LY294002对多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制作用及机制研究

目的:探讨2-(4-吗啉基)-8-苯基-4氢-1-苯并吡喃-4酮(LY294002)对多发性骨髓瘤细胞株U266的增殖抑制作用及其机制。方法:用不同浓度(0、5、10和20μmol/L)LY294002处理U266细胞24、48和72 h后,MTT法检测细胞活力,吖啶橙染色法检测细胞形态,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测细胞中B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(BAX),细胞周期蛋白D1(Cyclin D1),Cyclin E表达及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的激活状况。结果:0、5、10和20μmol/L的LY294002处理U266细胞24、48和72 h后,能显著提高细胞增殖抑制率,并具有时间及剂量依赖性(r=0.408,r=0.485)。5,10,20μmol/L的LY294002处理细胞48 h,能使细胞核呈现致密浓染,细胞周期明显阻滞在G1期(P0.01),显著下调BCL-2,Cyclin D1,Cyclin E,PI3K及p-AKT表达(P0.01),明显上调BAX表达(P0.01)。结论:LY294002能显著抑制多发性骨髓瘤细胞U266增殖,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的激活有关。     

LncRNA-HOTAIRM1下调对Jurkat细胞增殖、凋亡及KIT/AKT通路的影响

目的:观察长链非编码-HOX反义基因间RNA髓样1(LncRNA-HOTAIRM1)下调对人白血病T淋巴细胞Jurkat增殖及凋亡的影响,并初步探讨其作用机理。方法:体外培养Jurkat细胞,随机分为对照组、HOTAIRM1siRNA-NC组、HOTAIRM1 siRNA组;利用实时荧光定量PCR法检测转染后各组Jurkat细胞LncRNA-HOTAIRM1mRNA、KIT受体酪氨酸激酶(KIT) mRNA、丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT) mRNA的表达情况;采用CCK-8法检测各组Jurkat细胞的增殖情况;利用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组Jurkat细胞的凋亡情况;采用蛋白印迹分析法检测KIT、AKT、p-KIT、p-AKT、B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)及半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)蛋白表达的情况。结果:与对照组和HOTAIRM1 siRNA-NC组相比,HOTAIRM1 siRNA组Jurkat细胞LncRNA-HOTAIRM1 mRNA表达水平、细胞存活率、KIT mRNA、AKT mRNA、p-KIT、p-AKT及BCL-2蛋白表达水平均显著降低(P0.05),Cleared Caspase-3蛋白表达水平、Jurkat细胞凋亡率显著升高(P0.05)。结论:LncRNA-HOTAIRM1可能通过KIT/AKT信号通路,抑制Jurkat细胞增殖并诱导其凋亡。     

LY294002增强K562细胞对柔红霉素敏感性的研究

目的:探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002联合蒽环类化疗药物柔红霉素(DNR)对慢性髓系白血病细胞株K562细胞增殖的抑制作用、促凋亡作用及其相关机制。方法:应用MTT法检测LY294002和DNR在不用浓度、不同作用时间点对K562细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞周期的变化,应用RT-PCR和Western blot法检测LY294002和DNR对K562细胞SKP2、P27、BCL-2和BAX2基因和蛋白表达的影响。结果:LY294002联合DNR能够抑制K562细胞的生长并促进细胞凋亡,且具有浓度及时间依赖性(P0.05);2药联合后细胞增殖抑制率及细胞凋亡率明显增加(P0.05)。2药联合作用于K562细胞36 h,随着浓度的增加其G2/M期细胞显著减少(P0.05),与DNR单药比较,G0/G1期细胞数增加(P0.05),S期细胞减少,但差异无统计学意义。2药联合作用后,SKP2及BCL-2的mRNA表达量降低,P27 mRNA表达增高,差异具有统计学意义。BAX的表达在各实验组中的差异无统计学意义。相应的蛋白表达水平与之相符。结论:LY294002对DNR的化疗作用有增敏效果,其作用机制可能与阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡有关。     

