Mago nashi：—个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的运用免疫学方法筛选日本血吸虫(中国大陆株)童虫cDNA文库，寻找血吸虫新基因，并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Mago nashi样蛋白基因。方法用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫eDNA文库，随机挑取阳性重组克隆进行测序，以获得血吸虫基因，并通过BLAST程序进行比较及同源性分析，根据分析结果设计合成引物，用PCR法扩增出日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因(SiM)编码序列，将其克隆入pGEM—T载体和pBKCMV载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果本研究共挑取7个阳性克隆，通过测序获得了5个有表达序列标签(Expressed Sequenee Tag.EST)价值的序列，并进行了同源性分析；用PCR法扩增出大小为441bp SjM开放阅读框，重组质粒pGEM—SiM和pBKCMV-SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。结论本实验获得了5个有EST价值的序列，并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA文库的构建及初步筛选

目的建立日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA(SST-cDNA)文库,筛选日本血吸虫病潜在的疫苗候选分子。方法抽提日本血吸虫童虫mRNA,并转录合成cDNA。将纯化的cDNA插入到载体pAPtag2中,构建SST-cDNA文库。将cDNA文库质粒转染到COS7细胞中进行蛋白表达,通过检测转染细胞中胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的活性来判定插入的血吸虫童虫cDNA片段中是否带有信号序列。测定阳性克隆中外源性cDNA的核苷酸序,并通过Blast与Gen-Bank、EST数据库进行比对确定其性质。采用快速扩增cDNA未端序列方法获得基因的全长cDNA序列。用SignalP3.0、TMPred、TargetP服务器对带有信号序列基因的特征进行分析和预测。结果日本血吸虫童虫cDNA被插入到真核表达载体pAPtag2中,成功构建日本血吸虫童虫SST-cDNA文库。限制性内切酶分析表明SST-cDNA文库的容量为5×106cfu。SST-cDNA文库质粒转染到COS7细胞中后,通过近缘筛选获得21个带有信号肽cDNA序列,其中4个为未知新基因序列,5个为已知功能基因,12个与血吸虫EST序列同源。获得了8个基因的全长cDNA序列,演绎氨基酸序列特征分析表明,其中5个为膜结合蛋白基因,3个为外分泌蛋白基因。结论本研究成功构建了日本血吸虫童虫SST-cDNA文库,初步筛选获得了8个带信号肽的外分泌或膜结合蛋白分子基因。     

日本血吸虫(中国大陆株)成虫表达序列标签的获取及新基因的发现

目的运用表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)技术快速、经济地发现日本血吸虫(中国大陆株)新基因.方法随机挑取日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GenBank数据库进行比较及同源性分析.结果本研究共随机挑取日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA 文库单个重组克隆200个,获得了76个有EST价值的序列,其中7.9%为日本血吸虫已知序列,5.3%为日本血吸虫同源序列.曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的22.4%,未知序列占59.2% .在获得的76个有EST价值的序列中,66个成功在GenBank dbEST中登录.通过同源性分析,发现了一些令人感兴趣的基因.结论 EST方法有助于快速、经济地发现日本血吸虫(中国大陆株)成虫新基因.     

日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达序列标签的获取及新基因的发现

运用表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST）技术快速、经济地发现日本血吸虫（中国大陆株）新基因。方法 随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GenBank数据库进行比较及同源性分析。结果 本研究共随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆200个,获得了76个有EST价值的序列,其中7.9%为日本血吸虫已知序列,5.3%为日本血吸虫同源序列。曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的22.4%,未知序列占59.2%。在获得的76个有EST价值的序列中,66个成功在GenBank dbEST中登录。通过同源性分析,发现了一些令人感兴趣的基因。结论 EST方法有助于快速、经济地发现日本血吸虫（中国大陆株）成虫新基因。     

日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析

目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA ,为进一步的功能研究打下了基础     

日本血吸虫149个表达序列标签和18个全长cDNA的获取和分析

目的从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列，为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，将获取的表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）登录GenBank；对某些感兴趣的序列进行步移法测序获取全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果随机挑取382 个阳性克隆进行测序，获得149个EST，同源性比较发现，部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。共获取18个日本血吸虫全长cDNA，大部分为管家基因，其中部分可作为日本血吸虫的候选疫苗分析和药物靶点。结论EST技术有助于快速、经济地获取日本血吸虫表达序列。     

日本血吸虫鸟氨酸转氨酶基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因鸟氨酸转氨酶。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pc-gene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果获得了1个日本血吸虫新基因鸟氨酸转氨酶基因(GenBank登录号AY336497)。该cDNA序列长1677bp,编码424个氨基酸,与Xenopuslaevis鸟氨酸转氨酶同源性为66%;编码蛋白的理论等电点为8.52;抗原表位可能位于cDNA序列795～846处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因与Xenopuslaevis鸟氨酸转氨酶基因同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。     

