结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。     

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的　构建E coli BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H3 7Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 ( 19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E coli BCG穿梭载体 pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E coli BCG穿梭载体。用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达。结果　经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面。 结论　本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E coli BCG穿梭质粒     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。     

四种结核分枝杆菌特异性抗原的克隆表达与血清鉴定

目的　克隆结核分枝杆菌 14 0 0 0、370 0 0、ESAT 6与mtb81抗原基因 ,于原核表达系统进行表达并纯化 ,测定抗原性与特异性。方法　利用聚合酶链反应 (PCR)自结核分枝杆菌基因组DNA扩增 14 0 0 0、380 0 0、ESAT 6与mtb81抗原基因 ,经测序鉴定后克隆于pGEX 4T 1表达载体 ,转化于大肠杆菌BL2 1菌株进行诱导表达 ,利用亲和层析纯化表达产物 ,通过酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测其抗原性与特异性。结果　携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物 ,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性与特异性。其中 380 0 0、14 0 0 0、ESAT 6及mtb81抗原的阳性检出率分别为 5 4 %、6 0 %、4 4 %及 36 %。 4种抗原联用阳性检出率可达 86 %。结论　 14 0 0 0、380 0 0、ESAT 6与mtb81重组抗原具备良好的抗原性与特异性 ,有望应用于结核分枝杆菌的临床诊断     

分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗菌株的筛选

目的筛选获得分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组卡介苗(BCG)菌株。方法采用多聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv中扩增出热休克蛋白60(Hsp60)基因及其信号肽序列α-ss，将测序正确的hsp60和α-ss基因分别克隆人大肠杆菌(E.coli．)-BCG穿梭载体pOLYG中，构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22，按相应的酶切位点将ag85b和esat6按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体，分别命名为pDE22-Ag85B-ESAT6和pDE22-ESAT6-Ag85B，将纯化的重组质粒电穿入BCG，经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。收集重组BCG的培养上清液，经浓缩和透析后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和固相化蛋白质免疫学测定(Western-blot法)分析。结果两株重组：BCG菌株的培养上清液分泌表达相对分子质量约37000的蛋白，且分别可与抗Ag85B和抗ESAT6蛋白免疫小鼠的血清有相应的结合条带。结论分泌表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的重组BCG菌株构建成功，有望为结核病的预防提供有效的疫苗。     

结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B基因真核共表达载体的构建与表达

目的 Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要优势保护抗原,为提高编码Ag85A和Ag85B DNA疫苗的免疫原性和免疫效果,特构建真核共表达Ag85A和Ag85B抗原的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,并利用293T细胞对其表达进行检测.方法 PCR扩增Ag85A和Ag85B基因,逐步将Ag85A和Ag85B基因定向插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加A信号BGH poly(A)之间,并将Ag85A和Ag85B基因以内部核糖体进入位点(internal ribo some entry site,IRES)序列连接,酶切和测序验证后将重组质粒转染至293T细胞中进行真核表达,48 h后提取细胞总蛋白,表达产物经SDS-PAGE分离和Western blot分析.结果 限制性内切酶酶切及测序结果表明,重组质粒pcDNA-Ag85AIRES-Ag85B基因序列和阅读框架正确.将重组质粒转入293T细胞后,利用Ag85A和Ag85B特异性抗体Western blot检测证实两种抗原可在同一载体中各自独立表达.结论 成功构建了能够同时独立表达结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B抗原基因的真核表达载体pcDNA-Ag85A IRES-Ag85B,为下一步研究它们的免疫原性和免疫效果奠定了基础.     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。     

结核分枝杆菌复苏因子E的真核表达及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.方法 PCR扩增结核分枝杆菌复苏因子E基因片段.将片段克隆至PcDNA 3.1(一)载体,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中,表达复苏因子E蛋白质.RT-PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞中的表达,收集并纯化表达的蛋白质,SDS-PAGE分析和Western blot分析检测目的 蛋白的表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)鉴定表达蛋白的免疫原性.结果 成功构建了结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.RT-PCR证实克隆基因mRNA在真核细胞中表达,SDS-PAGE分析和Western blot分析均证实目的 蛋白在真核细胞中成功表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)进一步证实了表达蛋白具有免疫原性.结论 我们成功构建了复苏因子E真核表达系统.     

