LNK基因沉默对THP-1细胞EPO、EPOR表达影响的研究

目的:探讨LNK基因沉默对人单核细胞白血病细胞(THP-1)EPO、EPOR表达的影响。方法:培养THP-1细胞,以慢病毒为载体介导SiRNA稳定沉默LNK基因,感染72 h后在荧光倒置显微镜下观察GFP表达水平;应用流式细胞术检测慢病毒感染效率,RT-PCR验证LNK沉默效应,并检测EPO及EPOR mRNA表达水平;应用Western blot检测LNK、EPO及EPOR蛋白水平。结果:慢病毒感染72 h在荧光倒置显微镜下观察GFP表达水平达85%以上,流式细胞术检测感染效率均在99%以上;LNK沉默组LNK、EPO及EPOR mRNA表述水平明显低于对照组(P0.05)。LNK沉默组LNK、EPO及EPOR蛋白水平明显低于对照组(P0.05)。结论:成功建立了LNK基因沉默的THP-1细胞株。沉默LNK基因,则EPO及EPOR表达下调,提示LNK可能参与了EPO及EPOR的调控。     

慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响

目的观察慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响。方法将pRNAT-shSTAT3重组慢病毒质粒进行包装产生病毒液,测定其滴度,感染大肠癌HT-29细胞,筛选获得阳性细胞株,实时定量PCR和Westernblot检测shRNA对STAT3基因的沉默效率,MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功包装慢病毒,其病毒悬液的滴度为2×107TU/mL。病毒液感染大肠癌HT-29细胞,经G418筛选获得稳定细胞株,实时定量PCR和Western blot结果分别显示HT-29细胞STAT3mRNA表达和蛋白明显减弱,表达量分别为(16.9±2.1)%、(18.8±2.4)%(P0.01)。MTT结果显示STAT3基因沉默后的大肠癌HT-29细胞生长明显减慢,G0/G1期细胞占(68.73±2.88)%,S期细胞占22.93±1.10%,与对照组相比差异显著(P0.01)。结论慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长有明显的影响,细胞生长速度明显减慢,细胞阻滞于G0/G1期。     

慢性ITP患者外周血T淋巴细胞JAK2/STAT3 mRNA的表达及意义

目的:检测慢性特发性血小板减少性紫癜(chronic idiopathic thrombocytopenic purpura, CITP)患者外周血T细胞中JAK2/STAT3 mRNA信号转导通路的基因表达,探讨JAK2/STAT3 mRNA变化与CITP之间的相关性。方法:设立CITP患者组与健康对照组,用RT-PCR、琼脂糖电泳等方法检测CITP组及对照组外周血T细胞中JAK2/STAT3 mRNA基因的表达水平。结果:经PCR及RT-PCR实验证实,JAK2/STAT3 mRNA表达有清晰条带,熔解曲线峰值单一,CITP组JAK2mRNA表达水平明显高于对照组(P 0.0004);STAT3 m RNA表达水平也明显高于对照组(P 0.0001);这表明CITP患者的JAK2/STAT3 mRNA表达水平明显升高。结论:CITP组中JAK2/STAT3mRNA均有表达,且与对照组相比明显升高,其升高与患儿CITP发生有关。     

急性单核白血病细胞系THP-1细胞MLL-AF9融合基因沉默对p27表达的影响

目的 研究急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞MLL-AF9融合基因沉默对p27表达及转录调控的影响.方法 选择THP-1细胞特有的MLL-AF9融合基因为靶基因,设计并俣成MLL-AF9小干扰RNA(siRNA)片段.应用脂质体转染.方法 将MLL-AF9 siRNA导入细胞,通过流式细胞术检测siRNA转染效率,用RT-PCR法比较转染前后MLL-AF9 mRNA表达水平的变化,Western blot检测MLL-AF9蛋白水平沉默效果,比较细胞周期抑制蛋白p27表达变化,利用染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术研究MLL-AF9融合蛋白是否与p27启动子结合.结果 转染MLL-AF9siRNA后THP-1细胞MLL-AF9 mRNA相对表达水平(0.31±0.07)较对照组(1.25±0.13)明显受抑(P＜0.01),p27 mRNA表达水平(0.84±0.12)较对照组(0.35±0.03)明显上调(P＜0.01),应用ChIP结合PCR扩增的.方法 分析发现MLL-AF9融合蛋白可与THP-1细胞p27基因启动子区域的DNA片段结合.结论 MLL-AF9融合基因沉默后可使p27表达上调,其机制可能为MLL-AF9基因沉默解除了MLL-AF9融合蛋白与p27启动子的结合,从而恢复p27基因的表达.     

慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响

目的 观察慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响.方法 将pRNAT-shSTAT3重组慢病毒质粒进行包装产生病毒液,测定其滴度,感染大肠癌HT-29细胞,筛选获得阳性细胞株,实时定量PCR和Western blot 检测shRNA对STAT3基因的沉默效率, MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功包装慢病毒,其病毒悬液的滴度为2×107 TU/mL.病毒液感染大肠癌HT-29细胞,经G418筛选获得稳定细胞株,实时定量PCR和Western blot结果分别显示HT-29细胞STAT3mRNA表达和蛋白明显减弱,表达量分别为（16.9±2.1）%、（18.8±2.4）%（P＜0.01）.MTT结果显示STAT3基因沉默后的大肠癌HT-29细胞生长明显减慢, G0/G1期细胞占（68.73±2.88）%, S期细胞占22.93±1.10%, 与对照组相比差异显著（P＜0.01）.结论 慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长有明显的影响,细胞生长速度明显减慢,细胞阻滞于G0/G1期.     

MiR-467b调控JAK/STAT信号通路在脂多糖诱导ATDC5细胞增殖及炎症反应中的作用

目的:探讨miR-467b调控JAK/STAT信号通路在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导ATDC5细胞增殖及炎症反应中的作用。方法:将ATDC5细胞分为4组:对照组、LPS组、NC mimics组、miR-467b mimics组。于转染培养48 h后收集细胞并进行后续实验:采用ELISA检测各组细胞TNF-α、IL-1β水平;采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-467b的表达水平;采用MTT法检测各组细胞的增殖能力;采用蛋白质印迹和qRT-PCR法检测各组细胞JAK/STAT信号通路相关基因的蛋白质及mRNA表达水平。结果:与对照组相比,LPS组和NC mimics组ATDC5细胞TNF-α、IL-1β的表达水平均显著升高、miR-467b的表达水平显著降低(P<0.05);MTT实验结果表明:LPS组在24、48、72 h的吸光度值显著降低(P<0.05)。蛋白质印迹结果发现:与对照组相比,LPS组和NC mimics组ATDC5细胞STAT1、STAT3、JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-JAK2蛋白表达水平及STAT1、STAT3、JAK2 mRNA表达水平均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与NC mimics组相比,miR-467b mimics组TNF-α、IL-1β的表达水平均显著降低而miR-467b的表达水平显著升高(P<0.05);过表达miR-467b后,细胞在24、48、72 h的吸光度值显著升高(P<0.05),而STAT1、STAT3、JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-JAK2蛋白表达水平及STAT1、STAT3、JAK2 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。结论:LPS刺激ATDC5细胞后可通过激活JAK/STAT3信号通路引起细胞炎性损伤,过表达miR-467b后可抑制JAK/STAT3信号通路的活化,降低ATDC5细胞的炎症水平。     

PLK1在套细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

目的:研究PLK1在套细胞淋巴瘤中的表达,探讨shRNA干扰沉默PLK1基因表达对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖、凋亡、周期的影响。方法:应用免疫组织化学S-P法检测42例套细胞淋巴瘤和30例反应性增生淋巴结炎患者组织中PLK1蛋白并进行分析与比较。PLK1 shRNA慢病毒感染Jeko-1细胞,应用RQ-PCR检测PLK1 mRNA的表达及Western blot检测PLK1蛋白的表达,鉴定PLK1 shRNA干扰沉默效果,CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinⅤ/PI双染检测细胞凋亡, PI单染检测细胞周期,Western blot测定凋亡相关蛋白BAX BCL-2、Caspase-3的变化。结果:套细胞淋巴瘤患者组织中PLK1阳性率66.67%(28/42),明显高于增生淋巴结炎患者组织的20%(6/30)(P 0.05)。PLK1阳性表达与套细胞淋巴瘤患者B症状、IPI评分、Ann-Arbor临床分期存在相关性(P 0.05)。PLK1 shRNA慢病毒感染Jeko-1细胞72 h后,PLK1 mRNA和PLK1蛋白表达明显下降(P0.05),PLK1 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P 0.05),PLK1 shRNA组细胞的凋亡率为(27.42±3.44)%,明显高于对照组的(1.23±0.42)%和Neg shRNA组的(2.07±0.58)%(P 0.05)。细胞周期分析发现,PLK1 shRNA组的G2/M期细胞比例为(27.21±3.59)%,高于对照组的(13.28±2.63)%及Neg shRNA组的(14.34±2.37)%(P 0.05)。凋亡相关蛋白检测显示,促凋亡蛋白BAX上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调、caspase-3表达上调。结论:PLKl在套细胞淋巴瘤患者组织中过量表达,干扰沉默PLK1基因可抑制人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞细胞增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期于G2/M期。     