槲皮素对胃癌细胞SGC-7901上皮间质转化的抑制作用

目的探讨槲皮素对人胃癌细胞SGC-7901上皮间质转化的影响及机制。方法胃癌细胞SGC-7901分为对照组(普通培养液)、LY294002组(培养液+LY294002)、槲皮素组(培养液+槲皮素);采用MTT法检测槲皮素对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响,依据细胞生长抑制率计算槲皮素对胃癌细胞SGC-7901的半数抑制浓度(median inhibitory concentration,IC_(50))值,参照IC_(50)值进行后续实验;采用划痕试验检测3组胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移能力;采用Western blot法检测胃癌细胞AKT、p-AKT、Snail、Vimentin及E-钙黏附素(E-cadherin)蛋白表达情况;采用荧光定量PCR法检测3组胃癌细胞上皮间质转化相关因子Snail、Vimentin及E-cadherinmRNA的表达情况。结果槲皮素对胃癌细胞SGC-7901有明显的增殖抑制作用,其IC_(50)为(112.9±2.05)μmol/L;LY294002组胃癌细胞迁移距离[(0.16±0.03)mm]、槲皮素组胃癌细胞迁移距离[(0.15±0.02)mm]均低于对照组[(0.44±0.04)mm](P0.05),LY294002组与槲皮素组比较差异无统计学意义(P0.05);Snail、Vimentin、p-AKT蛋白表达水平在LY294002组(0.760±0.003,0.750±0.006,0.71±0.03)、槲皮素组(0.750±0.006,0.690±0.004,0.68±0.02)均明显低于对照组(1,1,1),E-cadherin表达在LY294002组(2.89±0.19)与槲皮素组(3.66±0.18)均高于对照组(1)(P0.05);LY294002组、槲皮素组、对照组AKT蛋白表达水平(1.03±0.02,1.02±0.01,1)比较差异无统计学意义(P0.05);Snail、Vimentin mRNA表达水平在LY294002组(0.72±0.02,0.78±0.03)、槲皮素组(0.71±0.01,0.79±0.03)均明显低于对照组(1,1),E-cadherin mRNA表达水平在LY294002组(2.51±0.08)、槲皮素组(2.77±0.16)均高于对照组(1)(P0.05);LY294002组Snail、Vimentin、E-cadherin mRNA及Snail、Vimentin、E-cadherin、p-AKT蛋白表达水平与槲皮素组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论槲皮素对人胃癌细胞SGC-7901上皮间质转化有抑制作用,其作用机制可能是抑制AKT信号通路。     

体外神经干细胞培养过程中蛋白激酶磷脂酰肌醇-3激酶／AKT信号途径的作用

目的：探讨磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，P13K)／AKT信号途径在体外培养神经干细胞存活、分化中的作用。方法：实验于2001-11／2004-04在重庆医科大学神经病学研究所完成。分为对照组、P13K特异性抑制剂wortmannin组和LY294002组；采用间接免疫荧光法检测nestin，NF-200和GFAP的表达；TUNEL评价细胞凋亡率；Western Blot法检测磷酸化的AKT，caspase-9和bad的表达。结果：随着wortmannin和LY294002浓度增大，神经干细胞的形态变化逐渐明显，而且细胞凋亡率也逐渐增加。低浓度时(wortmannin浓度为5nmol／L，LY294002浓度为2μmol／L)，神经干细胞凋亡率与对照组无显著性意义(P&;gt;0．05)；高浓度时(wonmannin浓度为50，100nmol／L，LY294002浓度为50，100μmol／L)，神经干细胞凋亡率与对照组、低浓度组有非常显著性意义(P&;lt;0．01)。Western Blot结果提示，随着PI3K特异性抑制剂浓度增大，磷酸化AKT的表达逐渐减弱。当高浓度woftmannin(20nmol／L)和LY294002(10μmol／L)抑制了AKT磷酸化后，磷酸化的caspase-9，Bad表达减弱。此外，将wortmannin组和LY294002组存活的细胞接种后，分化后细胞的NF-200，GFAP表达无显著性意义。结论：神经干细胞存活依赖于PI3K／AKT途径的活化，其机制可能是PI3K／AKT活化后，促进了Bad和caspase-9等蛋白的磷酸化，抑制了细胞凋亡事件的发生。但是PI3K／AKT途径可能在神经干细胞的分化中的作用甚微。     