结核分枝杆菌Ag85B+Rv3407融合基因自杀性DNA疫苗的构建及鉴定

目的构建表达结核分枝杆菌生长期抗原Ag85B和休眠期蛋白Rv3407的自杀性DNA疫苗融合基因表达载体,并检测其在BHK-21细胞中的表达。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85B基因和Rv3407蛋白基因,再以二者的混合物为模板扩增Ag85B+Rv3407融合基因,构建真核表达载体pSCA1/Ag85B+Rv3407,以ELISA法检测其在BHK-21细胞中的瞬时表达。结果从结核分枝杆菌基因组中扩增得到Ag85B+Rv3407融合基因,片段大小为1 323bp,与预期相符。成功构建重组质粒pSCA1/Ag85B+Rv3407,该重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的蛋白(实验组P/N≥2.1)。结论成功构建结核分枝杆菌自杀性DNA疫苗融合基因表达载体,该重新载体能在真核细胞中表达目的蛋白。     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves

Recent developments in genetic engineering allow the employment of plants as factories for 1/foreign protein production. Thus, tuberculosis (TB) ESAT6 antigen was expressed in different plant systems, but the level of vaccine protein accumulation was extremely low. We describe the technology for superexpression of TB vaccine proteins (Ag85B, ESAT6, and ESAT6:Ag85B fusion) in plant leaves which involves: (i) construction of tobacco mosaic virus-based vectors with the coat protein genes substituted by those for TB antigens; (ii) Agrobacterium-mediated delivery to plant leaf tissues of binary vectors containing the cDNA copy of the vector virus genome; and (iii) replication of virus vectors in plant cells under conditions suppressing the virus-induced gene silencing. This technology enables efficient production of the TB vaccine proteins in plants; in particular, the level of Ag85B antigen accumulation was not less than 800 mg/kg of fresh leaves. Expression of TB antigens in plant cells as His(6)-tagged proteins promoted their isolation and purification by Ni-NTA affinity chromatography. Deletion of transmembrane domains from Ag85B caused a dramatic increase in its intracellular stability. We propose that the strategy of TB antigens superproduction in a plant might be used as a basis for the creation of prophylactic and therapeutic vaccine against TB.     

结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究

目的 构建Mtb ESAT6-RpfE（早期分泌抗原靶6-复活促进因子E）的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究。方法 分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白。采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6 RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺（dimethyl dioctyldecyl ammonium bromide,DDA）;第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG［DDA+poly(I:C)+明胶］。分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠。末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平;ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1。结果 PCR扩增的esat6、rpfE基因序列与GenBank报道一致;融合蛋白主要以包涵体形式表达;亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(427.13±100.46)］显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P＜0.001); 分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(506.50±140.40)］明显高于PBS组(19.25±14.75;q=11.36,P＜0.001)和 BCG组(125.5±46.41;q=8.882, P＜0.001)。ESAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体。结论 成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白。此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究。     

表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗的免疫学特性

目的测定表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组(每组10只),将表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF分别免疫小鼠3次,每次间隔2周,同时设卡介苗(BCG)免疫组、空载体质粒免疫组和生理盐水对照组。最后一次免疫结束后,每组取5只小鼠血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测特异性抗体的滴度,并分离小鼠的脾淋巴细胞,并在体外用结核分枝杆菌(MTB)培养滤液蛋白(cu lture filtrate prote in,CFP)刺激,测定脾淋巴细胞增殖指数和γ干扰素(IFN-γ)水平。用1 m l含1×105克隆形成单位(CFU)的MTB毒株H37Rv经尾静脉感染其余每组5只BALB/c小鼠,4周后计数脾脏细菌负荷数。结果质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫小鼠血清的特异性抗体滴度分别为1∶1 000和1∶1 500。其脾淋巴细胞刺激指数分别为2.2和2.4,而生理盐水对照组和空载体质粒免疫组的刺激指数只有0.9和1.1;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ分别为(5.48±0.38)ng/m l和(5.76±0.51)ng/m l,显著高于生理盐水对照组和空载体质粒免疫组(P<0.05),但与BCG免疫组的(5.55±0.31)ng/m l比较差异无统计学意义。结核毒株攻击后,与空载体质粒免疫组相比,质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫的BALB/c小鼠其抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,3组脾脏细菌负荷对数值(lg,CFU/g)分别为6.08±0.25、4.63±0.11、4.50±0.32,但不及BCG免疫组的4.09±0.27。结论表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗在小鼠体内诱导的IFN-γ水平与BCG相当,其保护力有待进一步提高。     

mpt64-卡介苗重组疫苗免疫原性研究

目的研究rapt64-卡介苗重组疫苗的免疫原性。方法以生理盐水、卡介苗、mpt64-卡介苗重组疫苗免疫小鼠，采用ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体，MTS法分析小鼠脾淋巴细胞增殖指数。结果mpt64-卡介苗重组疫苗组小鼠体重变化与对照组相比，无显著性差异。应用不同抗原检测各组小鼠不同时间采集的血清，rapt64-卡介苗重组疫苗组有MPT64特异性抗体产生，而卡介苗组无MPT64特异性抗体产生；卡介苗、mpt64-卡介苗重组疫苗免疫后15d，抗体水平已有升高，45d达到最高水平。用不同抗原刺激实验组及对照组小鼠脾淋巴细胞，平均刺激指数均达2．0以上。结论结核分枝杆菌mpt64基因在卡介苗中能够表达特异的蛋白，刺激小鼠产生特异性抗体。