下调STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究。方法:人腺样囊性癌生长细胞株ACC 2常规培养,分别采用A组为空白转染组,B组转染阴性对照siRNA(NC),C组转染特异性的siRNA(siRNA组)转染进ACC2,采用qRT PCR和Western blot法检测转染后STAT3 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT检测转染后腺样囊性癌细胞增殖。结果:ACC2细胞转染STAT3 siRNA 48 h后,STAT3 mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。ACC 2生长72 h细胞转染后细胞增殖受到抑制,较对照组有显著性差异(P0.05)。结论:STAT3基因有可能成为腺样囊性癌细胞生长基因治疗中重要的靶基因。     

JAK/STAT信号通路对肠道病毒71型感染的调控作用

目的探讨肠道病毒71型(EV71)与JAK/STAT信号通路的关系。方法 EV71感染人横纹肌肉瘤(RD)细胞和人单核-巨噬细胞系THP-1细胞,用IFN-α2b(1 000 U/m L)刺激1 h,用实时荧光定量PCR(real-time qRT-PCR)法检测EV71感染前后以及感染病毒细胞接受IFN刺激前后4种干扰素刺激基因ISG15、ISG56、OAS1和MXA及STAT1、VP1的mRNA水平变化,观察IFN-α2b(1 000 U/m L)对EV71/VP1的影响,并用western blot分析转录因子STAT1磷酸化水平和EV71/VP1蛋白质表达水平变化。结果 EV71感染RD细胞后,MXA mRNA的相对表达量下调,未见STAT1的磷酸化。而感染THP-1细胞后,MXA、OAS1和ISG56 mRNA的表达水平及STAT1的磷酸化水平均上调。与未感染EV71而经IFN-α2b处理的细胞相比,EV71感染的RD细胞经IFN-α2b处理后ISG15、ISG56、OAS1、MXA的mRNA表达水平及STAT1磷酸化水平下降,并抑制EV71/VP1的mRNA和蛋白质水平的表达。EV71感染的THP-1细胞经IFN-α2b处理后与未感染EV71而经IFN-α2b处理组细胞相比,上述4种干扰素刺激基因的mRNA表达水平及STAT1磷酸化水平明显上调,并抑制EV71/VP1的mRNA和蛋白质水平的表达。结论EV71感染可抑制RD细胞内JAK/STAT信号通路,而对THP-1细胞的影响则相反,提示THP-1细胞在EV71感染的固有免疫应答中发挥作用。     

CyclinD1基因过表达慢病毒载体的构建和对神经干细胞增殖的影响

目的:针对小鼠cyclinD1基因构建质粒并进行慢病毒包装,转染小鼠神经干细胞,检测其表达水平。方法:根据cyclinD1基因信息,采用DNA重组技术将Nestin promoter-Ccnd1基因插入plenti6慢病毒表达载体,重组获得慢病毒载体plenti-D1;经测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,并检测病毒滴度。设立空白对照组、阴性病毒对照组及过表达慢病毒感染组。将病毒转染小鼠胚胎神经干细胞,经实时荧光定量PCR和western blot法分析转染前后3组cyclinD1表达情况,MTT法检测不同MOI值对神经干细胞增殖的影响。结果:测序结果证实cyclinD1基因正确插入载体中,成功构建小鼠cyclinD1基因过表达载体。实时荧光定量PCR结果显示过表达慢病毒感染组cyclinD1 mRNA较其他2组明显升高;Western Blot鉴定cyclinD1蛋白表达成功。plenti-D1的MOI值为10、20、50时均明显促进神经干细胞增殖。结论:cyclinD1基因慢病毒表达载体能感染小鼠胚胎神经干细胞,外源基因稳定表达。cyclinD1基因过表达能促进神经干细胞的增殖。     

siRNA沉默胰腺癌BXPC-3细胞中Her-2/neu基因对COX-2表达水平及细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响

