白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析

根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的 5′ 末端核苷酸序列 ,设计 2个反向特异引物 (GSP1和GSP2 ) ,利用 4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA ,消化产物与适配子连接产生 4种消化的DNA库 ,并分别以此为模板 ,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第 1步PCR扩增 ,然后再以第 1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第 2次PCR扩增。将扩增产物进行T A克隆及测序。结果显示 :分别以DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ消化的DNA库为模板而获得 4个长短不一的DNA序列 :80 6bp、 2 190bp、 3 0 76bp和 2 2 0 6bp ,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′ 非翻译区序列及氨基端开头 10个氨基酸的编码序列 ;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和 或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件。表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因 4个上游启动子区序列 ,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P45 0基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用     

博尔纳病病毒与慢性格林-巴利综合征

博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus,BDV)是单股负链RNA病毒,能引起多种动物持续性中枢神经系统感染,导致免疫介导的脑脊髓炎,并与某些人类神经精神疾病有关。本研究旨在探讨BDV感染与格林 巴利综合征(GBS)发病的关系。疾病组为临床诊断的GBS共15例,男10例,女5例,平均年龄37.2岁。15例GBS中急性12例,慢性3例。对照组112例系健康献血者。荧光定量套式RT PCR试剂盒由本校神经疾病研究所和中山大学达安基因诊断中心合作开发,引物和荧光探针序列见表1,扩增BDVp2 4基因片段为86bp。表1　PCR引物和荧光探针序列外引物:P1:5′TGACCCAA…     

牙龈卟啉单胞菌prtH基因分布与多态性研究

目的　分析牙龈卟啉单胞菌 (P .gingivalis)prtH基因的遗传多态性 ,从而了解细菌变异与其对牙周致病作用的相关性。方法　以PCR技术从牙周炎患者口腔中分离的P .gingivalis进行prtH基因扩增 ;采用斑点杂交法 ,以生物素标记prtH基因为探针 ,与以引物B进行PCR扩增为阳性的P .gingivalis基因组DNA杂交 ;对PCR产物进行AluⅠ限制性酶切和DNA测序分析。结果　以prtH基因A、B引物对 14 0株临床分离株进行PCR扩增 ,分别在 76例 (引物A)和 117例 (引物B)出现阳性扩增产物 ,阳性率分别为 5 4 .2 %、84 %。对 34例引物B扩增阳性的P .gingivalisDNA进行点杂交检测 ,阳性吻合率为 82 .4 %。与GenBank中菌株ATCC332 77(U15 2 82 )和W83(L2 74 83)的prtH基因序列相比 ,5株P .gingivalisPCR扩增产物的测序存在着缺失和点突变。结论　在慢性牙周炎患者临床P .gingivalis分离菌株中存在着prtH基因的遗传多态性 ,本实验建立了具有高度敏感性和特异性的PCR检测方法     

十二指肠溃疡和慢性胃炎患者24小时胃内pH值变化

目的:比较十二指肠溃疡和慢性浅表性胃炎(CSG)患者24 h胃内pH值的变化。方法:选择十二指肠溃疡活动期患者17例和慢性浅表性胃炎(CSG)患者10例。将pH锑电极放置于受试者胃体中,然后连于便携式记录仪(Digitrapper MkⅢ)记录24 h胃内pH值的变化,记录毕将数据输入计算机用Polygram软件进行分析。结果:十二指肠溃疡患者组pH≤2时间百分比明显高于CSG组(P＜0.05),而pH＞4时间百分比则低于CSG组(P＜0.05)。十二指肠溃疡患者夜间pH≥4的时间和pH平均值明显低于CSG组 (P＜0.01)。十二指肠溃疡患者缺乏夜间pH≥4时,其发生夜间上腹疼痛的比率明显高于存在夜间pH≥4的患者(P＜0.05)。 结论:十二指肠溃疡患者胃酸水平高于CSG组,特别是夜间pH值水平明显降低,这可能与十二指肠溃疡患者夜间疼痛有关。     

