGF单克隆抗体,建立抗rhbFGF双抗体夹心ELISA定量检测方法。     

粉尘螨变应原第5组分单克隆抗体的制备与鉴定

本研究制备并鉴定了鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。将质粒pET28a(+)-Der f 5转化ArcticExpress(DE3)感受态细胞,取单个菌落接种培养,加入IPTG诱导表达,经纯化获得Der f 5重组蛋白。利用Der f 5重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏细胞与其骨髓瘤细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌抗体的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。通过间接ELISA、Western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。最终获得3株稳定分泌鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的高效价单克隆抗体。研究分析表明该3株单抗均能识别重组Der f 5蛋白和天然的粉尘螨提取物。本实验成功制备了3株鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der f 5检测及纯化方法奠定了基础。     

雪卡毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备雪卡毒素的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以雪卡毒素类似物莫能菌素为半抗原,分别采用混合酸酐法将其与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联合成免疫抗原M-BSA,碳二亚胺法与卵清白蛋白(OVA)偶联合成包被抗原M-OVA。以M-BSA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤。以自制雪卡毒素提取物为竞争抗原,间接竞争ELISA法筛选稳定分泌雪卡毒素抗体的特异性细胞株。小鼠体内诱生腹水,辛酸硫酸铵沉淀法进行纯化。采用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得抗体的亚型,间接竞争ELISA法鉴定抗体的特异性和交叉性。结果获得3株稳定分泌抗雪卡毒素抗体的杂交瘤细胞株1D5、2G11、3G11,其Ig亚型均属于IgG1亚型。交叉反应结果表明3株单克隆细胞产生的抗体除与莫能菌素有较高的交叉反应外,与其他雪卡毒素类似物均无明显交叉反应。结论成功筛选到了分泌雪卡毒素抗体的细胞株,为雪卡毒素免疫分析方法的进一步研究奠定基础。     

抗鸡免疫球蛋白(IgM、IgG)单克隆抗体的制备与鉴定

本文报道将SRBC免疫鸡的血清经33％硫酸铵沉淀,再经Sephadex G-200凝胶柱两次层析,收集第Ⅰ,Ⅱ蛋白峰作为免疫原免疫BALB/c小鼠。建立了2株(3A7、1C4)分泌抗鸡IgG和4株(6AS、5E2、6C7、6B1)抗鸡IgM特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系;琼脂扩散试验表明6株细胞系分泌的单克隆抗体均为IgG1亚类。所制腹水的ELISA滴度达10~5～10~6。用免疫印迹技术(IB,Immunobllotting)对其中2株(3A7和6A5)的特异性作了进一步鉴定。     

抗人类免疫缺陷病毒gp41和丙型肝为病毒NS3杂交？…

目的 为检测血清中人类免疫缺陷病毒和丙型肝炎病毒抗原提供血清学指标。方法 用纯化的重组ＨＩＶ和ＨＣＶ抗原蛋白作为联合免疫原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取脾细胞与Ｓ２／０小鼠骨髓瘤细胞融合,并采用挑单个细胞的方法进行一次克隆。结果 分别获得４株和６株能稳定分泌高效价抗ＨＩＶ和ＨＣＶ抗的蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

抗人类免疫缺陷病毒gp41和丙型肝炎病毒NS3杂交瘤细胞株的建立

目的为检测血清中人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）和丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）抗原提供血清学指标。方法用纯化的重组ＨＩＶ（ｇｐ４１）和ＨＣＶ（ＮＳ３）抗原蛋白作为联合免疫原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞与Ｓｐ２／０小鼠骨髓瘤细胞融合，并采用挑单个细胞的方法进行一次克隆。结果分别获得４株和６株能稳定分泌高效价抗ＨＩＶ（ｇｐ４１）和ＨＣＶ（ＮＳ３）抗原蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株。初步建立了双抗体夹心法检测ＨＩＶ（ｇｐ４１）和ＨＣＶ（ＮＳ３）抗原的酶联免疫吸附试验。结论本方法是建立单抗杂交瘤细胞株的快速方法，所建杂交瘤细胞株特异性强，效价高，分泌抗体性能稳定，有推广价值。     

鼠抗人PD-L1单克隆抗体的研制和生物学活性鉴定

目的 研制鼠抗人PD-L1功能性单克隆抗体,并对其生物学活性进行鉴定.方法 以前期原核表达的人硫氧还原蛋白-（PD-L1）融合蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,Western-Blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞,竞争抑制法ELISA实验鉴定抗体的特异性亲和力,小鼠腹水法作大量抗体制备.结果 获得4株能够稳定分泌特异性抗PD-L1抗体的杂交瘤细胞,经验证所分泌的抗体具有较强的特异性亲和力,经过大量抗体制备和纯化获得效价大于1∶32000的纯化抗体;同时获得1株能稳定分泌抗硫氧还原蛋白抗体的杂交瘤.结论 成功制备了鼠抗人PD-L1单克隆抗体,为下一步应用研究奠定了基础.     

志贺氏菌常见菌单克隆抗体的制备和应用

本文利用杂交瘤技术,参照现抗原表,建立了一组能稳定分泌抗志贺氏菌常见菌型的单克隆抗体杂交瘤细胞系共42株,从中选用了包括抗福氏菌群全部型和群抗原抗志贺氏菌Ⅰ、Ⅱ型及宋内氏菌的单克隆抗体细胞系19株。用这组单克隆抗体组成的小套试剂盒,经以实验室标准菌种及4个省市地方菌种验证。结果表明完全可以代替传统的诊断血清,用于志贺氏菌的检验。另外表明,抗福氏志贺氏菌型群抗原的单克隆抗体还可进一步用于该菌抗原关系的分析。     

抗人心肌单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步研究

本文以人心肌抗原免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,获2株(2F_1和1F_6)分泌抗人心肌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。免疫印迹试验证明,细胞培养上清及小鼠腹水中的特异性抗体均能与分子量为55KD蛋白带结合。抗原阻断试验结果,证明获得的两株单抗是人心肌抗原特异的。染色体数分别为102条和96条。1F_6和2F_1的Ig亚类型均为IgG_1。间接免疫荧光呈肌束膜型,ABC免疫组化显示肌束膜和肌原型(胞浆)。     

肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定

 目的 制备出高效价的抗人肺鳞癌单克隆抗体。方法 以云南个旧肺鳞癌细胞YTMLC -90免疫的Balb/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1、SP2/0细胞为亲代细胞,应用鼠-鼠杂交瘤技术建立杂交瘤细胞系。ELISA法筛选,有限稀释法克隆化培养,ELISA法测定抗体效价,双抗体夹心法鉴定Ig亚类,制备染色体,Giemsa染色计数染色体数目,ABC免疫组化法行不同组织细胞的交叉检测。结果 获得三株稳定分泌抗YTMLC-90细胞抗体的杂交瘤细胞株S2D1、N2D1及N3C5。培养上清效价分别为1∶512、1∶284及1∶1024,腹水效价分别为1∶105、1∶104及1∶104;Ig亚类分别为IgG1、IgG2a及IgG3;染色体众数在90～110之间;三株抗人肺鳞癌单克隆抗体与其它组织细胞无交叉反应性。杂交瘤细胞体外传代培养6个月仍保持抗体稳定分泌。结论 成功制备高效且特异的抗人肺癌单克隆抗体。