体外神经干细胞培养过程中蛋白激酶磷脂酰肌醇-3激酶/AKT信号途径的作用

目的:探讨磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3kinase,PI3K)/AKT信号途径在体外培养神经干细胞存活、分化中的作用。方法:实验于2001-11/2004-04在重庆医科大学神经病学研究所完成。分为对照组、PI3K特异性抑制剂wortmannin组和LY294002组;采用间接免疫荧光法检测nestin,NF-200和GFAP的表达;TUNEL评价细胞凋亡率;WesternBlot法检测磷酸化的AKT,caspase-9和bad的表达。结果:随着wortmannin和LY294002浓度增大,神经干细胞的形态变化逐渐明显,而且细胞凋亡率也逐渐增加。低浓度时(wortmannin浓度为5nmol/L,LY294002浓度为2μmol/L),神经干细胞凋亡率与对照组无显著性意义(P>0.05);高浓度时(wortmannin浓度为50,100nmol/L,LY294002浓度为50,100μmol/L),神经干细胞凋亡率与对照组、低浓度组有非常显著性意义(P<0.01)。WesternBlot结果提示,随着PI3K特异性抑制剂浓度增大,磷酸化AKT的表达逐渐减弱。当高浓度wort-mannin(20nmol/L)和LY294002(10μmol/L)抑制了AKT磷酸化后,磷酸化的caspase-9,Bad表达减弱。此外,将wortmannin组和LY294002组存活的细胞接种后,分化后细胞的NF-200,GFAP表达无显著性意义。结论:神经干细胞存活依赖于PI3K/AKT途径的活化,其机制可能是PI3K/AKT活化后,促进了Bad和caspase-9等蛋     

shRNA干扰AKT基因对Jeko-1细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默AKT基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响。方法:设计针对AKT基因短发夹RNA,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建AKT shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞,应用RQ-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白信号及通路相关蛋白p-AKT、Notch1、HES1的变化。结果:AKT shRNA转染Jeko-1细胞后,AKT的mRNA和蛋白表达均明显下降,有统计学意义(P0.05);转染组细胞增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白对照组(P0.05),AKT shRNA传染48 h后,凋亡率为(37.72±4.39)%,而NegshRNA组和空白对照组分别为(2.62±1.53)%、(1.57±0.42)%,差异有统计学意义(P0.01);凋亡相关蛋白BCL-2表达下降,而BAX、caspase-3、caspase-9表达上升;PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT磷酸化水平下降、Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下调。结论:干扰沉默AKT基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是特异性抑制PI3K/AKT信号通路也能下调Notch1信号通路的活性。     

苯丁酸氮芥抗套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1作用机制的研究

目的:探讨苯丁酸氮芥抗套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1作用机制。方法:应用MTT法检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞增殖的影响,Hoechst染色及Annexin V-FITC双染检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞凋亡的影响,Western blot检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞凋亡相关蛋白BAX,BCL-2,procaspase 3,procaspase 8,procaspase 9表达水平及PI3K/AKT信号通路的激活情况。结果:苯丁酸氮芥0、5、10和20μmol/L作用Jeko-1细胞24、48、72 h后,细胞增殖受到抑制,并呈时间及剂量依赖性(r=0.873,r=0.932)。0,5,10,20μmol/L苯丁酸氮芥作用Jeko-1细胞72 h后,细胞凋亡率显著提高,BAX,procaspase 3,procaspase 8及procaspase 9蛋白表达水平显著上调,BCL-2表达水平显著下调,PI3K蛋白及AKT磷酸化水平显著降低。结论:苯丁酸氮芥能显著诱导套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1凋亡,其作用机制与调节PI3K/AKT信号通路有关。     

