大段骨缺损种子细胞培养中微载体技术与普通方法培养人骨髓间充质干细胞的比较

目的比较微载体方法和普通方法培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立一种大规模培养扩增hMSCs的方法。方法将普通培养瓶培养的第3代hMSCs分为两部分,一部分1×107个采用微载体培养,另一部分采用普通培养瓶培养,分别观察细胞增殖情况,做出生长曲线,比较两种方法细胞增殖速度(收获细胞数/接种细胞数/培养时间),最终收获的细胞进行细胞表面生长因子的检测。结果微载体法接种24h后约87%的hMSCs细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约八九天后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的15～20倍,细胞增殖速度是普通培养法的3～5倍,二者差异有显著性意义(P<0.01)。流式细胞仪检测显示,两种方法所培养的hMSCs都均一的表达CD29和CD44,而CD34,CD45和HLA-DR阴性。结论应用微载体技术可以比普通培养更快的速度扩增hMSCs,且细胞表面抗原特性不变,更适合组织工程技术治疗大段骨缺损对种子细胞的需要。     

微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较

目的：比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞，建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。 方法：实验于2003—12／2004—10在西南医院中心实验室完成。取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心，采用普通培养法培养。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养，分别于培养的第2，4，6，8，10．12，14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性，观察细胞增殖情况，作出生长曲线。比较两种方法细胞增殖速度（收获细胞数除以接种细胞数，为细胞扩增倍数，以之除以培养天数为增殖速度）。 结果：①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较：培养微载体法接种24h后约87％的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展，3d后生长加速。10—11d后细胞生长达最大值，最终细胞收获密度为接种时的15—20倍，微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3—5倍，两者差异有显著性（P〈0．01）。②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较：两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达最大值。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性（P〉0．05）。 结论：应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导，更快地扩增，利于满足骨组织工程量和质的需要。     

微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较

目的:比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法:实验于2003-12/2004-10在西南医院中心实验室完成。取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心,采用普通培养法培养。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性,观察细胞增殖情况,作出生长曲线,比较两种方法细胞增殖速度(收获细胞数除以接种细胞数,为细胞扩增倍数,以之除以培养天数为增殖速度)。结果:①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较:培养微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的15～20倍,微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3～5倍,两者差异有显著性(P<0.01)。②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较:两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达最大值。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性(P>0.05)。结论:应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导,更快地扩增,利于满足骨组织工程量和质的需要。     

微载体技术培养人骨髓间充质干细胞的成骨诱导实验

目的：以微载体技术成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞，建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法：实验于2002—12／2003—08在第三军医大学西南医院中心实验室完成。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养，观察细胞增殖情况，作出生长曲线。分别于培养的第2，4，6，8，10，12，14d检测诱导细胞的碱性磷酸酶活性，并与普通成骨诱导方法进行对比。最后进行细胞碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组织化学染色，观察培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果：微载体法接种24h后约87％的人骨髓间充质干细胞贴附于微载体并铺展，3d后生长加速，约10～11d后细胞生长达最大值，最终细胞收获密度为接种时的约15～20倍。诱导细胞的碱性磷酸酶活性在培养的第12天达最大值，并表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：应用微载体可以成功进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导扩增，可以满足骨组织工程量和质的需要。     

微载体技术培养人骨髓间充质干细胞的成骨诱导实验

目的:以微载体技术成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法:实验于2002-12/2003-08在第三军医大学西南医院中心实验室完成。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,观察细胞增殖情况,作出生长曲线。分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14d检测诱导细胞的碱性磷酸酶活性,并与普通成骨诱导方法进行对比。最后进行细胞碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组织化学染色,观察培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果:微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的约15～20倍。诱导细胞的碱性磷酸酶活性在培养的第12天达最大值,并表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性意义(P>0.05)。结论:应用微载体可以成功进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导扩增,可以满足骨组织工程量和质的需要。     

