cox-2 siRNA表达载体的构建及在HuH-7细胞中的表达

目的构建COX-2 siRNA特异性表达载体,观察其对HuH-7细胞中COX-2表达及产生PGE2的影响。方法基于人COX-2基因核苷酸序列,软件分析并选择两靶序列,设计合成发夹结构形成单位,然后将其克隆入pSIREN-Shuttle载体。重组质粒用于瞬时或稳定转染HuH-7细胞,RT-PCR、Western blot用于检测Cox-2的表达,并测定转染前后PEG2的浓度。结果合成的COX-2 siRNA表达载体瞬时转染HuH-7细胞后在mRNA及蛋白水平明显抑制COX-2的表达,稳定转染后则完全阻抑Cox-2的表达,并能抑制PEG2的生成。结论构建的Cox-2 siRNA表达载体具有高效的基因抑制效率,为研究COX-2基因功能及基因治疗提供良好的工具及手段。     

载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞中糖原合成酶激酶3β表达的研究

目的构建和筛选能高效、特异性抑制人GSK-3β基因表达的siRNA表达载体,探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法提取人L02细胞总RNA,RT-PCR扩增GSK-3β基因序列,克隆至pSEB-HUS真核表达载体,构建pSEB-G重组质粒。将设计、合成的3条靶向GSK-3β基因编码区的siRNA及阴性对照分别克隆至pSEB-G,构建siRNA表达载体pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-siN-G。将siRNA表达载体瞬时转染HepG2细胞,通过绿色荧光信号、RT-PCR和Western blot观察和检测其对GSK-3β基因的抑制效果,MTT实验和caspase-3活性分析检测其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。结果经双酶切及测序证实,所构建si RNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。瞬时转染HepG2细胞后,其中的pSEB-si1-G能使细胞中绿色荧光信号明显减少,可显著抑制GSK-3βmRNA的表达及蛋白的合成,并使HepG2细胞增殖明显降低,caspase-3活性显著升高。结论成功构建了靶向GSK-3β基因的siRNA表达载体,沉默GSK-3β能显著抑制HepG2细胞的生长并诱导其发生凋亡。     

hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长

 目的：设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II（IGF-II）基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建由重组人甲胎蛋白（hAFP）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）双启动子调控的该siRNA表达载体,观察其对肝癌细胞生长的影响。方法：根据siRNA设计原则,参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列,转染人肝癌Huh7细胞,转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化,筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列,应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞,观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果：实时荧光定量PCR显示,siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高,约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列,将其分别克隆入pGL3-Basic载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体;将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低,抑制效率达86%,细胞增殖受到明显抑制,G1期细胞比例显著增加;L-02细胞上述指标无明显改变。结论: 成功构建双重RNA聚合酶II启动子（hAFP及hTERT双启动子）调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体,即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3;该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。     

利用RNAi技术抑制结肠癌NRF2基因表达

目的构建RNA干扰真核表达载体pSUPER-NRF2,并在结肠癌细胞中进行表达,验证NRF2基因表达是否受到抑制。方法设计特异性针对NRF2基因的寡核苷酸序列及相应的对照序列,分别构建重组载体并转染人结肠癌Caco-2细胞。同时转染pEGFP-N1质粒,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测绿色荧光来监测转染效率,共转染pEGFP-N1 48 h后G418筛选稳定表达的细胞。利用RT-PCR和W estern b lot检测瞬时及稳定转染细胞NRF2基因的表达。结果成功构建RNA i真核表达载体。转染pEGFP-N1后48 h达转染效率高峰。瞬时及稳定转染pSUPER-NRF2-A2、B2重组质粒NRF2 mRNA的表达无差异;转染48 h后,pSUPER-NRF2-A1、B1可显著抑制NRF2 mRNA的表达;pSUPER-NRF2-B1稳定转染后,NRF2 mRNA的表达也显著降低。瞬时和稳定筛选后NRF2蛋白表达亦显著降低。结论成功构建了NRF2的RNA i表达载体,可有效抑制靶基因表达,共转染带有筛选标记的pEGFP-N1质粒,筛选可获得低表达NRF2的稳定克隆,为进一步研究NRF2在结肠癌发生、发展中的作用提供了重要的实验材料。     

