应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(core promoter)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体表面展示技术,以HBV核心启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 噬菌体经富集后,从随机筛选的20个克隆中得到6个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白——羧肽酶N(CPN)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV核心启动子的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV的复制机制创造了新的途径。     

噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X抗原基因启动子DNA结合蛋白

目的筛选乙型肝炎病毒（HBV）X抗原基因启动子（Xp）DNA结合蛋白，为HBV复制机制研究探索新的途径。方法应用噬菌体展示技术，以HBV-Xp的PCR产物DNA作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，经噬斑的PCR扩增后，构建克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果噬菌体经富集后，从随机筛选的30个克隆中得到17个阳性克隆，成功构建了克隆载体。经测序分析及序列比对，最后得到5种已知基因编码蛋白（人血白蛋白、还原型烟酰胺二核甘酸脱氢酶亚型4、激肽酶原、泛素特异性蛋白酶10、睾丸增强因子转录子）和9种未知功能基因序列。结论从噬菌体人肝cDNA文库筛选得到多种具有不同生物学功能的蛋白，与HBVX抗原基因启动子具有结合作用。     

应用噬菌体展示技术筛选细胞周期素B2启动子DNA的结合蛋白

目的筛选细胞周期素B2（cyclin B2）启动子DNA结合蛋白,探索cyclin B2的表达调节机制.方法应用噬菌体展示技术,以cyclin B2启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索.结果噬菌体经富集后,筛选出20个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和cyclin B2启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白.结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到cyclin B2启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究cyclin B2基因的转录调节机制奠定了基础.     

噬菌体展示技术筛选诱导型NOS基因启动子DNA结合蛋白的研究

目的筛选诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子DNA结合蛋白。探索iNOS基因的表达调控机制。方法应用生物信息学方法确定iNOS基因启动子序列，以PCR扩增iNOS基因启动子DNA片段，构建真核报告载体pcAT3-iNOSp，并转染HepG2细胞系，用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性以明确所得到的DNA片段具有启动子活性；以iNOS基因启动子片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附一洗脱一扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，进行【)NA序列分析和蛋白质同源性生物信息学搜索。结果pCAT3-iNOSp瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的4．2倍，说明所得到的DNA片段具有启动子活性；噬菌体经富集后，筛选出12个阳性克隆，成功获得了iNOS基因启动子的DNA结合蛋白编码序列。结论所构建的iNOS基因启动子具有顺式激活下游基因表达的作用；筛选得到的iNOS启动子DNA结合蛋白对于研究iNOS基因的转录调节机制具有重要意义。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A结合蛋白

目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白,为HCV致病机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术,以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子,对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后,从随机挑选的12个克隆中得到2个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过序列同源性分析,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶5(MAPKAPK5)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白,为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础。     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

目的：克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法：以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据，设计并合成D123／D61和D81／D84两对引物，同时从猪肝中提取猪基因组DNA，并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针，对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选，从噬菌体文库中共获得4个基因片段，并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因，对猪血清白蛋白启动子在Hep(泛细胞中的表达进行研究。结果：共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号：AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对，发现基因的同源性为53.8％，其中编码区同源性为82．3％。荧光显微镜下可见EGFP在HepC2细胞中的表达。结论：获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepC2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础，另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5''''端调控序列功能分析

目的克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析.方法以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84 两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选.经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接.以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究.结果共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35 kb(GenBank登录号AY663543).将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%.荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达.结论获得猪血清白蛋白全基因.猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能.此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料.     

基孔肯雅病毒中和表位的筛选及表达

目的:寻找基孔肯雅病毒中和表位,并将其表达为重组融合蛋白.方法:对噬菌体展示12肽库进行了生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆,使用 ELISA方法筛选并鉴定阳性克隆,分析阳性克隆的DNA序列,将其翻译成氨基酸序列进行同源性比较.将其中一个表位连同M13噬菌体PⅢ蛋白结构域Ⅰ～Ⅱ的编码序列用PCR技术扩增后插入原核表达载体pQE30,用IPTG诱导融合蛋白表达.结果与结论:从经过3轮淘洗的噬菌体中随机挑选123个克隆,从中筛选到20个阳性克隆,其中包含7种不同的氨基酸序列,这些序列缺乏同源性,表明该单抗表位应为构象型表位.在室温培养条件下成功地在大肠杆菌周质腔表达了一种可溶性的表位融合蛋白,经亲和层析得到了纯化的表位融合蛋白.     