微载体悬浮培养体系对人脂肪基质干细胞增殖与分化的影响

目的：观察微载体悬浮培养系统对成人脂肪基质干细胞的培养效果及培养后细胞的分化能力。方法：实验于2004-09／12在军事医学科学院组织工程中心完成。悬浮培养系统采用Cytodex3微载体为贴壁依赖性细胞脂肪基质干细胞提供贴壁条件，浓度为5g／L。常规静止培养在12孔培养板中进行。两系统细胞接种密度均为1&;#215;10^8L^-1。分别观察细胞增殖情况，并对用悬浮培养体系培养的细胞进行细胞表型及分化能力检测。结果：微载体悬浮培养9d后达到最大活细胞密度(1．60&;#215;10^9L^-1)，常规静止培养第7天就达到最大活细胞密度(3．38&;#215;10^8L^-1)。在微载体悬浮培养条件下，脂肪基质干细胞生长更为旺盛，细胞产量更高，优于常规静止培养。微载体悬浮培养11d后，脂肪基质干细胞依然保持多向分化能力。结论：利用悬浮培养体系系统以及微载体技术有利于脂肪基质干细胞的大规模快速生长，细胞扩增后仍然保持其细胞表型及分化能力。获得的脂肪基质干细胞可以作为组织工程种子细胞实验研究及其临床应用。     

不同培养条件对肝干细胞生长的影响

目的：初步探讨肝干细胞在不同培养条件下的生长情况并探索不同浓度的FGF4对肝干细胞生长的影响。方法：卵圆细胞活化动物模型是利用改良Solt-Farber法建立的：三分之二的肝切除(2／3PH)及服用2-乙酰氨基芴(从F)造成卵圆细胞活化增殖。在对照组、鼠尾胶组及cytodex^TM3微栽体3种培养条件下培养肝干细胞并检测不同FGF4浓度下的肝干细胞生长活性。结果：在3种不同培养条件下均可见肝干细胞生长，在cytoclexr^TM3微载体培养瓶中卵圆形细胞增殖速度快，数目增多，形成成片状或串珠状细胞团。结论：cytodex^TM3微载体培养方法优于其他方法．有利于肝干细胞生长。     

脂肪干细胞体外快速扩增实验研究

目的：探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增兔脂肪干细胞的方法。方法：比较应用微载体结合旋转生物反应器（RCSS）进行动态培养与平皿静态培养两种方法中,脂肪干细胞生长曲线、倍增时间和生长周期的情况。结果：实验组RCSS法培养中脂肪干细胞密度可达最初接种的19倍左右,而对照组平皿静态培养仅为6倍余。实验组倍增时间短于对照组,且细胞周期分析显示G2-M期＋S期细胞比例高于对照组。结论：利用微载体细胞培养技术可快速地在体外扩增脂肪干细胞。     

传代培养密度对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

背景：组织工程技术的快速发展为骨缺损完全再生修复带来了新的希望，种子细胞的快速扩增是其中的关键问题之一。 目的：观察人间充质干细胞传代培养时，细胞种植密度对间充质干细胞增殖及成骨诱导分化影响。 设计：重复测量设计。 单位：解放军第三军医大学细胞培养室和检测分析室。 对象：实验于2003-01／2004-03在解放军第三军医大学的创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室完成。从5例男性健康志愿者髂骨骨髓中分离扩增的干细胞。 方法：将第2代间充质干细胞以8&;#215;10^3／cm^2，3&;#215;10^3／cm^2，8&;#215;10^2／cm^2密度接种。分析其生长曲线，并扩增培养18d，记录细胞扩增数量，再分析扩增后细胞的生长曲线和成骨诱导能力。 主要观察指标：①不同种植密度下细胞生长曲线。②碱性磷酸酶染色和骨钙素的免疫组化染色结果。 结果：人骨髓间充质干细胞阴性表达碱性磷酸酶、CD34；在8&;#215;10^3／cm^2种植密度下，细胞倍增时间40h，18d后细胞数量扩增（51&;#177;13）倍；在3&;#215;10^3／cm^2种植密度下，细胞扩增（28&;#177;6）倍；在8&;#215;10^2／cm^2种植密度下，细胞总数仅增加（5&;#177;3）倍。在低密度下获得的细胞增殖能力强于高密度组，两组细胞均具有成骨诱导能力。 结论：种植密度对间充质干细胞增殖有明显影响，快速扩增间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞，宜选择8&;#215;10^3／cm^2种植密度。     