FAK siRNA质粒表达载体的构建及其对肺巨细胞癌细胞FAK基因表达的抑制

目的 应用RNA干扰技术，构建针对FAK的siRNA表达载体，抑制肺巨细胞癌细胞BE-1中FAK的表达。方法 依据设计siRNA的原则, 针对人FAK的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSilencer™ 2.1-U6真核表达载体中构建重组体pSilencer-FAK, 进行测序鉴定。然后转染重组体至BE-1细胞中,经G418 筛选,以空质粒转染为对照，获得稳定转染克隆，运用Western 印迹检测FAK基因的表达。结果 测序证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pSilencer™ 2.1-U6载体中 , pSilencer-FAK转染细胞后,FAK基因在蛋白水平的表达量受到明显抑制。结论 成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染BE-1细胞，可有效抑制细胞中FAK的表达，为后续研究以及肺癌的基因治疗奠定了基础。     

Cyr61基因siRNA表达载体的构建及沉默作用研究

目的:构建Cyr61靶向siRNA重组表达载体,为探讨抑制Cyr61基因表达对机械通气所致肺损伤的研究奠定基础。方法:根据GenBank数据库提供的Cyr61基因核苷酸序列,选择设计3条能转录siRNA的DNA序列,命名Cyr61-1 siRNA,Cyr61-2 siRNA,Cyr61-3 siRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil1.1载体,转化扩增后进行序列测定。4种重组表达载体转染肺癌A549细胞,逆转录RT-PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测Cyr61的表达。结果:经酶切鉴定和测序结果证实Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为60.54%和52.97%。结论:Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功并能显著抑制Cyr61基因的表达。     

利用RNAi技术抑制结肠癌Nrf2基因表达的体外研究

目的 构建RNA干扰真核表达载体pSUPER-NRF2，并在结肠癌细胞中进行表达，验证NRF2 基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对NRF2基因的寡核苷酸序列及相应的对照序列，分别构建重组载体并转染人结肠癌Caco-2细胞。同时转染pEGFP-N1质粒，通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测绿色荧光来监测转染效率，共转染pEGFP-N1 48h后G418筛选稳定表达的细胞。利用RT-PCR和Western blot检测瞬时及稳定转染细胞NRF2基因的表达。结果 成功构建RNAi真核表达载体。转染pEGFP-N1后48h达转染效率高峰。瞬时及稳定转染pSUPER-NRF2-A2、B2重组质粒NRF2 mRNA的表达无差异；转染48h后，pSUPER-NRF2-A1、B1可显著抑制NRF2 mRNA的表达；pSUPER-NRF2-B1稳定转染后，NRF2 mRNA的表达也显著降低。瞬时和稳定筛选后NRF2蛋白表达亦显著降低。结论 成功构建了NRF2的RNAi表达载体，可有效抑制靶基因表达，共转染带有筛选标记的pEGFP-N1质粒，筛选可获得低表达NRF2的稳定克隆，为进一步研究NRF2在结肠癌发生、发展中的作用提供了重要的实验材料。     

siRNA表达载体稳定沉默肺癌A549细胞MEKK3基因的细胞株建立

目的 构建人MEKK3基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体并建立稳定沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株.方法 设计并合成针对人MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以BamH Ⅰ及Hind Ⅲ酶切位点分别克隆入pSilencer 4.1-CMV hygro载体,测序鉴定后以脂质体分别转染人A549细胞,Western印迹检测它们对MEKK3表达的抑制,并选择抑制效率最高的表达载体转染入A549细胞,潮霉素筛选后获得含该载体的抗性细胞克隆株,荧光实时定量PCR检测该细胞克隆株中MEKK3表达抑制.结果 测序鉴定表明4个MEKK3 siRNA表达载体正确无误;Western印迹结果显示对MEKK3的表达有抑制作用,其中pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2的抑制率达84%;荧光实时定量PCR结果表明,pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2可稳定沉默MEKK3 mRNA的表达,有效率达83%.结论 成功地构建了针对人MEKK3基因的siRNA表达载体,并成功地建立了能高效且稳定地沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株.     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

