利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定

目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记的新型pUC18筛选载体。方法将EGFP基因克隆至pUC18载体的PstI/HindⅢ位点,构建筛选载体pUC18-EGFP,并验证pUC18-EGFP能否利用EG-FP的荧光特性筛选出含基因重组体的阳性克隆。结果经酶切和基因测序鉴定pUC18-EGFP载体构建正确;在外源基因插入该载体后,对LB氨苄平板上的绿色菌落进行酶切和基因测序鉴定,结果证明LB平板上的绿色菌落即为含有重组质粒的克隆。结论成功构建pUC18-EGFP筛选载体,利用EGFP的绿色荧光可筛选出阳性克隆。     

MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肺腺癌A549细胞凋亡的影响

目的构建一种由腺病毒AdMax包装系统表达目的基因——黑色素瘤分化相关基因-7（MDA-7）的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法通过基因操作技术将目的基因（MDA-7）插入到5型腺病毒AdMax包装系统的E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP;同时构建对照病毒Ad.EGFP。病毒滴度计算按寇化法（Karber法）进行腺病毒感染性滴度（TCID50）测定。应用免疫组化染色法检测MDA-7在感染2种病毒的肺腺癌A549细胞中的表达状态;通过二苯甲亚胺-碘化丙啶（Hoechst33342-PI）双染色法及流式细胞仪检测2种病毒对肿瘤细胞杀伤的差异。结果成功构建携带目的基因的腺病毒载体,经聚合酶链反应（PCR）鉴定正确;MDA-7在感染Ad.hMDA-7-EGFP的肺腺癌A549细胞中表达,以相同感染复数（MOI）值感染Ad.EGFP时肺腺癌A549细胞中未检测到MDA-7表达;Ad.hMDA-7-EGFP对肿瘤细胞株杀伤能力明显高于Ad.EGFP。结论成功构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达,诱导肺腺癌A549细胞株发生凋亡。     

人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建含有人白介素24(hIL-24)基因的重组腺病毒载体,为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组,通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A细胞以包装并扩增病毒。采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达,病毒滴度达107pfu/ml。结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。     

VEGF-C siR NA抑制人结肠腺癌细胞株VEGF-C表达

目的 构建Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP腺病毒载体,观察腺病毒介导的VEGF-CsiRNA对人结肠腺癌LOVO细胞血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的影响.方法 设计并合成VEGF-C mRNA siRNA,构建穿梭质粒pDC316-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,与骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP-U6.转染人结肠腺癌LOVO细胞.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法分别从mRNA和蛋白质水平检测其对VEGF-C表达的抑制效果.结果 成功构建重组腺病毒Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,纯化后获得7.9×10<'9>IU/ml滴度的病毒.转染LOVO细胞48 h后,VEGF-C mRNA表达下降为对照组的(30.7±1.2)%(P<0.05);VEGF-C蛋白的表达也明显受到抑制,转染72 h后下降为对照组的(47.8±2.2)%(P<0.05).结论 腺病毒介导的VEGF-C RNA干扰可显著抑制人结肠腺癌细胞的VEGF-C表达.     

hIL-23(p19)/mFc真核蛋白表达及生物学功能的初步研究

目的在真核细胞中表达hIL-23(p19)/mFc融合蛋白并初步研究IL-23生物学特性。方法应用RT-PCR法克隆获得hIL-23(p19)/mFc基因片段。将测序正确的hIL-23(p19)/mFc序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/hIL-23(p19)/mFc真核表达载体。转染人肾上皮293T细胞后,筛选阳性表达细胞株。RT-PCR和Western blot法鉴定hIL-23(p19)/mFc基因和蛋白表达。结果成功构建了pCEP4/hIL-23(p19)/mFc重组表达载体,并在293T细胞中稳定表达。获得的hIL-23(p19)/mFc重组蛋白能促进人T细胞hIL-17和hIL-10的表达。体外刺激巨噬细胞,能显著增加TNF-α等炎症因子的基因表达。结论成功建立稳定表达hIL-23(p19)/mFc重组蛋白的293T细胞系,可用于进一步研究hIL-23的生物学功能。     

携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建

目的 探讨构建携带hIG-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性.方法 从pcDNA 3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ.鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ).再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度.将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的 条带,Western blot得到7.6kDa大小的同的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达.结论 成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体.     