培养条件对CD34~+细胞体外诱导分化和扩增红细胞的影响

目的观察培养基以及细胞接种密度对体外诱导CD34+细胞向红细胞增殖和分化的影响。方法将脐血来源的CD34+细胞用无血清培养基或含10%胎牛血清(FCS)的IMDM培养基培养(6孔培养板,3ml/孔),添加的细胞因子为100ng/ml干细胞因子(SCF)、5ng/ml白细胞介素3(IL-3)、3IU/ml促红细胞生成素(EPO),细胞初始接种密度为104/ml或105/ml,并通过间充质干细胞(MSC)的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化。结果培养23d后,无血清培养基组细胞扩增倍数达到2.54×105倍,其中红系细胞>95%,而IMDM/5%FCS组的最大扩增倍数只有1.84×104倍,其中的红系细胞约占40%。培养8d后初始接种密度为104/ml的CD34+细胞增殖(420±40)倍,而105/ml的CD34+细胞增殖(162±45)倍。结论CD34+细胞在无血清培养基中的扩增倍数以及最终诱导出的红细胞,都明显高于在IMDM/10%FCS培养基中所占比例,104/ml的CD34+细胞接种密度比105/ml更有利于细胞的扩增。     

脐血细胞在搅拌悬浮生物反应器中的生长特性

目的：了解脐血细胞在搅拌悬浮生物反应器中的生长特性，为开发搅拌悬浮生物反应器大规模生产造血细胞提供实验依据。 方法：实验于2003-06／1l在华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室动物细胞与组织工程研究室完成。脐血细胞在基本细胞因子组合干细胞因子＋白细胞介素3＋白细胞介素6的刺激作用下，考察其在静态和动态培养系统中的生长规律，搅拌转速（30，60r／min）对脐血细胞细胞周期分布和凋亡的影响以及不同形状搅拌桨（平翼桨、搅拌棒）对脐血细胞生长的影响。 结果：①总细胞的扩增：随着细胞逐步适应体外生存环境，总细胞开始表现出增殖的趋势，且转瓶扩增效果略好于孔板，但差异不显著。②CD34^＋细胞的扩增：在相同细胞因子组合的培养条件下，动态培养在短期培养（1周左右）过程中表现出了明显的增殖优势，而静态培养更有利于维持造血干／祖细胞状态。③总集落形成细胞的扩增：在短期培养中动态培养系统具有明显的生长优势，随着培养时间的延长，静态培养对总集落形成细胞的维持作用优于动态培养。④不同搅拌转速对脐血细胞细胞周期分布和凋亡的影响：相对于静态培养，CD34^＋细胞除了G2期含量显著增加外，对其他细胞周期和凋亡无显著影响，随着搅拌转速从30r／min提高到60r／min时，CD34^＋细胞周期分布和凋亡差异不明显。而细胞周期分布和凋亡比率在静态培养和60r／min的转瓶培养情况下更为相似，表明流体作用力的增强对CD34^＋细胞的生长行为没有影响。⑤不同搅拌桨形状对造血细胞培养的影响：相同搅拌转速（30r／min）下培养来源相同的脐血细胞，1周后平翼桨转瓶中的单个核细胞数锐减，而搅拌棒转瓶却能保持基本不变，且差异显著（P〈0．05）。说明不同搅拌桨形式导致混合方式的差异以及由此产生的不同流体作用力等对造血细胞增殖造成某种程度的影响。 结论：动态培养能支持脐血细胞的生长，且造血干／祖细胞的增殖优于静态培养。搅拌转速的增加对脐血细胞细胞周期分布和凋亡无显著影响，而不同的搅拌形式与脐血细胞的增殖有关。     