阿尔茨海默病与蛋氨酸合成酶基因多态性的相关性探讨

目的　探讨蛋氨酸合成酶 (MS)基因A2 75 6G突变在阿尔茨海默病 (AD)发病中的意义。方法　PCR扩增 6 6例AD患者及 14 3例对照者的MS基因突变点 ,经限制性内切酶消化后行凝胶电泳确定其基因型。结果　MS基因片段PCR扩增产物长度分别为 189bp。MSA2 75 6G突变的G等位基因PCR扩增产物经HaeⅢ消化后裂解成 15 9和 30bp两个片段 ;MAD组A2 75 6G基因型频率 (% )分别为 98 4 8、1 5 2和 0 0 0 ,对照组分别为 98 6 0、1 4 0和 0 0 0 ,MSA 2 75 6G各种基因型频率在患者组与正常对照组之间的差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　MS多态性与AD无明显相关。     

PCR-SSP结合测序分析快速筛选HLA-A*0201亚等位基因

建立相对简单经济的检测HLA A 0 2 0 1等位基因的方法 ,以便于从特定人群中快速筛选HLA A 0 2 0 1阳性的个体 ,满足科研的需要。根据第十二届HLA国际联合会提供的标准操作规程和一对HLA A位点特异性的引物 ,从外周血中提取基因组DNA ,扩增HLA A基因 ;再设计两对HLA A2组特异性引物 ,采用套式PCR分别扩增HLA A基因的 5’端和 3’端 ,如出现特异条带 ,则将后两对引物的PCR产物进行测序分析 ,对照HLA A2组等位基因的第 2和第 3外显子序列图 ,确定是否为HLA A 0 2 0 1 1～ 0 2 0 1 6的 6个等位基因。结果 :以HLA A 0 2 0 1阳性的T2细胞株为阳性对照进行检测 ,结果完全正确 ,并设立非HLA A 0 2 0 1的A2细胞株RML (HLA A 0 2 0 4 )及Raii细胞株 (非A2组 )为对照 ,同时随机检测 30份门诊病人血样 ,其中 7份为HLA A2阳性 ,经测序 ,2例为HLA A 0 2 0 1 1 ,1例为HLA A 0 2 1 1或 0 2 35 ,1例是HLA A 0 2 0 6或0 2 2 1或 0 2 4 1或 0 2 4 4或 0 2 5 1或 0 2 5 4 ,1例是HLA A 0 2 0 5或 0 2 1 4 ,1例是HLA A 0 2 34或 0 2 35 ,1例是 0 2 5 0。本方法利用位点特异性引物进行 2～ 3次PCR扩增 ,结合PCR产物测序便可相对简便经济地检测出HLA A 0 2 0 1的全部 6个亚等位基因 ,为快速检测其他特定HLA等位基因?     

白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析

根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库,并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.将扩增产物进行T-A克隆及测序.结果显示分别以Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ消化的DNA库为模板而获得4个长短不一的DNA序列806bp、2 190bp、3 076bp和2 206bp,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′-非翻译区序列及氨基端开头10个氨基酸的编码序列;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和/或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件.表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因4个上游启动子区序列,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P450基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用.     

联合PCR技术克隆白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因及其生物信息学分析

目的测定白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶的基因的全长序列并用生物信息学方法分析其结构和功能。方法从白纹伊蚊卵、幼虫、蛹、雌蚊、雄蚊中提取总RNA,逆转录后以总cDNA为模板,设计简并引物进行巢式PCR,扩增部分序列后设计新的特异性引物补全5’端序列,使用3’-RACE法补全3’端序列,拼接全长后进一步进行生物信息学分析。结果通过巢式PCR扩增出1145bp的核苷酸序列,测序后设计5’端序列的下游引物,扩增出约900bp的核苷酸序列,设计3’端的上游引物,配合3’RACE试剂盒扩增出约600bp的核苷酸序列,寻找重复序列将三段序列进行拼接,得到国内外从未获得的长2244bp、编码747个氨基酸序列的白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因的全长序列。生物信息学分析其与白纹伊蚊的相似性最高,为含信号肽的跨膜蛋白,含3个Cu氧化酶超家族位点,属于蓝色多铜氧化酶家族。结论联合PCR技术的应用使较长长度的基因序列的扩增更为方便、准确。为进一步对其进行功能的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌lpp20基因的克隆及序列分析

