慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因克隆与真核细胞表达的研究

目的 为研究慢性粒细胞白血病(CML)的肿瘤基因疫苗，克隆和表达CML的bcr—abl融合基因片段。方法 根据bcr—abl(b3a2)融合基因序列自行设计一对寡核苷酸引物，以CML K562细胞株的总RNA为模板，通过RT—PCR扩增包含bcr-abl融合位点周围450bp的基因片段，并将其克隆进pGEM—T easy载体。经序列测定证实其阅读框架正确后，将bcr—abl融合基因片段正向插入真核细胞表达载体pcDNA3．1。以脂质体介导重组质粒pcDNAbcr—abl转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，用间接免疫荧光法(IFA)检测基因表达情况。结果 成功构建了包含融合位点基因片段的bcr—abl融合基因真核细胞表达载体pcDNAbcr—abl，pcDNAbcr—abl转染的CHO细胞的免疫荧光强度高于K562阳性对照细胞。结论 bcr—abl融合基因片段在真核细胞中能高效表达，pcDNAbcr—abl真核细胞表达载体的构建为进一步研究bcr—abl融合基因在CML防治中的作用奠定了基础。     

大鼠干扰素诱导蛋白-10真核表达质粒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达

目的构建大鼠干扰素诱导蛋白-10（IP-10）基因的真核表达质粒,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验所需的IP-10基因片段,通过酶切IP-10基因片段、真核表达质粒载体pEGFP—cl和连接反应,构建IP-10的真核表达质粒pEGFP—cl—IP-10,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测pEGFP—cl—IP-10在NIH 3T3细胞中的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因片段被成功克隆人真核表达质粒载体pEGFP—cl,免疫荧光技术检测证实,该基因能在NIH 3T3细胞中表达。结论证实IP-10基因可在NIH 3T3细胞中表达,为将其作为DNA疫苗治疗自身免疫性疾病的研究奠定了基础。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建ber/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/abl mRNA和P210蛋白的影响.方法:根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tusch Ⅰ设计原则,选择设计双链小干扰RNA(siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达.结果:构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24 h后,pTER117使bcr/abl mRNA的相对水平下降50%,使P210蛋白下降47%.结论:bcr/abl融合基因siR-NA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达.     

pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定

目的：利用基因工程技术构建pmRNA IRES—hKDR（Ig1-3）重组质粒，为其应用于肿瘤的基因治疗奠定基础。方法：以本实验室构建保存的pcDNA3．1hKDR为模板，PCR扩增hKDR（Ig1-3）eDNA片段后用Nco Ⅰ和XhoⅠ酶切后插入pmRNA IRES多克隆位点的相应位点中，经PCR、酶切和测序鉴定其序列正确性，然后用试剂盒体外转录出相应的mRNA，用脂质体转染COS-7细胞，经G418筛选后通过免疫组化和Western blot检测该融合蛋白。结果：PCR、酶切和测序证实pmRNAIRES—hKDR（Ig1-3）构建成功，体外转录出相应的mRNA，免疫组化和Western blot检测出其蛋白表达。结论：成功构建含pmRNAIRES—hKDR（Ig1-3）的真核表达重组质粒，有助于进一步研究其抗肿瘤作用。     

HPV_(16)E7-HSP_(70)融合表达质粒的构建及鉴定

采用分子克隆技术 ,首先将 HSP70 基因片段克隆到真核表达载体 pc DNA3 .1ˉ上 ,获得 pc DNA-HSP重组质粒 ,然后采用 PCR扩增技术 ,定点突变编码 HPV1 6 E7蛋白 C末端锌指结构的基因序列 ,将该突变的 E7基因插入 pc DNA-HSP重组质粒 ,通过粘端连接的方式构建 pcd-HPV1 6 E7-HSP70 融合表达质粒 ,最后通过限制性内切酶酶切、PCR和 DNA测序等技术鉴定。结果显示 ,重组融合表达质粒经酶切、PCR和 DNA测序证明其突变位点、碱基及阅读框架均准确无误。     

Tudor-SN蛋白TSN结构域亚结构片段重组质粒的构建与表达

目的:研究人类Tudor-SN蛋白TSN结构域4个亚片段的功能,构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增出目的基因,将双酶切后带有粘性末端的目的片段和pEGFP-C2载体连接,从而构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。将构建成功的重组质粒用脂质体法转染HeLa细胞,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:对重组质粒进行双酶切鉴定可见Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)的cDNA片段;脂质体转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。结论:真核pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)重组质粒构建及表达成功。     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

重组真核质粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的构建和表达

目的:将人类Tudor-SN蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pERFP-C1质粒,使Tudor-SN蛋白SN各功能片段与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pERFP-C1载体上,再将构建成功的pERFP-C1-Tudor-SN-SN(1～4)重组质粒转染入HeLa细胞内,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜下观察到红色融合蛋白的表达。结论:重组pERFP-C1-h Tudor-SN-SN(1～4)质粒构建及表达成功。     