包被抗人CD3单克隆抗体对CIK细胞生长影响的研究

目的 通过对比包被和未包被抗人CD3单克隆抗体培养瓶中的杀伤细胞(CIK细胞)生长状态及培养一段时间后收集的细胞数,研究在临床常用培养CIK细胞的方法上,后续增加对培养瓶进行包被抗人CD3单克隆抗体的预处理后,对CIK细胞生长的影响.方法 提取健康者的外周血单个核细胞(PBMC),无血清培养液调整好细胞浓度,在75 cm2密封盖培养瓶中等量加入包被和未包被抗人CD3抗体,以及IFN-γ.培养24 h后加入CIK混合刺激因子,以后每天观察细胞的生长情况,根据细胞的生长情况进行传代扩增(扩增至未包被的培养瓶中),第12天收集细胞进行比较.结果 包被抗人CD3抗体的75 cm2密封盖培养瓶培养的CIK细胞,在培养第3天即可进行传代扩增,以后每天都可进行扩增;用未包被抗人CD3抗体75 cm2密封盖培养瓶培养的CIK细胞在第5天才可进行传代扩增,以后每隔1 d可以进行扩增,第12天收集的细胞总数未包被的为1.2×109,包被的为3.3×109.结论 包被细胞因子抗人CD3单克隆抗体对正常条件培养的CIK细胞生长状态和较短时间内收获的CIK细胞总量有很好的正影响.     

微载体cytodex3培养技术在大量扩增成人骨髓间充质干细胞中的应用

背景:间充质干细胞可以在体内或体外分化成肝样细胞,但是间充质干细胞数量少,在1 x 104-1×105个骨髓有核细胞中仅有个,肝细胞移植和生物人工肝的治疗都需要1×1010级的细胞数,利用常规的单层培养方法难以实现.目的:建立一种体外分离、大量扩增培养成人骨髓间充质干细胞的方法.设计、时间及地点:随机对照实验.实验于2005-09/2006-04在卜海市消化外科研究所(上海市教委重点实验室)及上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科和器官移植中心完成.材料:骨髓标本收集于上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科骨髓检查正常者,供者均为知情同意志愿者.方法:采用Percoll梯度离心结合贴壁法分离人骨髓间充质干细胞.应用微载体cytodex3培养人骨髓间允质干细胞,以普通单层聚苯乙烯(TCPS)培养作对照,用流式细胞仪(FCM)和MTT法对其细胞表型和增殖活性进行检测.主要观察指标:①hMSCs的分离及培养.②hMSCs的肜态学观察.③hMSCs在 cytodex 3表面生长时的增殖活性测定.④hMSCs在cytodex 3表面生长时FCM细胞周期测定.结果:①流式细胞仪检测表明,微载体cytodex3表面生长的人骨髓间充质干细胞表面标记与普通单层聚苯乙烯培养时一致,表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、VLA-1和HLA-DR.②MTT检测显示,人骨髓间充质干细胞第1-3天处于适应期,3 d后进入对数生长期,人骨髓间充质干细胞此期间在TCPS和cytodex3表面的增殖活性无差异(P＞0.05),而存普通单层聚苯厶烯表面培养时,人骨髓间充质干细胞6 d后进入衰退期,而cytodex3表面生长第9天时仍然处于对数生长,差异显著(P＜0.05).③流式细胞仪分析表明,人骨髓间充质干细胞在TCPS和cytodex3表面培养细胞周期分布相同,差异不显著(P＞0.05).结论:微载体cvtodex3培养技术可以很好地大量扩增人骨髓间充质干细胞,并能保持其良好的增殖活性.     