信号通路抑制剂XL765对人白血病KG-1细胞株的抑制效应研究

目的:探讨PI3K/mTOR信号通路抑制剂XL765(SAR245409, Voxtalisib)对人急性髓系白血病细胞株KG-1细胞的抑制效应及可能的作用机制。方法:应用CCK-8法检测XL765对KG-1细胞增殖的影响;平板集落形成实验检测XL765对KG-1细胞集落形成的抑制情况;Annexin V/PI双染色流式细胞术检测XL765对细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的表达;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达水平及信号通路分子磷酸化水平的变化。结果:XL765能有效抑制KG-1细胞的增殖,抑制率呈剂量依赖性增加;与DMSO处理组相比,加入XL765后,KG-1细胞的集落形成能力显著下降(P=0.0002);XL765能有效诱导细胞凋亡(P0.001);XL765作用KG-1细胞48 h后,细胞的凋亡相关基因BCL-2表达下调,BAX及Caspase3表达上调,其差异均有统计学意义(P0.05);与DMSO组对比,实验组BAX及Caspase3活化蛋白表达上调,同时BCL-2蛋白表达下调,信号蛋白PI3K、AKT及S6K磷酸化表达下调,其差异均有统计学意义(P值均0.005)。结论:XL765能有效抑制KG-1细胞增殖及集落形成,并诱导细胞凋亡,其机制可能与调节凋亡蛋白BCL2、BAX及Caspase3水平及抑制PI3K、AKT及S6K磷酸化水平相关。     

白藜芦醇逆转急性髓系白血病细胞HL-60/ADR耐药的凋亡机制

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)逆转急性髄系白血病细胞HL-60/ADR耐药的凋亡机制。方法:将HL-60/ADR细胞分为对照组(Control)、阿霉素(ADR)处理组、Res处理组和ADR+Res联合处理组4组。应用CCK-8法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADR)自发荧光强度和细胞凋亡率;RT-PCR法检测耐药基因MRP1、抗凋亡基因BCL-2和促凋亡基因BAX mRNA表达水平,Western blot法测定MRP1、BCL-2和BAX蛋白表达水平。结果:25、50、100和200μmol/L Res作用于HL-60/ADR细胞48 h后,细胞的最大抑制率分别为44%、61%、76%和81%,呈浓度依赖性(r=0.876,P0.05);与ADR组的半数抑制浓度(IC50)(8.534±1.111μmol/L)相比,ADR+Res组HL-60/ADR细胞的IC50(1.591±0.373μmol/L)明显减少(P0.05)。ADR联合Res后HL-60/ADR耐药细胞内ADR自发荧光强度明显增加(P0.05);Res组和ADR+Res组细胞凋亡率均显著增加(P0.05)。Res组和ADR+Res组的MRP1 mRNA、BCL-2 mRNA表达水平显著下降(P0.05),BAX mRNA表达水平明显上升(P0.05)。Res组和ADR+Res组M RP1、BCL-2蛋白表达水平显著下降(P0.05),BAX蛋白明显上升(P0.05)。结论:白藜芦醇具有逆转HL-60/ADR细胞耐药的作用,可能是通过促进HL-60/ADR细胞凋亡、抑制耐药蛋白M RP1而发挥作用,其促凋亡机制与抑制BCL-2和增强BAX表达有关。     

miRNA-145对白血病HuT 78细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨miRNA-145对白血病细胞凋亡的影响及其机制。方法:利用Lipofectamine 2000脂质体将miRNA-145模拟物(mimic)及阴性对照转染至白血病细胞后,采用MTT实验检测miR-145对细胞增殖能力的影响,采用流式细胞术检测miR-145对白血病细胞的细胞周期及凋亡影响,采用Western blot实验检测BCL-2、CDK6、Cyclin D1、BAX、PI3K、p-PI3K、 p-AKT及AKT表达水平。结果:miR-145模拟物转染HuT 78细胞后,miR-145模拟物相对水平为2.3±0.2,显著高于空白对照组及miR-NC组(P0.05)。miR-145模拟物转染至HuT78细胞后,HuT 78细胞增殖水平明显低于空白对照及miR-NC组(P0.05)。转染miRNA-145模拟物后可促使HuT 78细胞的G0/G1期细胞数量增多,S期及G2/M期细胞数量显著减少(P0.05)。AnnexinV/PI双染流式细胞术实验发现,转染miRNA-145模拟物后HuT 78细胞凋亡率为17.6%±3.4%,显著高于对照组及miRNA-NC组(P0.05)。miR-145模拟物可显著降低HuT 78细胞内BCL-2、CDK6、Cyclin D1的表达水平(P0.05);miR-145模拟物可使HuT 78细胞内BAX表达水平增高(P0.05)。HuT 78细胞转染miR-145模拟物后,HuT78细胞的PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT的表达显著低于空白对照及miR-NC组(P0.05)。结论:上调miR-145可抑制白血病细胞的增殖能力,并促进细胞发生凋亡,其机制可能与PI3K/AKT信号通路受到抑制有关。     

