抗人转录因子DP3和TFDP1多肽抗体的制备

目的: 制备兔抗人转录因子TFDP3、 TFDP1的多克隆抗体, 并鉴定其反应性及特异性.方法: 选择TFDP3和TFDP1差异较大肽段, 利用人工合成多肽免疫家兔, 采用真核表达载体瞬时转染HEK293细胞表达TFDP3和TFDP1真核蛋白, 通过Western blot分析抗体的反应性和特异性.结果: 通过氨基酸序列比对选择TFDP3 17-26, TFDP1 17-32氨基酸残基合成多肽, 制备了兔抗人TFDP3、 TFDP1多肽抗体, Western blot检测显示, 抗TFDP3抗体可以特异性识别TFDP3, 而抗TFDP1抗体既可识别TFDP1又可与TFDP3结合.结论: 制备了兔抗人TFD31和TFDP1的多肽抗体, 且TFDP3抗体与TFDP1无交叉反应.     

细胞色素P450 3A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P450 3A4（CYP3A4）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP3A4蛋白的序列,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列,合成CYP3A4多肽,与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联,免疫日本大耳白兔制备抗CYP3A4抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体,间接ELISA测定抗体的效价及相对亲和力常数,Western blot鉴定其特异性,免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP3A4的抗体。该抗体效价为1∶16000;相对亲和力常数在10^5～10^6M^-1,具有实用价值;可与CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出现特异性反应;可识别正常人肝脏组织CYP3A4;Western blot的结果显示,该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为46000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP3A4合成肽抗体可应用于ELISA、Western blot和免疫组化实验。     

兔抗人细胞色素P450 1A2多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P4501A2（CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列，根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP1A2多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP1A2抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体，间接ELISA法测定抗体的效价及相对亲和力常数，Western blot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000；相对亲和力常数在10^5-10^6/M，具有实用价值；可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP1A2；Western blot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为58000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP1A2合成肽抗体可应用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组化实验。     

抗CMTM4多克隆抗体的制备、纯化和鉴定

目的:制备抗CMTM4的多肽抗体并鉴定其性能.方法:通过TMHMM、DNAStar等软件对CMTM4的3种剪接体,CMTM4-v1,v2和v3的蛋白序列进行分析,选取了4段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联.其中第1、2、3条多肽为3种剪接体共有,混合后免疫家兔,制备Ab1;而第4条多肽为CMTM4-v1所特有,单独免疫家兔,制备Ab2.ELISA法检测抗体效价.免疫亲和层析法纯化后,进行Western blot和免疫组织化学检测,鉴定这2种抗体的特异性与适用范围.结果:得到兔抗人CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2,效价分别达1:105和1:106.纯化后的Ab1用于Western blot可特异识别超表达的CMTM4-v1和v2,并可用于免疫组织化学实验;而Ab2仅可用于Western blot,特异性识别超表达的CMTM4-v1.Ab1还可特异识别小鼠内源性Cmtm4.结论:用多肽免疫家兔制备的2种抗CMTM4抗体不仅具有较高的效价以及特异性,并且Ab1还可以特异识别小鼠Cmtm4,为CMTM4的功能研究提供了有力的支持.     

β_2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用

目的利用人工合成β2糖蛋白1(β2GP1)多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及致病性。方法应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35~51位氨基酸的多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体,利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性。体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子(TF)mRNA和蛋白表达;Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65表达情况;体内实验采用C3H/He N小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征(EAPS)模型,检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间(APTT)。结果化学合成β2GP1多肽的纯度为94%,达到免疫用抗原标准。偶联KLH后免疫新西兰大白兔,其抗血清效价大于1∶32 000。Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带,双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合。体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、NF-κB p65磷酸化,诱导细胞TF mRNA及蛋白表达。体内实验成功建立EAPS小鼠模型,小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200,APTT明显缩短。结论所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子,能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应。     

人Argonaute3蛋白：多克隆抗体制备、鉴定及组织芯片检测其在各种癌组织中的表达

目的:制备兔抗人Argonaute3(AGO3)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法:合成特异性AGO3多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备兔抗人AGO3多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和Western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO3的免疫组化研究.结果:通过构建AGO3多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人AGO3蛋白多克隆抗体,末次抗血清效价为l:20 000,经ELISA及Western blot证实兔抗人AGO3抗体可特异性识别AGO3多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在很多正常组织上皮细胞及肿瘤细胞胞浆中呈阳性染色.结论:本项研究成功制备兔抗人AGO3多克隆抗体,为进一步研究AGO3在微小RNA/RNA干扰通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位分析及抗体制备