人脐血非造血干细胞的基本特性

目的：通过对体外培养人脐血来源非造血干细胞生长特性的观察和对细胞免疫表型的检测，探讨人脐血来源非造血干细胞的一般特性，为进一步研究人脐血来源非造血干细胞提供依据。 方法：实验于2005-01／10在首都医科大学北京神经科学研究所和首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。脐带血由首都医科大学附属天坛医院提供，经密度梯度离心法分离新鲜脐带血，获取的单个核细胞进行培养。①倒置显微镜下观察细胞形态。②培养基中加入白血病抑制因子或用Mescencult间充质干细胞培养基进行培养，记录细胞生长状况。③流式细胞术分析脐血单个核细胞的免疫表型。 结果：①人脐血非造血千细胞形态观察：较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞，而以5&;#215;10^6细胞密度接种则在48-72h后出现贴壁的梭形细胞：培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。②生长特性：人脐血非造血干细胞接种5d后增殖速度加快，随后的几天内保持较快的增殖速度，15d后进入平台期。高糖DMEM培养基＋胎牛血清和高糖DMEM培养基＋胎牛血清＋白血病抑制因子，两种培养体系在细胞增殖上未显示差异，白血病抑制因子并没有显著改善人脐血非造血干细胞生长增殖速度。③免疫表型：新鲜脐血经分离得到的单个核细胞中有少量CD34阳性细胞，CD90，CD166阳性细胞比例分别为（24．18&;#177;5．46）％和（36．44&;#177;6．26）％；人脐血非造血干细胞体外培养10d左右无CD34阳性细胞，CDl66阳性细胞的比例达（76．48&;#177;4．54场，较单个核细胞中CDl66阳性细胞比例明显增高，并且表达HLA-ABC，而少量表达HLA-DR。 结论：合适的细胞接种密度有利于人脐血非造血干细胞贴壁生长。白血病抑制因子并不能增加体外培养的人脐血非造血干细胞的生长增殖速度。人脐血非造血干细胞体外培养10d左右可以获得纯度较高的CD166阳性细胞．     

脐血CD133^＋细胞体外扩增巨核系祖细胞的研究

本研究探讨脐血CD133^＋（UCB—CD133^＋）细胞体外扩增巨核系祖细胞的能力和最佳收获时间。采用免疫磁珠激活细胞分选系统（MACS）分选UCB—CD133^＋细胞，将纯化的UCB—CD133^＋细胞接种于含TPO、IL-3和SCF的无血清液体培养体系中体外扩增巨核系祖细胞，在培养第7、10和14天进行细胞计数，流式细胞仪检测扩增过程中CD133、CD34、CD41抗原表达的动态变化，并采用半固体法对不同扩增阶段的细胞进行巨核祖细胞集落形成单位（CFU—MK）培养。结果表明：培养至第7天时，UCB—CD133^＋细胞扩增效果最佳，扩增了8、2-1-2．2倍；培养至第14天，细胞总数扩增了116倍；培养至10天时，平均1个CD133^＋细胞所产生的CD133^＋CD41^＋和CD34^＋CD41^＋细胞数最多，分剐为2．5±0．9和2．6±0.5个，所产生的CD41^＋细胞为20．3±5、9个；扩增前后的UCB—CD133^＋细胞均能形成CFU—MK，扩增第10天的UCB—CD133^＋细胞所形成的CFU—MK总数最多，CFU—MK扩增倍数为59．5±11．8倍。巨核细胞免疫组织化学染色显示，扩增后的巨核系细胞多呈幼稚状态，未见血小板形成。结论：UCB—CD133^＋细胞具有较强的体外扩增巨核系祖细胞的能力，培养第10天扩增效能最佳。     

犬骨髓源血管内皮祖细胞体外扩增效能的动态研究

目的：应用离体培养法培养骨髓来源的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)并动态观察扩增效能。方法：2004-04／12在首都医科大学宣武医院外科实验室完成。使用条件培养基和纤维连接蛋白培养骨髓单个核细胞，相差显微镜观察形态变化，测量生长曲线观察增殖能力，检测摄取Dil-ac—LDL的功能，不同时间点行flk-1，CD133和Ⅷ因子的免疫细胞化学检测和CD34，VEGFR-2及CD133的流式细胞仪检测以定性并观察扩增效率。结果：集落样生长的贴壁细胞平均10d汇合，每毫升骨髓可获得大约(1．3&;#177;0．3)&;#215;106个细胞，外观鹅卵石样，能摄取Dil-ac-LDL，flk-1，CD133和Ⅷ因子，免疫细胞化学染色均呈阳性，流式细胞仪示VEGFR-2和CD133双阳性细胞扩增达33倍。结论：离体扩增培养法可成功地从骨髓中扩增EPCs，扩增效率能够满足组织工程血管对种子细胞的需要，也为骨髓单个核细胞移植治疗组织缺血提供了间接证据。     