幽门螺杆菌 (Hp)lpp2 0基因编码Hp外膜上的一种相对分子质量约为 18× 10 3的脂蛋白 (Lpp2 0 )。有研究表明 ,Lpp2 0具有良好的免疫原性和免疫保护性 ,是一种理想的疫苗候选抗原。本研究对Hp郑州分离株MEL HP2 7lpp2 0基因进行克隆和测序 ;通过对 7株Hplpp2 0基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列进行同源性分析 ,确定Hplpp2 0基因的变异性。采用由本研究室从郑州当地慢性萎缩性胃炎患者体内分离的HpMEL HP2 7菌株 ,应用自行设计的PCR引物 :上游 5′ GCCGAATTCATGAAAAATCAAGTTA 3′(EcoRⅠ ) ,下游 5′ GCCGTCGACCTA…     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建

目的 :构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。方法 :抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫总RNA ,进行反转录合成第 1链cDNA ;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR ,合成全长双链cDNA ;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,然后经 1 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,回收 40 0bp以上的组分 ,并与λTriplEx2载体连接 ;连接产物经体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度 ;随机挑取 9个噬菌体 ,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增 ,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 :经检测 ,未扩增文库滴度达 2 0× 10 7pfu mL ,重组效率在 10 -4 稀释度时每块平板约 2 10～ 2 5 5个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑 ,扩增文库滴度达 1 75× 10 9pfu mL ;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定 ,结果显示 :所选 9个噬菌体中均含有重组的cDNA ,并且均在 5 0 0bp以上 ,其中 1kb以上的有 2个、 70 0bp的有 5个、 5 0 0bp的有 2个。结论 :已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。     

HLA-G非编码区单核苷酸多态性与不明原因反复流产的相关性

目的研究人类白细胞抗原G(HLA-G)非编码区5′URR基因单核苷酸多态性和3′UTR 14 bp基因插入/缺失单核苷酸多态性与不明原因反复性流产相关性。方法病例组为不明原因反复性流产史患者(流产次数≥2)112例和有正常妊娠史无流产史的妇女(对照组)112例,留取EDTA-K2抗凝全血提取DNA。采用PCR技术扩增HLA-G 3′UTR 14 bp和HLA-G5′URR基因,3′UTR 14 bp扩增产物通过凝胶电泳分型,直接计数法比较2组间基因型频率、等位基因频率分布。HLA-G 5′URR基因PCR产物送公司测序,在线SHEsis软件比较2组间基因型频率、等位基因频率分布。结果 HLA-G 3′UTR 14 bp插入/缺失多态性基因型频率和等位基因频率在2组间差异无统计学意义(P0.05),HLA-G 5′URR等位基因-725G在2组间差异有统计学意义(P0.05)。HLA-G 5′URR-725GG基因型频率在2组间差异有统计学意义(P0.05)。结论 HLA-G 5′URR-725G等位基因和HLA-G 5′URR-725GG基因型可能是不明原因反复流产易感性基因,而HLA-G 5′URR-725C等位基因可能是不明原因反复流产保护性基因。     

PCR检测龈下菌斑中齿垢密螺旋体与牙周组织破坏的关系

目的　建立龈下菌斑标本中齿垢密螺旋体PCR临床快速检测方法 ,了解齿垢密螺旋体感染与慢性牙周炎牙周组织破坏程度之间的关系。方法　 81例慢性牙周炎患者每例采取 2个不同患牙牙位的龈下菌斑标本 ,用终浓度为 1%的TritonX 10 0 10 0℃水浴 10min处理标本以制备DNA模板 ,用PCR检测标本中齿垢密螺旋体特有的相对分子质量 (Mr)为 5 3× 10 3 外膜蛋白基因 (tdpA)扩增片段。结果　 6 7例患者 ( 82 .7% )的 2份龈下菌斑标本齿垢密螺旋体tdpAPCR均为阳性 ,9例患者( 11.1% )的其中 1份龈下菌斑标本可见目的扩增片段 ,5例患者 ( 6 .2 % )的 2份龈下菌斑标本PCR均为阴性 ,16 2例龈下菌斑PCR检测总阳性率为 88.3% ( 143 16 2 )。牙槽骨吸收 >2 3和牙周袋深度≥7mm患牙龈下标本的PCR阳性率较高 (P <0 .0 5 ) ,牙龈指数与PCR阳性率无明显关系 (P >0 .0 5 )。结论　PCR检测tdpA基因可用于慢性牙周炎龈下标本中齿垢密螺旋体的临床快速诊断 ,齿垢密螺旋体感染与牙周组织破坏密切相关。     