目的：分析一个新的人突触相关蛋白(FRCA)抗原表位并制备其多克隆抗体。方法：从人胎肝文库PCR扩增获得FRCA基因全长cDNA序列；通过生物信息学分析，预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域，并进行了多序列比对；采用固相多肽合成法合成了FRCA抗原多肽，并免疫家兔；用免疫组化检测蛋白在人肝癌细胞HepG2细胞中的表达。结果：通过生物信息学分析选取抗原13肽PKLVKEEVFWRNY，制备兔抗人FRCA多克隆抗体。高效液相色谱检测显示抗体纯度达82．79％，抗体滴度为1：16000，Western blot证实该抗体具有较好的反应性和特异性，免疫组化证实其主要在HepG2细胞胞浆中表达。结论：成功制备了新的人突触相关蛋白(FRCA)多克隆抗体。     

兔抗人羧酸酯酶1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备兔抗人羧酸酯酶1(CES1)多克隆抗体(pAb), 并对抗体进行特性鉴定.方法: 以人正常肝cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CES1(即CES1-GST)和pET-32a-CES1(即CES1-His).CES1-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb, 辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 采用Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性.结果: CES1-GST和CES1-His融合蛋白均在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达.兔抗人CES1 pAb效价为1∶ 64 000.Western blot鉴定表明, 该抗体可识别重组人CES1蛋白, 也可特异地识别人肝微粒体中的CES1亚基.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性识别正常肝组织中的CES1蛋白.结论: 成功地制备了兔抗人CES1 pAb, 该抗体可应用于ELISA、 Western blot、免疫组化等实验, 为进一步研究CES1的功能提供了特异性检测工具.     

ENO1多克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗Enolase 1的兔多克隆抗体(pAb)并进行特异性鉴定。方法以人宫颈癌细胞系HeLa细胞cDNA为模板,构建重组表达质粒pET-32a-ENO1。His-ENO1融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,纯化后作为免疫原制备兔多克隆抗体。采用ELISA、Western blot和免疫组化法鉴定抗ENO1兔多克隆抗体针对重组蛋白和天然蛋白的特异性。结果 His-ENO1融合蛋白在相对分子质量约29 000处呈现明显表达条带。Western blot鉴定表明,制备的抗ENO1兔多克隆抗体可特异性地识别ENO1重组蛋白和不同肿瘤细胞系HeLa、MCF7、HepG2和K562中的ENO1蛋白。免疫组化结果表明该多抗可特异性识别肾组织中的ENO1蛋白。结论成功制备出兔抗人ENO1抗血清,为进一步研究ENO1的功能奠定了基础。     

兔抗人细胞色素P450 4A11合成肽抗体的制备与鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P450 4A11（CYP4A11）抗体，并对其特性进行初步鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP4A11蛋白的序列，根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择多肽序列、合成CYP4A11多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联，免疫大耳白兔制备抗CYP4A11抗体。辛酸一硫酸铵法纯化抗体，对纯化的抗体进行ELISA、Western blot、免疫组化等鉴定。结果：获得抗CYP4A11合成肽的抗体。该抗体效价为1：32000。可与CYP4A11合成肽及天然CYP4A11出现特异性反应，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为53000，可识别正常肝脏的CYP4A11。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP4A11合成肽抗体可应用于ELISA、Westernblot、免疫组化等实验。     

小鼠抗人细胞色素P450 1A2合成肽抗血清的制备与鉴定

目的：制备小鼠抗人细胞色素P450 1A2（CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列,根据4个指标（亲水性、柔韧性、抗原性及表面性）选择欲合成的多肽序列,设计、合成CYP1A2多肽。将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联,免疫BALB/c雌性小鼠制备抗CYP1A2抗体。用间接ELISA法测定抗体的效价,Western blot鉴定其特异性。结果：成功地获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000,可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应。Western blot的结果显示,该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为58000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体。制备的小鼠抗CYP1A2合成肽抗体的效价高及特异性良好。     

兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法 合成特异性PIWIL 4多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔, 制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行PIWIL4的免疫组化研究.结果 通过构建P IWIL4多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人PIWIL4蛋白多克隆抗体,经ELIS A 及Western blot证实兔抗人PIWIL4抗体可特异性识别PIWIL4多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在BU部分正常组织和肿瘤组织中呈阳性染色.结论 本项研究成功制备兔抗人PIWIL4多克隆抗体,为进一步研究PIWIL4在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。     