目的分析胰腺癌BXPC-3细胞中原癌基因人表皮生长因子受体-2(Her-2/neu)基因siRNA沉默对环氧合酶-2(COX-2)表达水平及其对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法通过Western blot法与实时荧光定量PCR法对正常胰腺细胞株和胰腺癌BXPC-3细胞中的COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达进行检测。建立Her-2/neu基因siRNA慢病毒表达载体并对BXPC-3细胞进行转染,其中转染Her-2/neu siRNA慢病毒载体为观察组,转染NC-GFP-LV为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。分别采用CCK-8法、流式细胞分析仪和细胞实验技术(Transwell实验)分析Her-2/neu基因siRNA沉默对细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。结果 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中的表达水平明显高于正常胰腺HPDE6C7细胞的表达(P0.01)。观察组COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA表达水平明显下调,较阴性对照组与空白对照组表达水平均明显降低(P0.01),而阴性对照组与空白对照组表达水平的比较,并无显著差异(P0.05)。Her-2/neu基因siRNA沉默可明显减弱细胞增殖和侵袭力,增加细胞凋亡率。结论 COX-2、Her-2/neu蛋白及其mRNA在胰腺癌BXPC-3细胞中均呈现高表达,且Her-2/neu基因siRNA沉默可明显阻滞细胞增殖及侵袭,导致细胞凋亡。     

重组干扰质粒对卵巢癌COC1细胞HDAC1表达的影响

目的构建重组HDAC1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒干扰质粒并研究其对卵巢癌COC1细胞HDAC1表达的影响。方法针对HDAC1基因设计特异性siRNA靶点,构建慢病毒干扰质粒载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒干扰序列,将其转染卵巢癌COC1细胞。采用Real-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效果,Western blot方法检测靶基因在蛋白质水平的沉默效果。结果构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确。shRNA慢病毒干扰质粒转染COC1细胞后HDAC1基因的mRNA表达量和蛋白质水平较阴性对照质粒转染组均显著下调(P0.05)。结论成功构建HDAC1基因的shRNA慢病毒干扰质粒,该慢病毒干扰质粒能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

STAT3基因在急性髓系白血病中的表达及临床意义

目的:探讨STAT3基因在初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓中的表达及其与临床特征的相关性。方法:采用实时荧光定量PCR检测38例AML患者骨髓中STAT3 mRNA表达水平,分析其与临床特征及预后的相关性;利用Western blot检测AML患者骨髓中STAT3蛋白表达水平。选择15例正常人作为对照组。结果:在mRNA水平上,AML组的STAT3表达水平明显高于正常对照组(P0.05);AML组的STAT3表达水平与危险程度呈正相关(P=0.01,r=0.592),高危组的STAT3表达水平明显高于标危组及对照组,其差异均有统计学意义(P0.01,P0.01),其余各组间差异无统计学意义(P 0.05);M5组STAT3表达水平显著高于对照组,且有统计学差异(P=0.01);M2与M5及对照组之间STAT3表达水平无统计学差异(P=1,P=0.066)。STAT3低表达组患者的中位生存时间长于高表达组,但其差异无统计学意义(P=0.146)。在蛋白水平上,AML组STAT3表达水平高于对照组(P=0.017)。结论:STAT3基因在AML患者中存在高表达,且与患者免疫分型、危险度具有相关性。     

LNK基因在急性白血病患者中的表达及临床意义

目的:探讨LNK基因在急性白血病患者中的表达及其与临床特征的相关性。方法:采用实时荧光定量PCR检测80例AL(ALL 42例,AM L 38例)患者骨髓中LNK m RNA的表达水平,分析其表达水平与临床特征的相关性,应用Western blot检测患者的LNK蛋白表达量。以正常的志愿者(16例)骨髓作为对照组。结果:ALL和AM L组的LNK水平均明显高于正常对照组(P=0.007,P=0.021),ALL组与AM L组之间LNK水平无统计学差异;ALL和AML组中的LNK表达水平均与危险程度呈正相关(P=0.000,P=0.004,r=0.5,r=0.386),且ALL和AML组中高危组的LNK水平均明显高于对照组(P=0.035,P=0.032),AML和ALL组的中危组(P=0.239,P=0.609)及标危组(P=0.974,P=1)LNK水平均高于对照组,但无统计学意义,各组之间危险程度无统计学差异。急性白血病患者LNK蛋白表达量较对照组增加。结论:急性白血病患者LNK基因表达高于正常人,与患者危险度呈正相关。     