HP检测在上消化道疾患中诊断价值的探讨

本文对 5 5 8例上消化道疾患的病人用14 Ｃ -尿素呼气试验进行了幽门螺杆菌 (ＨＰ)感染率的检测。结果表明十二指肠球部溃疡阳性率为 86 % ;慢性浅表性胃炎阳性率为 70 % ;浅表萎缩性胃炎阳性率为 49% ;糜烂性胃窦炎阳性率为47 4% ;慢性胃窦炎阳性率为 38% ;提示了14 Ｃ -尿素呼气试验对ＨＰ感染的检测有一定的临床诊断价值。材料和方法一、对象 :标本采自我院从 2 0 0 0年 1月～ 2 0 0 1年 1月期间 ,来消化科门诊和住院应各种消化道症状就诊的患者 ,并经内窥镜检查确诊为消化道疾病的 5 5 8例患者 ,进行了14 Ｃ -尿素呼气试验。其中男性 32…     

PCR法解脲脲原体分群和四环素耐药检测

目的 建立解脲脲原体(Ureaplasma urealyxicum，Uu)的分群和四环素耐药PCR检测方法。方法 1．根据Uu的多带抗原(multi—banded antigen，MBA)基因序列自行设计引物(P15′-ATT，TGC，AAT，CTT，TAT，ATG，TT；P25′-TTC，AGC，TGA，TGT，AAG，TGC，AGC，ATT，AAA，T)，并建立分群PCR反应体系。2．根据TetM基因序列自行设计引物(P15′-TTA，TCA，ACG，GTT，TAT，CAG，G；P25′-GCT，ATA，TAT，GCA，AGA，CG)，并建立四环素耐药反应体系。结果 1．MBA基因PCR能将Uul4个血清型正确分为二个生物群，其中生物一群(1、3、6、14等4个血清型)出现404bp的产物带，生物二群(2、4、5、7、8、9、10、11、12、13等10个血清型)出现448bp的产物带。60株Uu临床分离株经MBA基因PCR检测，生物一群53例、生物二群6例、生物一／二群同时存在1例。2.Uu典型株14个血清型，TetM基因PcR扩增的不能出现任何条带；60株Uu临床分离株经TetM基因PCR检测41例出现目的条带。结论 PCR法进行Uu生物分群和四环素耐药检测简单、快速，为相关研究提供了手段。     

从MT2、HeLa细胞DNA及人和黑猩猩PBMC DNA中扩增GBV-C核苷酸

目的　检测MT2和HeLa细胞DNA、6例人和 1例黑猩猩PBMCDNA中是否存在与GBV C同源的核苷酸序列。方法　直接以上述DNA为模板、采用GBV C 5′ NCR和NS3区引物的直接套式PCR(dPCR)、核苷酸序列分析、引物介导原位扩增 (PRINS)NDA序列特异荧光标记技术。结果　从MT2和HeLa细胞DNA、4例人PBMCDNA标本中获得 5′ NCR引物扩增片段 ,从MT2和HeLa细胞DNA、5例人和黑猩猩PBMCDNA标本中获得NS3区引物扩增片段。这些扩增产物的核苷酸序列与GBV C同源性分别为 74 2 9%～ 77 14%和 73 80 %～ 79 15 %。PRINS检测结果显示 ,dPCR阳性的PBMC及其染色体上有荧光着色。结论　MT2和HeLa细胞DNA、人和黑猩猩PBMCDNA中存在与GBV C 5′ NCR和 或NS3区同源性较高的核苷酸序列 ,这些序列可能位于dPCR阳性的PBMC染色体上。     