急性淋巴细胞性白血病bcr/abl融合基因表达的临床研究

目的：研究bcr/abl融合基因在急性淋巴细胞白血病（ALL）患的表达与临床疗效的关系。方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）方法检测了31例ALL患bcr/abl融合基因的表达。结果：患bcr/abl融合基因阳性表达9例（29％），其中完全缓解3例（33．3％）；bcr/abl融合基因阴性表达22例（71％），其中完全缓解17例（77．3％），两组比较具有差异性（P＜0．05）。结论：bcr/abl融合基因阳性表达的ALL患临床疗效较差。     

异种移植模型转人a1,2岩藻糖基转移酶基因小鼠显微注射DNA片段的制备

目的制备转人琢1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段。方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HTcDNA全长序列,两端含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切纯化质粒鉴定;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-HTcDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HTcDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;PvuⅠ和NotⅠ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液。结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段。结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠。     

异基因造血干细胞移植后微小残留病灶的动态监测

目的探讨bcr／abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病(CML)治疗效果及微小残留病灶监测方面的价值。方法应用RT—nested—PCR方法定期检测异基因造血干细胞移植(allo—HSCT)治疗慢性粒细胞性白血病患者前后融合基因表达情况。结果异基因造血干细胞移植患者在移植后1个月到2个月bcr／abl融合基因转阴率为76％,100天转阴率达88％。结论RT—nested PCR方法检测bcr／abl融合基因可以作为临床诊断、判定预后的指标,适用于微小残留病变的监测。     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141序列的克隆和表达载体构建

目的：构建人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（hPTHrP1—141）基因的表达载体。方法：提取人基因组DNA，PCR扩增PTHrP1—141基因，将其克隆入原核表达载体pQE-30Xa，构建重组表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141。结果：重组载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141经限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。结论：表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141构建成功。     

hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆及序列分析

目的：构建含限制性内切酶位点PstⅠ、KpnⅠ的hMSH2基因cDNA保守区域的pGEM-T-S载体,比较分析序列的变化,为以后的毒理学研究提供实验材料,方法：从人胚肺成纤维细胞HLF中抽提总RNA进行RT－PCR扩增,直接与T载体连接转化大肠杆蓖DH5α,用蓝／白斑试验筛选阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,再行序列分析。结果：经RT－PCR获得631bp含量制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实,克隆片段与genbank中该基因的序列同源性为99．5％。结论本文成功地构建了含hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆,该克隆可为DNA错配修复缺陷与致癌关系研究提供工具。     

r-PA真核表达载体的构建与鉴定

用SV40和CaMV 35S两种启动子分别启动瑞替普酶(reteplase，r-PA)和标记基因bar基因，构建能在海带中表达外源基因的重组表达载体。通过PCR方法扩增CaMV35S启动子、bar基因和r-PA基因，将扩增的3个片段分别克隆到pGEM-T Easy Vector上。将CaMV片段亚克隆到pCAT3-control载体上得到重组质粒pCAT／CaMV；再将bar基因切下插入到CAT／CaMV上得到重组质粒pCAT／C-B，最后将rPA基因片段切下后插入到pCAT／C-B上获得重组质粒pSVrPA／C-B。PCR、酶切及测序结果均表明已成功扩增出CaMV 35S、r-PA和bar基因片段，并已顺次正确插入到真核表达载体PCAT3-control上，最终成功构建了能在海带中表达r-PA的真核表达载体，用基因枪法转入海带中表达，FAPA法测定得到有体外纤溶活性的阳性海带，为后续研究工作打下坚实的基础。     

PML-RARα245与hGM-CSF双基因DNA疫苗的构建与表达

目的 采用长度为245 bp的急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因片段构建新的PML-RARα与hGM-CSF真核双表达载体.方法 用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增长度为245 bp的PML-RARα基因片段,PCR技术从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点A和B中,构建真核双表达载体.用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性.将重组质粒转染K562细胞,利用RT-PCR和点杂交技术检测重组质粒在真核细胞中的转录和翻译情况.结果 双酶切结果证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列完全正确.该重组质粒能够在真核细胞中正常转录和翻译.结论 成功构建了含有PML-RARα245及hGM-CSF的双表达载体,为筛选合适的抗原片段用于构建治疗急性早幼粒细胞白血病的PML-RARαDNA疫苗提供重要资料.     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

突变SOD1cDNA亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中

目的将突变SOD1cDNA亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中。方法利用PCR方法从重组子pEGFP—N2-mSOD1中扩增突变的SOD1cDNA片断。以EcoRⅠ／salⅠ双酶切突变SOD1cDNA片断和酵母穿梭表达质粒pGBKT7，在T4DNA连接酶的作用下，连接突变SOD1cDNA片断和酵母穿梭表达质粒pGBKT7。转化感受态DH5α，筛选重组子，进行双酶切和测序鉴定。结果经酶切和测序鉴定，突变SOD1cDNA成功地亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中。结论亚克隆成功，可以对目的基因进行下一步研究。     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。