HIF-1α对K562细胞血管生成相关因子的影响

目的:通过在K562细胞过表达和干扰HIF-1α后检测K562细胞分泌血管生成相关因子的水平,探讨慢性白血病血管生成的机制。方法:应用携带和干扰HIF-1α基因的慢病毒转染K562细胞,将转染携带和干扰HIF-1α基因的K562细胞分别纳入过表达组、干扰组,同时以空载病毒转染K562细胞纳入对照组。3组细胞在常氧状态下培养72 h后收集细胞,通过荧光显微镜观察3组转染效率,采用RT-PCR法检测HIF-1α和血管相关生成因子mRNA表达水平,ELISA法检测培养上清中血管相关细胞因子的浓度。结果:慢病毒转染K562细胞最佳转染复数(MOI)为10,转染效率为50%左右;经过嘌呤霉筛选后转染阳性细胞达90%以上。干扰组ANG-I、ANG-II、TGF-α和VEGF mRNA表达均低于过表达组,而干扰组TGF-β1 mRNA表达高于过表达组。干扰组ANG-I、VEGF mRNA表达低于对照组;培养上清中未检测到TGF-α,干扰组ANG-I和TNF-α水平低于过表达组,而干扰组VEGF水平高于过表达组;过表达组和干扰组TGF-β1水平均低于对照组,过表达组VEGF水平低于对照组,干扰组VEGF水平高于过表达组和对照组,上述差异具有统计学意义(P 0.05)。结论:通过嘌呤霉素筛选获得慢病毒转染K562细胞阳性细胞,HIF-1αmRNA正向调控K562细胞ANG-1、ANG-2、TGF-α、VEGF mRNA的表达,促进ANG-I和TNF-α自身分泌的能力,而不刺激TGF-α的自分泌,HIF-1α上调可抑制K562细胞TGF-β1的表达并抑制TGF-β的自分泌。     

青蒿琥酯通过诱导凋亡发挥抗THP-1细胞增殖作用

目的:了解青蒿琥酯(artesunate,ART)是否能抑制THP-1细胞的增殖,并探讨其相关的抗白血病的作用机制。方法:分别用5种浓度的青蒿琥酯处理THP-1细胞24、48和72 h,采用CCK-8法检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot方法检测STAT3、Caspase3和Caspase8蛋白表达水平的变化。结果:与对照组相比,ART能明显抑制THP-1细胞的增殖,其效应呈剂量依赖性(r=0.9829,P0.05);流式细胞术实验结果表明,ART能显著增加THP-1细胞的凋亡,且ART处理THP-1细胞后STAT3蛋白表达显著下降(P0.01),同时Caspase3及裂解的Caspase3和Caspase8表达均增加(P0.01)。结论:青蒿琥酯能抑制THP-1细胞的生长,可能与下调STAT3蛋白的表达,并同时激活Capase3和Caspase8有关。     

shRNA沉默NSD2基因表达对OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨干扰shRNA下调NSD2基因表达对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt /mTOR信号通路的影响。方法:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞,应用real time Q-PCR检测NSD2 mRNA的表达和Western blot法检测NSD2蛋白的表达,以鉴定NSD2 shRNA的沉默效果,应用CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot测定组蛋白H3K36二甲基化水平(H3K36me2)、BAX BCL-2、caspase-3、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)的变化。结果:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞72 h后,real time Q-PCR和Western blot检测显示NSD2的mRNA和蛋白表达均有明显下降(P0.05),NSD2 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P0.05),NSD2 shRNA组细胞的凋亡率明显高于对照组和和Neg shRNA组(30.37±4.22)%vs(1.36±0.52)%和(2.17±1.43)%(P0.05);促凋亡蛋白BAX表达上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调,caspase-3表达上调;H3K36me2水平较对照组明显下降,而检测Akt /mTOR通路蛋白发现,Akt总蛋白水平未明显下降,但是活性形式的磷酸化p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K表达下调。结论:干扰沉默NSD2基因可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是调节组蛋白H3K36me2水平变化,特异性地抑制Akt /mTOR信号通路的活性。     