汉、蒙古族人MBL基因ExonⅠ54位密码子点突变频率及其血浆含量相关性研究

目的　调查健康汉、蒙古族人甘露 (聚 )糖结合凝集素 (MBL)基因 5 4位密码子点突变的情况 ,测定健康汉、蒙古族人血浆MBL含量 ,并对健康汉、蒙古族人MBL基因 5 4位密码子点突变频率与其血浆MBL含量进行相关性分析。方法　PCR扩增 ,测定序列并建立MBL基因点突变检测方法 ,即PCR RFLP方法 (BanⅠ酶切 ) ;用ELISA法测血浆MBL含量。结果　 (1)建立了MBLPCR方法 ,该方法特异性高 ,重复性好 ,最低检出量为 16 0pgDNA。 (2 )MBL的限制性内切酶BanⅠ酶切结果 :通过酶切电泳分析结果显示 ,所扩增标本出现下列 3种情况 :①MBL 5 4位密码子野生型纯合子为 2条带 ,对应的相对分子质量为 2 32bp和 93bp ;② 5 4位密码子突变体纯合子只显示 1条约 32 5bp带 ;③ 5 4位密码子野生型突变体杂合子显示 32 5bp、2 32bp和 93bp 3条带。 (3)通过简单数基因计算MBL基因5 4位密码子点突变的频率 ,健康汉、蒙古族人基因突变频率分别为 0 .2 32 1和 0 .175 7。 (4 )血浆MBL含量的测定 :5 6例健康汉族人血浆MBL含量的平均值为 1998.75 0 μg L ,标准差为 15 0 5 .15 2 ;37例健康蒙古族人血浆MBL含量的平均值为 2 5 2 5 .6 76 μg L ,标准差为 195 5 .188。 (5 )健康汉族人血浆MBL含量与其编码基因ExonⅠ 5 4位密码子的点突变频率 ,     

胃癌患者血清β2—mRIA的临床意义

本文报告我院68例胃病患者(其中良性胃病48例,胃癌20例)胃镜检查同时辅以血清β_2-m测定,评价其对胃癌的临床意义。 材料和方法 一、临床资料:68例(男38,女30),均为因胃部疾患而作纤维胃镜检查明确诊断的患者。年龄19～68岁,平均41岁。经胃镜检查确诊的胃部良性疾病共48例(慢性浅表性胃炎24例,慢性萎缩性胃炎11例,胃溃疡6例,十二指肠球部溃疡4例,残胃炎3例)。胃     

人肝细胞生长因子α原核表达体系的构建及表达

人肝细胞生长因子(humanhepato cytegrowthfactor,hHGF)由α和β链组成,为进一步研究hHGFα的生物学功能,我们采用转录前加工修饰方法,构建了hHGFα原核表达体系。根据人HGF全长基因序列设计引物,上游5′ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA 3′;下游5′ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTGTTTCG 3′。以含有hHGFcDNA全序列的质粒pRC/CMV hHGF为模板扩增全长1340bp的hHGFαcDNA ,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后,回收纯化目的条带,以XhoⅠ切为386和95 4bp 2个片段,再分别用EcoRⅠ和BamHⅠ消化后亚克隆入载体pBS…     

巢式PCR检测龈下菌斑中HCMV、EBV、HSV-1与慢性牙周炎活动性的关系

目的　建立临床检测龈下菌斑标本中人巨细胞病毒 (HCMV)、Epstein Barr病毒 (EBV)、单纯疱疹病毒 1型 (HSV 1 )巢式PCR方法 ,研究这 3种病毒与慢性牙周炎活动性的关系。方法　收集6 2例慢性牙周炎患者 (男性 2 7例、女性 35例 ,平均年龄 5 3岁 )的牙周炎活动部位、牙周炎静止部位的龈下菌斑 ,提取DNA后使用巢式PCR检测HCMV、EBV、HSV 1 ,比较分析其在同一病人不同部位的检出率。结果　牙周炎活动部位的HCMV检出率为 38.7%,EBV的检出率为 5 8%,HSV 1的检出率为30 .6 %,两种以上病毒合并感染的检出率为 4 0 .3%;牙周炎静止部位的HCMV检出率为 1 4 .5 %,EBV为 2 2 .6 %,HSV 1为 1 1 .3%,两种以上病毒合并感染的检出率为 1 1 .3%。这 3种病毒及其合并感染在牙周炎活动部位的检出率均高于牙周炎静止部位 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论　提示HC MV、EBV、HSV 1与慢性牙周炎的活动性相关。     

结核分支杆菌3种不同靶基因传统PCR巢式PCR检测比较研究

本文以结核分支杆菌的插入序列基因、6 5KDa抗原基因和rpoB基因为靶基因 ,系统地比较了以 1对引物扩增的传统PCR和以 2对引物扩增的巢式PCR的灵敏度和特异性。结果为本文所采用的引物均为人结核分支杆菌复合群特异 ;巢式PCR灵敏度高于传统PCR ,其中以rpoB基因为靶基因的巢式PCR灵敏度达一个结核分支杆菌。rpoB基因巢式PCR产物经DNA测序并可确认对利福平敏感与否。rpoB基因巢式PCR可作为结核病和利福平耐药的辅助诊断方法