日本血吸虫肌动蛋白轻链基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因,为寻找日本血吸虫新的候选疫苗奠定基础。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果发现xzw00081克隆的cDNA序列为日本血吸虫新基因并获得GenBank登录号(AY225851)。该cDNA序列与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,核苷酸水平的同源性为84%;氨基酸水平的同源性为86%;编码蛋白的理论相对分子质量为1053888,等电点为696;抗原表位可能位于氨基酸序列158～184处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因长374bp,编码88个氨基酸,与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。     

日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因的发现

目的 运用表达序列标签（EST）技术,从日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj)cDNA文库中分离、鉴定出有潜在应用价值的血吸虫基因序列。方法 应用EST方法,从日本血吸虫cDNA文库中随机挑选出单个重组克隆,PCR扩增出插入片段,并进行PCR产物直接测序;将获得的序列资料与EBI和GenBank进行BLASTn和BLASTx同源性检索,对可能的酶类基因序列进行分析。结论 采用EST策略,可获得日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因序列EST,为进一步的cDNA全长坟和克隆奠定基础。     

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的：克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白（SjEP）编码基因，以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法：设计合成引物，分别以日本血吸虫雌、雄成虫cDNA第一链为模板，用PCR法从中扩增出SjEP基因编码序列，将其克隆入pGEM-T载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果：PCR法从雌虫cDNA中扩增出大小为624bp SjEP基因编码序列，重组质粒pGEM-SjEP经双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段，序列测定结果表明具有一个长度为624bp的完整开放阅读框，与日本血吸虫（菲律宾株）虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性（99．9％）。结论：本实验成功地克隆了SjEP编码基因，并进行了序列测定，为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因片段在真核表达载体中的亚克隆

目的将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体 pBKCMV中,以便对其进行核酸疫苗的研究。方法特定寡核苷酸引物的设计和合成,TRIZOL 提取日本血吸虫成虫 RNA,RT-PCR 法扩增 GST 基因编码序列,将扩增产物连接 pGEM-T 克隆载体,再亚克隆到真核表达载体 pBK CMV 中。结果 RT-PCR 法特异性扩增出 SiGST 编码基因片段,其大小约为670bp,经双酶切、PCR 鉴定表明所构建的质粒 pGEM-T-GST 和 pBK CMV-GST中含有目的基因。结论 pBK CMN-GST 重组质粒的成功构建,为进一步表达 GST 及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。     

日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达

目的　克隆和表达日本血吸虫大陆株原肌球蛋白 (tropomyosin ,TM)编码基因。方法　应用RT PCR方法体外扩增日本血吸虫原肌球蛋白编码基因 ,并采用T载体对该PCR产物直接进行克隆并用于核苷酸序列的测定。将目的基因亚克隆入原核表达载体pQE30 ,以IPTG诱导重组原肌球蛋白的表达。结果　PCR扩增产物约 82 3bp ,符合预计大小 ,并成功地克隆入T载体 ,对其中一克隆pGSjcTM12的插入片段的核苷酸序列分析表明 ,该序列和推测的氨基酸序列与曼氏血吸虫原肌球蛋白基因分别有 91 1%和 98 1%的同源性。该编码基因亚克隆入原核表达载体pQE30获得高效表达 ,分子量约 32kDa,并能被日本血吸虫天然原肌球蛋白免疫血清特异识别。结论　日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和原核表达成功。     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。     

日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达

目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因。方法依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物，上游和下游引物分别引入BamH I和Sal I酶切位点。以日本血吸虫大陆株（安徽株，简称Sjc-A）成虫总RNA为模板，反转录PCR (RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因。经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT，转化感受态E．coli BL21，并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcHGPRT/E．coli BL21I程菌用IPTG诱导表达，重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析。结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp，构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段，根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株（湖南株，简称Sjc-H）及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性。获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析，分子量约30 kDa，并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别。结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功，并获得了纯化重组蛋白，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。     

日本血吸虫(中国大陆株)20.2 kDa分子编码基因(Sj20.2)的克隆及序列分析

目的：克隆日本血吸虫中国大陆株20.2kDa分子的编码基因，方法：根据筛选到的日本血吸虫肝期童虫cDNA文库阳性克隆之一的插入片段序列，设计合成1对引物，通过PCR技术对其最大开放阅读框进行扩增，然后克隆人pGEM-T载体，并对克隆产物进行核苷酸序列测定和分析，利用在线软件推测其编码氨基酸的序列，结果：利用PCR方法从上述插入片段中扩增出1条单一的DNA条带，大小介于515bp与697bp之间，将此产物克隆入pGEM-T载体，双酶切和PCR反应结果都出现与前述结果一致的目的片段，核苷酸序列测定结果表明此开放阅读框全长564bp，在线软件分析结果表明，此片段编码187个氨基酸，编码肽段分子量大小约为20．0dDa，结论：本次实验成功扩增和克隆出目的基因片段，为下一步研究奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础