釉成熟蛋白多肽多克隆抗体的制备和应用

目的制备兔抗鼠釉成熟蛋白(amelotin)的多克隆抗体并进行鉴定和应用。方法对amelotin的蛋白质序列进行分析,选取一段氨基酸序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联免疫新西兰大白兔,制备多肽抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法分析抗体特异性。免疫组织化学技术观察amelotin在小鼠下颌组织的表达情况。结果制备的兔抗amelotin抗体效价为1∶1 000 000,特异性高。免疫组织化学染色结果显示amelotin在3、7 d小鼠的磨牙釉质全层有强表达,并且在7 d小鼠下颌下腺的导管上皮细胞质中也有表达。结论成功制备了效价高、特异性好的兔抗amelotin抗体。     

PIWIL系列蛋白多克隆抗体制备、鉴定及组织分布

目的 制备PIWIL蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性,初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布。方法 合成特异性PIWIL多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白（KLH）作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL多克隆抗体,用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和Western blot方法进行抗体验证,应用人组织芯片进行PIWIL免疫组化研究。结果 通过构建系列PIWIL多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,成功制备4个兔抗人PIWIL蛋白多克隆抗体,证实兔抗人PIWIL抗体可特异性识别PIWIL多肽,该抗体在大多数正常及肿瘤组织上皮来源细胞胞质中呈阳性染色。结论 成功制备系列兔抗人PIWIL多克隆抗体,为进一步研究PIWIL在miRNA/RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具。     

兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)多克隆抗体制备与应用

目的 制备兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)的多克隆抗体。方法 采用PCR点突变LDHC基因,并将该基因构建到pET-28a载体上,形成pET-28a-LDHC重组表达载体、将重组载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),诱导表达获得重组人LDHC4蛋白,将重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价,采用Western blot法检测抗血清的特异性,采用免疫组织化学法检测人三阴性乳腺癌组织中LDHC4的表达。结果 获得了特异性的兔抗人LDHC4多克隆抗体,抗体效价达1∶51 200,该抗体可用于Western blot法和免疫组织化学法。结论 成功制备了特异性兔抗人LDHC4多克隆抗体。     

抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备小鼠抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b的多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:合成H1b特异性多肽,以匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏小鼠,制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价,通过Western blot和免疫组织化学检测,鉴定抗体的特异性与适用范围.结果:得到小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,效价达1:105.纯化后的抗体用于Western blot可高特异性识别真核表达的H1b蛋白,并可用于免疫组织化学实验.结论:成功制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,该抗体具有较高的效价以及特异性,能区分ASG-PR大亚基的两种剪接异构体,从而为进一步研究H1b蛋白的生理功能及其在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

TFDP3对前列腺癌LNCaP细胞自噬及凋亡调控作用的初步研究

目的:研究TFDP3对前列腺癌LNCaP细胞自噬及凋亡作用的影响,以及探讨TFDP3与E2F1相互作用后对前列腺癌LNCaP细胞自噬及凋亡的调控作用。方法:采用重组质粒pcDNA3.1-TFDP3,pCMV-E2F1-HA分别转染LNCaP细胞,并设空载体对照组。转染24 h后提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR检测TFDP3、E2F1、以及LC3B基因表达的变化,Western blot方法检测自噬相关基因(LC3B)蛋白表达水平的变化。并采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果:TFDP3可以诱导LNCaP细胞中自噬基因LC3B的表达,并且这种作用可以受到E2F1的抑制;TFDP3可以抑制E2F1诱导的细胞凋亡。结论:TFDP3可以诱导LNCaP细胞中自噬基因LC3B的表达,可以抑制E2F1诱导的细胞凋亡,提示TFDP3在前列腺癌细胞中发挥着重要的调控作用。     

兔抗人重组生长激素rhGH多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备抗人生长激素(growth hormone,GH)的多克隆抗体并鉴定其性能。方法真核细胞表达质粒pcDNA3.0-GHcDNA免疫家兔,制备rhGH多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价。亲和层析法纯化后,进行Western blot、免疫组织化学和激光共聚焦显微镜检测,鉴定抗体的特异性与适用范围。结果得到兔抗人重组人生长激素rhGH多克隆抗体,效价达1:40000。纯化后的抗体可特异识别超表达的hGH和人内源性GH,可用于免疫组织化学实验、Western blot及激光共聚焦。结论用质粒免疫家兔制备的抗GH抗体具有较高的效价以及特异性,为hGH的功能性研究提供了有力的支持。     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。