ELA经PI3K/AKT和MARK通路促进MSCs增殖和迁移

目的:观察ELABELA(ELA)对骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和迁移能力的影响,并探讨可能调控机制。方法:将体外培养的MSCs分为Control组、ELA处理组(50 n M、500 n M、5μM、10μM)。MTS法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移。Western Blot法检测Control组、5μM ELA、5μM ELA+LY294002(PI3K/AKT通路抑制剂)组、5μM ELA+U0126(MARK通路抑制剂)组中AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Cyclin D1的表达情况。结果:与Control组相比,ELA处理组(50 n M、500 n M、5μM)MSCs的增殖及迁移能力显著增加(P0.01),其中以5μM ELA处理MSCs增殖及迁移能力最佳;与Control组相比,5μMELA组p-AKT/AKT、p-ERK/ERK、Cyclin D1的蛋白水平显著增加(均为P0.01),然而此效应可被LY294002及U0126阻断。结论:5μM ELA处理MSCs增值及迁移能力最佳,此效应可能与激活PI3K/AKT通路及MARK通路相关。     

米托蒽醌对人骨髓瘤细胞RPMI8226增殖与凋亡的影响

本研究探讨米托蒽醌对人骨髓瘤细胞RPMI8226的增殖抑制作用及其分子机制。将米托蒽醌作用于骨髓瘤细胞,用MTT法检测细胞增殖抑制率,光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及超微结构变化,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布,半定量RT-PCR检测BCL-2、BAX及caspase-3 mRNA表达量的变化,Western blot检测BCL-2、BAX和caspase-3 mRNA蛋白表达量变化。结果表明,米托蒽醌可抑制RPMI8226细胞增殖,抑制率呈时间（r=0.924）和浓度（r=0.947）依赖性增强。米托蒽醌作用24 h后在光学显微镜下可见米托蒽醌组细胞数量减少,排列紊乱,细胞形态变得不规则,可见凋亡细胞;在48 h后电子显微镜下可见细胞典型凋亡改变,凋亡小体形成。流式细胞术检测结果显示,在米托蒽醌组RPMI8226细胞凋亡率明显增高（P〈0.05）;米托蒽醌作用48 h后,在低浓度1.0μg/ml组RPMI8226细胞阻滞于G2/M期（P〈0.05）,在高浓度2.0μg/ml组RPM I8226细胞阻滞于S期（P〈0.05）;米托蒽醌作用48 h,BCL-2 mRNA与BCL-2蛋白表达量减少（P〈0.05）,BAX、caspase-3mRNA及蛋白表达量增加（P〈0.05）。结论：米托蒽醌可诱导RPM I8226细胞凋亡,此细胞凋亡可能与细胞周期阻滞,激活细胞内、外源性凋亡的通路有关。     

黄芪甲苷通过抑制AKT和NF-κB通路诱导胃癌MGC-803细胞凋亡

目的观察黄芪甲苷对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响并探讨其诱导凋亡可能的机制。方法应用四唑盐比色法(MTT法)观察黄芪甲苷对胃癌MGC-803细胞增殖的影响,应用流式细胞术检测其对胃癌MGC-803细胞周期和凋亡的影响,应用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法观察其对蛋白激酶B(AKT)和核因子κB(NF-κB)等相关信号通路蛋白及凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)、BCL2-Associated X的蛋白质(BAX)、天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的影响。结果黄芪甲苷能够抑制胃癌MGC-803细胞的增殖并促进其凋亡,并呈时间和剂量依赖性。同时其能够抑制AKT及NF-κB通路,抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表达,促进促凋亡蛋白BAX的表达,降低BCL-2/BAX的比例,增加Caspase-3的活化。结论黄芪甲苷能够促进胃癌MGC-803细胞凋亡,推测可能通过抑制AKT和NF-κB通路,降低BCL-2/BAX的比例,增加Caspase-3的活化的机制而实现。     