Runx1-shRNA重组质粒的构建与表达

本研究目的在于构建特异性下调人Runx1基因的shRNA表达质粒。设计并合成人Runx1基因的siRNA,通过DNA重组技术将目的序列插入到pSuper质粒,采用菌落PCR、限制性内切酶酶切技术及测序方法对其进行筛选与鉴定。转染该质粒于人肺腺癌细胞A549,通过实时荧光定量PCR技术和Western blot方法分别从基因及蛋白水平对其进行功能鉴定。实验结果表明我们所构建的pSuper-Runx1-shRNA质粒能够有效抑制A549细胞Runx1mRNA和蛋白的表达,抑制率分别为33%和50%。     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

HMGN2基因干扰质粒构建及干扰效率测定

目的：构建HMGN2基因的干扰质粒,为深入研究HMGN2基因在信号通路中的作用提供有效手段。方法：根据文献选择两个HMGN2基因的干扰位点,合成两个干扰片段定向克隆到psilencer-4．1的干扰载体并测序验证。将干扰质粒转染至A549细胞,并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果：RT—PCR产物检测结果显示干扰质粒psilencer-4．1-HMGN2—2干扰效率最高,其HMGN2表达量降低了70％左右。结论：成功构建了对HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4．1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。     

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。     

质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用

目的 应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用。方法 以pLL3．7质粒为模板，采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段，连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNARI和pMD-T-shRNAR2。同时采用RT-PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2，定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建HCMVAD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP-C1-IE2；用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中，荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用，并观察RNA干扰的时效和量效改变。结果 三组质粒重组体构建成功，克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用。在与靶基因质粒量比为1：1和1：2时，其中pMD-T-shRNAR1 48～72h间干涉效应为100％，可完全封闭IE2的表达；pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达，48～72h间干涉效应达到98．4％～99％。结论 通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMVIE2基因的表达，为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路。     

IL-12基因不同亚基真核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建含人白介素12(hIL-12)基因p35、p40不同亚基的真核表达载体,瞬时转染真核细胞并诱导IL-12的表达。方法:人单核细胞白血病细胞株(THP-1)和人白血病细胞株(HL-60),经DMSO、IFN-γ和LPS诱导后,用RT-PCR及SOEPCR扩增IL-12p40、p35及p40-p35融合基因;并构建pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达载体。以3种重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞后,通过RT-PCR及ELISA法检测目的基因的表达。结果:经诱导后,从HL-60细胞中扩增到IL-12p40和p35基因片段;但从THP-1细胞中只扩增到p35基因片段,未能扩增到p40基因片段;经酶切鉴定、PCR扩增及序列测定表明pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达质粒构建成功;并在COS-7细胞中可检测到IL-12的表达。结论:含hIL-12基因不同亚基的真核表达质粒的成功构建,对进一步研究IL-12在免疫应答中的调节作用以及作为免疫佐剂改善BCG免疫保护效果的研究奠定了基础。     

Bcl-2 siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的: 构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体，并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法： 根据GenBank 提供的bcl-2 cDNA序列，设计双链小干扰RNA（siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA 序列，并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接，构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞，采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响；用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果: 构建了bcl-2 siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555，并经限制性内切酶酶切和DNA 测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72 h后，RT-PCR显示bcl〖STBX〗-2〖STBZ〗基因表达下调接近80％；MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论: bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建，有效沉默 bcl-2在膀胱癌细胞中的表达，抑制了癌细胞的生长。     