大鼠糖皮质激素受体基因腺病毒载体的构建及在肾系膜细胞中的表达

目的 利用AdEasy系统构建大鼠糖皮质激素受体(GR)基因重组腺病毒载体,转染大鼠肾小球系膜细胞(GMC),并通过Western Blot法检测GR蛋白的表达.方法 将质粒pcDNA1 Neo-Rat GR扩增、凝胶回收获得的Rat GR cDNA双酶切片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pShuttle-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pShuttle-CMV-Rat GR,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内经同源重组得到腺病毒重组质粒pAd-Rat GR,经人胚肾293A细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-Rat GR;用包装后的病毒上清转染大鼠GMC,提取细胞中总蛋白,通过Western Blot方法 检测GR蛋白的表达.结果 连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-Rat GR重组质粒,经人胚肾293细胞包装,48 h后观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得1×109 PFU /ml 滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-Rat GR,转染大鼠GMC 48 h后提取细胞总蛋白,Western Blot检测GR蛋白有明显表达.结论 构建的大鼠GR基因腺病毒载体能够在大鼠GMC 中表达GR蛋白,并有上调作用.     

靶向大鼠血管紧张素转换酶基因的短发夹RNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠血管紧张素转换酶-短发夹RNA(ACE-shRNA)腺病毒载体并在人胚胎肾-293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pGenesil-1-ACE-shRNA真核表达载体中用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出ACE-shRNA片段,并克隆进入穿梭质粒pDC316中,将构建好的穿梭质粒pDC316-ACE-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox-E1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶,聚合酶链反应(PCR)检测和绿色荧光蛋白(FGFP)表达证实成功地构建了携带ACE-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带ACE-shRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步利用基因沉默技术抗高血压的研究奠定了基础。     

携带人肝细胞生长因子基因重组腺病毒的构建与制备

构建一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(AdHGF),并对其进行扩增、纯化与质量检测。首先构建携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒pXCJL1CMV/pAHGF,然后用LipofectAMIN介导该质粒和含有E1、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒GT4050共转染293细胞,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺病毒(AdHGF)。并以噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒,PCR法鉴定阳性重组腺病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,快速CPE分析、噬斑分析法测定病毒感染滴度(pfu/ml)。采用敏感细胞病变法检测有复制能力的腺病毒。结果成功构建了重组腺病毒AdHGF,制备的病毒纯度好、滴度高,其效价比小于1∶100,并且未检测到有复制能力的腺病毒存在。研究构建制备的重组腺病毒AdHGF具有潜在的实际应用价值。     

顺铂联合人类白细胞介素-24基因对于宫颈癌Siha细胞增殖和侵袭力的影响

目的研究人类白细胞介素(hIL)-24基因联合顺铂对人宫颈癌Siha细胞的生长抑制作用以及hIL-24基因对Siha宫颈癌细胞侵袭、迁移能力的影响。方法构建重组质粒pDC316-hIL-24,使用脂质体携带pDC316-hIL-24质粒转染Siha细胞;聚合酶链反应(PCR)法检测hIL-24基因在宫颈癌细胞中的表达情况。Siha细胞在转染hIL-24基因后,添加不同剂量的顺铂,用CCK-8试剂检测hIL-24基因联合顺铂对Siha细胞增殖抑制效果;Transwell实验检测hIL-24基因对Siha细胞迁移侵袭能力的影响。结果重组质粒pDC316-hIL-24成功转染Siha宫颈癌细胞;hIL-24联合顺铂对Siha细胞的增殖抑制作用大于单独使用顺铂或hIL-24基因组(P<0.05);Transwell实验中,hIL-24干预组肿瘤细胞的穿膜细胞数最少(P<0.05)。结论 hIL-24基因的表达可增加Siha宫颈癌细胞对顺铂的敏感性;hIL-24基因可以明显抑制Siha宫颈癌细胞的迁移侵袭能力。