NF-κB抑制剂PDTC对急性白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响

目的:探讨核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫基甲酸盐(PDTC)对急性白血病细胞HL-60增殖与凋亡的影响。方法:用PDTC 0、25、50、100μmol/L处理HL-60细胞24、48、72 h,CCK-8实验检测细胞增殖抑制率,Hoechst染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测细胞中B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(BAX)、细胞周期蛋白D1 (cyclinD1)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (cleaved caspase 3)、cleaved caspase 8及NF-κB信号通路相关蛋白表达。结果:25、50、100μmol/L PDTC处理HL-60细胞24、48、72 h后,同一时间点下随着PDTC浓度升高,细胞增殖抑制率越高(r=0.924,P 0.01),在同一PDTC浓度下,随着时间推移,细胞增殖抑制率增高(r=0.952,P 0.01)。在25、50、100μmol/L PDTC处理HL-60细胞48 h后,与对照组比较,PDTC能显著提高HL-60细胞凋亡率,并使细胞周期阻滞在G1期(P 0.01); PDTC能显著下调HL-60细胞BCL-2,cyclinD1、p-NF-κB p65表达(P 0.05),上调BAX、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8表达(P 0.01); 50、100μmol/L PDTC能显著下调HL-60细胞p-NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)表达(P 0.01)。结论:PDTC能显著抑制急性白血病细胞HL-60的增殖,并诱导细胞凋亡。     

槲皮素对多发性骨髓瘤的抗肿瘤作用及其相关机制

目的:研究槲皮素对多发性骨髓瘤细胞NCI-H929增殖、凋亡、周期的影响及其作用机制。方法:常规培养NCI-H929细胞,取对数生长期的细胞进行实验。用不同浓度槲皮素(50、100、200μmol/L)处理NCI-H929细胞24、48、72 h后,采用MTT法检测细胞增殖情况;用槲皮素100、200μmol/L处理NCI-H929细胞24 h后,使用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡水平,采用PI标记流式细胞术分析细胞周期的变化;采用Western blot法分析凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP、BCL-2和细胞周期相关蛋白P53、P21、P27、CDK4蛋白的表达水平,并检测ERK和AKT的活化情况。结果:不同浓度的槲皮素可显著抑制NCI-H929细胞的增殖,抑制效应随时间的延长和剂量的增大而增强。流式细胞术分析结果显示,槲皮素可显著诱导NCI-H929细胞凋亡,并诱导细胞发生G_2/M期阻滞。Western blot实验结果显示,槲皮素能够活化caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP,进而抑制BCL-2的表达,促进P53、P21、P27蛋白的表达和抑制CDK4蛋白的表达,并降低ERK、AKT磷酸化水平。结论:槲皮素可有效发挥对骨髓瘤细胞NCI-H929的抗肿瘤作用,该作用可能是通过诱导细胞凋亡、促进细胞周期阻滞和下调ERK/AKT通路实现的。     

马钱子碱诱导人单核细胞白血病THP-1细胞凋亡及作用机制

本研究旨在探讨马钱子碱对人单核细胞白血病THP-1细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制。应用CCK-8法检测马钱子碱对THP-1细胞的生长抑制作用;应用AO／EB荧光染色法、Annexin—V／PI双染法检测马钱子碱对THP-1细胞凋亡的影响;PI单染法检测马钱子碱对THP-l细胞周期的影响;RT-PCR检测BCL-2、BAX基因的表达。结果表明,马钱子碱能有效地抑制THP-1细胞的生长,呈剂量和时间依赖关系;THP-1细胞经浓度为400μg／ml马钱子碱作用48h后,大部分细胞核染色质被EB染成橘红色并呈固缩状,显示为晚期凋亡的细胞形态;0—400μg／ml范围内的马钱子碱作用THP-1细胞48h后,随着药物浓度的增高,细胞凋亡率逐渐上升;与对照组相比细胞周期被阻滞于Go／G1,期,并出现亚二倍体凋亡峰;RT-PCR结果显示,BCL-2基因表达明显下降,BAX基因表达上调。结论：马钱子碱能抑制THP-1细胞生长,诱导其凋亡,并对细胞周期起阻滞作用,其作用机制可能与BCL-2基因表达抑制及BAX基因表达激活有关。     