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前-S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号：AF384371)作为模板,应用PCR扩增前-S1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 前-S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。     

LRP16基因启动子的克隆及荧光素酶报道重组子的构建

目的：克隆LRP16基因启动子及构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。方法：（1）以LRP16基因全长作为探针，在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载LRP16基因5′端3kb基因组DNA序列。（2）以健康献血员基因组DNA为模板进行PCR扩增目的片段，将分离纯化的PCR产物用T4DNA连接酶与pGEM-T Easy载体相连，转入JM109感受态化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序，进行Kpn I和BamH I双酶切和巢式PCR鉴定。（3）将LRP16启动子－pGEM-T Easy载体再次酶切，纯化回收鉴定过的目的DNA片段，构建LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。结果与结论：长度为2．7kb的LRP16基因启动子克隆成功，并构建了LRP16基因启动子－pGL3-Basic载体。充分利用因特网上人类基因组数据库的生物信息资源，搜索已知基因的启动子序列，可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定

目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR) 164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)前s1蛋白为靶蛋白,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前s1蛋白具有结合作用的蛋白序列,命名为前s1结合蛋白(PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因2(GLTSCR2),cDNA长为1436核苷酸,基因位于第19号染色体长臂13.3区(19q13.3),长度11445碱基对(bp),位于19号染色体10403483～10414989,PreS1BP基因含有13个外显子,具有12个内含子。结论 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBV PreS1BP基因。     

用T7噬菌体展示系统筛选与晚期糖基化终产物受体胞内段相结合的蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选在细胞内与晚期糖基化终产物受体(RAGE)结合的蛋白。方法 以重组RAGE为靶蛋白,用谷胱甘肽亲和树脂为介质,筛选T7人肺cDNA文库。结果 筛选6轮后选择64个噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片段,回收PCR产物并进行测序,将所得到的序列用BLAST软件搜索GenBank中的同源序列,得到了25个编码蛋白的序列。结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选新的结合蛋白的一种简单、快速和有效的手段,所筛选的与RAGE胞内段相互作用的蛋白对进一步研究其信号转导通路的复杂功能和调节机制提供了很好的靶点。     

肝细胞内与HBeAg结合的新蛋白编码基因E-36的筛选与克隆

目的　探讨HBeAg在乙型肝炎病毒 (HBV)致病过程中所起的作用。方法　利用酵母双杂交系统 3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因。将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,双重筛选阳性菌落 ,提取质粒并测序。结果　通过行生物信息学分析 ,发现其中有 1个未知基因 ,命名为E 36。结论　根据GenBank中的序列信息设计引物 ,从HepG2细胞中扩增出E 36新基因的完整序列并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中 ,并用体外免疫共沉淀方法再次验证了HBeAg与E 36新蛋白之间有结合作用 ,为HBeAg的功能研究提供了新线索。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

人ID4基因启动子及上游顺式表达调控元件的克隆及特征分析

目的克隆人ID4基因启动子及上游顺式调控元件,并对其结构及调控元件的特征进行生物信息学分析。方法从NCBI人类基因组数据库中截取ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列。利用TESS和Genomax等在线分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析。设计PCR引物,采用分段扩增法,获得长度分别为1811bp和650bp的两条产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆。先后应用KpnⅠ/NheⅠ、KpnⅠ/EcoRⅠ对获得的两个pGEM-T重组载体及pGL3Basic荧光素酶报告载体进行双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至Top10感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,最后测序鉴定。结果获得长度为2461bp的ID4基因启动子DNA序列,经测序证实与人类基因组序列一致。ID4基因具有Ⅱ型启动子特征,有2个非常显著的上游元件(TATA盒和GC盒),GC含量占总碱基含量的65.9%。在转录起始位点上游-1000bp与下游212bp之间分别存在多个可能具有正向和负向调控作用的顺式元件。结论成功克隆了人ID4基因启动子及其顺式调控元件,并...     

PCR结合地高辛标记探针杂交检验乙型肝炎病毒C基因启动子

应用聚合酶链式反应结合地高辛标记探针杂交方法检测乙型肝炎病毒C基因启动(HBV,CP)。对聚合酶链反应(PCR)法扩增的HBV DNA直接测序进行DNA同源性分析。并运用探针杂交对结果进行进一步鉴定;应用PCR法扩增20份患者血清,阳性率达95％(19/20),同时运用探针杂交进行进一步检验,与PCR结果符合率达90％以上,并选择中度、重度乙肝患者血清和pGEM,7Z—HBV质粒扩增的HBV.CP各一份分别进行测序,与报告基因的同源性分别为72％、66.5％、90％。建立了特异敏感的检测乙型肝炎病毒C基因启动子(HBV.CP)的PCR方法,可用于HBV基因变异规律的研究。同时初步的研究结果表明,肝炎病人的HBV.CP区存在较多的变异,可能与病情轻重有一定的相关性。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。