HIV-1 DNA vaccine efficacy is enhanced by coadministration with plasmid encoding IFN-alpha

Numerous strategies have been employed in an attempt to improve the immunogenicity and efficacy of nucleic acid vaccines. In the present study, the immunogenicity in the induction of humoral and cellular immune responses to HIV-1 DNA vaccine expressing a chimeric gene of gag and gp120 and the adjuvant effect of IFN-alpha on HIV-1 DNA vaccine were studied in a murine model. The DNA vaccine plasmid pVAX1-gag-gp120 and eukaryotic expression plasmid pVAX1-IFN were constructed by inserting the chimeric gene of gag and gp120 of HIV-1 and IFN-alpha into the downstream of CMV promoter of eukaryotic expression vector pVAX1, respectively. In vitro expression detected by RT-PCR and Western blotting showed that the genes of interest could be expressed in transfected HeLa cells. After BALB/c mice were immunized by three intramuscular inoculations of the HIV-1 DNA vaccine plasmids alone or in combination with IFN-alpha expression plasmids, the different levels of anti-HIV-1 humoral and cellular responses were measured comparable to the control groups immunized with pVAX1-IFN, parent plasmid pVAX1 or PBS. The percentage of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ subgroups of spleen T lymphocytes and the specific cytotoxicity activities of splenic CTLs in the coinoculation group were significantly higher than those in the separate inoculation group, and an enhancement of antibody response was also observed in the coinoculation group compared with the separate inoculation group. Take together, coadministration of HIV-1 DNA vaccine plasmids and IFN-alpha expression plasmids can elicit stronger humoral and cellular immune responses in mice than HIV-1 DNA vaccine plasmids alone, and IFN-alpha can be an effective immunological adjuvant in DNA vaccination against HIV-1.     

shRNAs 介导的EM>Smad2/EM> 基因在小鼠成纤维细胞NIH/3T3中表达的沉默

目的 通过构建5个shRNA表达质粒,对转化生长因子β/Smads信号通路中受体调节性Smads蛋白中的Smad2的表达进行抑制.方法 针对鼠Smad2基因的mRNA序列,设计合成了5条shRNA-Smad2 DNA序列,分别插入至shRNA表达载体中,获得了5个shRNA-Smad2表达质粒,将shRNA表达质粒转染NIH/3T3细胞,采用半定量RT-PCR和Western blotting方法,检测shRNA表达质粒对Smad2表达的抑制效果.结果 编号为2.4的shRNA-Smad2表达质粒能够显著降低Smad2的表达,同时发现由不同的shRNA-Smad2表达质粒组成的RNAi池,产生的抑制效果比单个RNAi表达质粒的抑制效果明显提高.结论 成功地构建了特异、高效抑制Smad2表达的shRNA表达质粒.     

GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体的构建及XbaⅠ甲基化位点的应用

目的构建GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体并探讨XbaI甲基化位点在构建中的应用,为构建GM-CSF基因重组腺病毒及更方便地利用XbaⅠ多克隆位点打下基础。方法体外分离小鼠脾细胞,经ConA刺激,用含两种不同的XbaⅠ位点毗邻碱基的引物RT-PCR获取小鼠GM-CSF基因,经XbaⅠ及XbaⅠ双酶切后分别定向克隆入pAdTrack-CMV重组腺病毒穿梭载体中,比较两种重组载体酶切鉴定的效率并通过测序验证。结果成功逆转录得到小鼠GM-CSF基因并克隆入pAdTrack-CMV中,测序结果与预期一致。酶切鉴定显示由于XbaI位点毗邻碱基的不同导致甲基化的XbaⅠ位点在克隆菌株中不能被有效切开。结论成功构建GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体,XbaⅠ位点对甲基化敏感。