microRNA-423-5p调节PI3K/AKT通路在大鼠心力衰竭进展中的作用探究

目的探究microRNA-423-5p(miR-423-5p)调节磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路在心力衰竭进展中的作用。方法构建大鼠心力衰竭模型,同时用AngⅡ处理(100 n M,24 h)大鼠心肌细胞H9C2构建心力衰竭体外模型。H9C2细胞转染miR-423-5p的抑制剂和模拟剂实现miR-423-5p的敲除和过表达;LY294002用来抑制PI3K/AKT通路的激活。RT-PCR技术检测miR-423-5p的表达; Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、casapse-3/9及PI3K、AKT总蛋白及磷酸化蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 miR-423-5p的表达水平在模型组大鼠心肌组织和AngⅡ处理的H9C2细胞中升高;敲除miR-423-5p可抑制由AngⅡ造成的H9C2细胞凋亡,并促进了p-PI3K及p-AKT的表达,但敲除miR-423-5p的以上作用在PI3K/AKT通路被抑制后全部削弱。结论敲除miR-423-5p可通过激活PI3K/AKT通路抑制心肌细胞凋亡,进而缓解心力衰竭的恶性进展。     

PI3K抑制剂LY294002对弥漫大B细胞性淋巴瘤细胞株化疗增敏作用的研究

目的 研究PI3K抑制剂LY294002对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株ly1、ly8、ly10的化疗增敏作用.方法 采用LY294002、阿霉素及两者联合、序贯使用分别作用于ly1、ly8、ly10细胞;采用Western blot法观察LY294002处理后ly1、ly8、ly10细胞中磷酸化AKT/PKB(pAKT)的改变;采用流式细胞术结合Brdu法分析LY294002对细胞增殖和细胞周期分布的影响,采用流式细胞术结合AnnexinV-FITC染色检测各组细胞凋亡率.结果 LY294002可显著降低DLBCL细胞中磷酸化AKT的表达水平;并导致S期细胞比例显著降低(P＜0.05);LY294002预处理序贯使用阿霉素组中细胞凋亡的发生率比单独使用LY294002、阿霉素或同时联合使用LY294002、阿霉素组均明显提高,在24、48、72 h(ly1)或48、72 h(ly8)或24 h(ly10)差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 PI3K抑制剂LY294002对阿霉素诱导DLBCL细胞凋亡的促进作用提示其可能是DLBCL治疗中潜在的具有较好化疗增敏作用的分子靶向药物.     

PI3K抑制剂LY294002对胶质瘤U87细胞的放射增敏作用

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶/ 丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号转导通路抑制剂LY294002对人恶性胶质瘤细胞的放射增敏作用.方法:以人胶质瘤细胞株U87 细胞为研究对象,MTT 法观察LY294002 对U87 细胞的增殖抑制;克隆形成法分析细胞放射敏感性,计算放射增敏比(SER);流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布变化.结果:LY294002 对U87 细胞的生长有抑制作用,且呈剂量依赖性;在较低浓度时(25 滋mol/L)可降低U87 细胞照射后的克隆形成率,其SER 为1.01;流式细胞仪分析显示:LY294002 联合放射组的周期分布及凋亡率与LY294002 组,单纯放射组比较均有差异(P ＜ 0.05),表现为G0/G1期细胞增加,S 期细胞减少,凋亡率增加.结论:LY294002 可增强U87 细胞的放射敏感性,抑制PI3K/Akt 信号转导通路可提高胶质瘤的放射治疗效果.