微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞及鉴定

微载体培养系统中，种子细胞在培养皿或生物反应器内悬浮的微载体表面上生长，能够在一定时间内收获大量种子细胞，可将种子细胞一微载体复合体直接植入病损部位，而不用依靠支架系统。微载体可以为同源的单层细胞的生长扩增提供足够的空间，同时能节省大量昂贵的生长因子和培养液。利用微载体生物反应器培养系统还可以较容易的进行氧气浓度和物理化学环境的调控，并监控环境中的pH值、氧饱和度、营养成分等，以得到细胞增殖和分化所需的特定环境。在培养过程中可以定期取出少量细胞进行分析而不必浪费其他的细胞。     

人参总皂甙及单体对脐血CD 34+细胞体外扩增的影响

目的 探讨人参总甙、人参皂甙单体对脐血CD34 细胞体外扩增的影响。方法 用Stem Span ^TM sFEM无血清液体培养基加入不同浓度的人参总皂甙(GS)、人参皂甙单体(Hgl、Rbl)，进行液体扩增，计数总细胞敷并检测CD34 细胞。收获扩增后的细胞用MethoCult^TM H4．435半固体培养基培养，计数CFU-E、BFU-E、CFU-GM集落。结果 GS、Rgl、Rbl具有刺激CD34 细胞液体培养的作用。GS的最佳浓度是50mg／L，Rgl最佳浓度是5mg／L，Rbl最佳浓度是5m/L。细胞总数分别扩增20．4、24．5、2，4．1倍，CD34 细胞数分别扩增4．22、5．19、4．12倍。在液体培养后仍可刺激扩增后脐血细胞集落形成，CFU-E集落形成能力分别比对照组高90．1％、70．8％、72．8％；BFU-E集落形成能力分别比对照组高53．4％、68．0％、67．0％；CFU-GM集落形成能力分别比对照组高67．0％、29．8％、39．4％；结论 人参总甙、人参皂甙单体能促进造血干／祖细胞增殖，并且能诱导定向分化，具有类似生长因子和协同生长因子作用。     

猪膀胱移行上皮细胞培养及其在纤维蛋白凝胶表面生长的评价

目的：探讨猪正常尿路上皮细胞分离、培养、扩增技术；观察利用纤维蛋白胶作为组织工程支架的可行性。 方法：实验于2005-04／07在广东省人民医院医学研究中心完成。①采用酶消化法及无血清培养系统体外原代培养膀胱移行上皮细胞。②将体外扩增的膀胱上皮细胞以相同密度分别接种于普通培养板（对照组）和纤维蛋白凝胶包被的培养板（实验组），于接种后4d比较两组细胞克隆形成情况。③再将膀胱移行上皮细胞接种于纤维蛋白凝胶包被的培养板，在不同融合度（70％，100％）时将细胞消化传代，以相同的密度再次接种于纤维蛋白包被的培养板，比较生长于纤维蛋白凝胶表面的、不同融合度的细胞传代后的克隆形成情况。④取对数生长期膀胱移行上皮细胞，以相同密度接种于96孔板，以含不同浓度抑肽酶（0，37．5，75，150，300klU／mL）的keratinocyte-SFM培养，4d后以四甲基偶氮唑盐法观察比较移行上皮细胞生长情况（不含抑肽酶者为对照组）。 结果：①移行上皮细胞生长良好，多次传代后仍扩增迅速。②膀胱移行上皮细胞在培养板和纤维蛋白凝胶表面均生长良好。4d后细胞克隆形成率在纤维蛋白凝胶表面和培普通培养板无明显差异[（8．67&;#177;1．45）％，（9．33&;#177;1．76）％，P〉0．05]。③生长于纤维蛋白凝胶表面的细胞传代后仍有较强的增殖能力，且70％融合组传代细胞克隆形成率显著高于100％组[（18．2&;#177;1．08）％，（12．8&;#177;1．35）％，P〈0．05]。④抑肽酶在300klU／mL时对细胞生长有显著抑制作用；而在其他浓度时则不明显。 结论：①该法培养猪膀胱上皮细胞迅速可靠，多次传代后仍有较强的增殖能力。②细胞在纤维蛋白凝胶表面生长良好，传代后仍然有较强的增殖能力。③纤维蛋白凝胶具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。