Bmi-1基因表达对THP-1细胞化疗敏感性的影响

目的:研究Bmi-1表达对急性单核细胞白血病细胞THP-1化疗敏感性的影响,及其相关作用机制。方法:以瞬时转染法将p Genesil-2-Bmi-11 si RNA、p-MSCV-Bmi-1分别转入THP-1细胞中降低、增强Bmi-1的表达。用PCR和Western blot法验证Bmi-1 m RNA和蛋白的表达;MTT法检测喜树碱(CPT)对THP-1细胞增殖及Bmi-1表达对THP-1细胞化疗敏感性的影响;采用免疫荧光法检测细胞中DNA双链断裂标志物γ-H2AX的表达;流式细胞术检测线粒体膜电位及凋亡情况;Western blot法检测Cytochrome C、Caspase 3、Bax和BCL-2蛋白的表达。结果:沉默Bmi-1能够抑制THP-1细胞的增殖并增强THP-1细胞对CPT的敏感性,而Bmi-1过表达促进细胞增殖并减弱THP-1细胞对CPT的敏感性;沉默Bmi-1能够增强CPT诱导的DNA双链断裂,降低线粒体膜电位并促进CPT诱导的细胞凋亡,Bmi-1基因过表达减弱了CPT诱导的DNA双链断裂,线粒体膜电位升高,CPT诱导的细胞凋亡率明显减少。结论:Bmi-1表达能够改变THP-1细胞对CPT的敏感性,其机制可能涉及DNA双链断裂及线粒体凋亡。     

槲皮素对宫颈癌HeLa细胞STAT3的表达及其信号通路的影响

目的初步探讨信号转导子和转录激活子STAT3在宫颈癌发生发展中的作用以及槲皮素对宫颈癌细胞中STAT3表达的影响。方法用RT-PCR检测不同浓度的槲皮素作用人宫颈癌HeLa细胞中STAT3 mRNA的表达,并以细胞免疫荧光技术观察凋亡细胞内STAT3和磷酸化STAT3(P-STAT3)的改变。结果槲皮素处理HeLa细胞后,当槲皮素浓度从6.25μmol/L增加到50μmol/L,相同时间HeLa细胞内STAT3 mRNA表达逐渐降低,除6.25μmol/L组与溶剂对照组相比无统计学差异(P>0.05)外,余差异全部有统计学意义(P<0.05),且处理24h后,STAT3 mRNA表达量与给药浓度呈负相关,r1=-0.861,P=0.000;各时间段不同浓度组(6.25、12.5、25、50μmol/L)两两相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着时间变化,相同浓度组中STAT3 mRNA表达明显降低,在给予6.25μmol/L槲皮素后,STAT3 mRNA的表达量呈时间依赖性,r2=-0.539,P=0.000。运用免疫荧光技术观察到STAT3蛋白及磷酸化水平随槲皮素浓度及时间增加表达呈明显下降趋势。结论槲皮素能明显抑制HeLa细胞的生长;槲皮素可抑制细胞内STAT3表达,从而可能通过抑制JAK/STAT信号通路诱导宫颈癌细胞凋亡。     

慢病毒介导的IGF-1R基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响

目的探讨慢病毒介导的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对肝细胞癌的增殖和迁移的影响。方法设计并筛选高效特异性胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因的小干扰RNA,构建稳定遗传的慢病毒载体质粒,观察其转染沉默IGF-1R基因的肝癌细胞株Huh7细胞增殖、迁移以及侵袭能力,进一步观察其对PI3K/Akt及Bax/Bcl-2通路的影响。结果采用倒置相差荧光显微镜观察转染效果,镜下可见较多细胞特异性表达GFP绿色荧光,转染率超过80%。scrambled阴性对照组以及空白对照组IGF-1R mRNA及蛋白的相对表达量显著高于LV-IGF-1R-RNAi转染组(P0.01)。成功转染后,培养细胞72 h、96 h,LV-IGF-1R-RNAi转染组增值率显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05或P0.01)。侵袭实验和迁移实验均证实细胞明显受到抑制(P0.01)。蛋白免疫印迹法显示,LV-IGF-1R-RNAi转染组p-PI3K、p-Akt及Bcl-2相对表达量显著低于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05);而Bax显著高于scrambled阴性对照组以及空白对照组(P0.05)。结论RNAi技术沉默IGF-1R基因表达能显著抑制肝癌细胞株Huh7细胞的增殖、侵袭作用,而这一作用可能与抑制PI3K/Akt通路蛋白磷酸化及调节Bax/Bcl-2通路蛋白表达有关。