基于红外光谱法的云南重楼及其近缘种的亲缘关系研究

目的傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)结合化学计量学方法分析云南重楼Paris polyphylla var.yunnanensis及其近缘种的亲缘关系,为重楼属药用植物资源的开发利用提供理论依据。方法采集云南重楼、白花重楼Paris polyphylla var.alba、毛重楼Paris mairei、南重楼Paris vietnamensis、五指莲Paris axialis var.axialis共50份样品的红外光谱信息,对光谱数据进行自动基线校正、自动平滑、纵坐标归一化、多元散射校正、二阶求导等预处理,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)及系统聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA)分析光谱数据。结果原始红外光谱中,1 653、1 156、1 082、1 021、925、851、759、572、524 cm~(-1)等为重楼属植物的共有峰,主要归属为黄酮、淀粉和糖苷类成分的吸收峰;毛重楼和五指莲分别在1 535和1 369 cm~(-1)附近有特征吸收峰,可与另外3种重楼属植物相区分。以全波段光谱数据进行PLS-DA和PCA,PLS-DA对重楼属植物分类效果优于PCA,能够准确区分5种野生重楼属植物。系统聚类分析(HCA)及向量夹角余弦相关性分析能够反映5个重楼属植物的亲缘关系,云南重楼与白花重楼和南重楼的亲缘关系较近,与毛重楼和五指莲的关系较远。结论 FTIR结合化学计量学方法,能够快速区分不同种类重楼属植物,明确云南重楼及其近缘种之间的亲缘关系,为重楼属植物亲缘关系研究提供一种快速、有效的方法,同时为重楼种质资源开发和利用提供理论基础。     

基于ATR-FTIR结合化学计量学快速鉴别玉竹和黄精的实验研究

目的:采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱法(ATR-FTIR)和化学计量学对同科同属易混淆药材玉竹和黄精进行鉴别。方法:采用ATR-FTIR获取样本的一级和二级红外指纹图谱,采用PLS-DA构建最佳图谱模型,并采用PCA、HCA等化学计量学对模型图谱基本特征进行分析。结果:玉竹和黄精红外图谱主要由蛋白质、脂类和糖类等吸收带组成,两者光谱相似,但在1200～700cm-1处存在较小差异;在此范围对原图谱进行主成分分析发现,前3个主成分(集中在970cm-1、990cm-1和715cm-1附近))对玉竹和黄精鉴别的正确率可达96. 56%;在此范围对原图谱进行簇类分析发现,玉竹和黄精种内样本均具有一定地域特征性,但不影响整体鉴别效果。结论:采用ATR-FTIR并结合化学计量学可以快速准确鉴别玉竹和黄精,可为同属种植物鉴别提供理论依据。     

基于红外光谱结合化学计量学的青叶胆及其近缘种亲缘关系研究

目的 傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）结合化学计量学分析青叶胆及其同属近缘种的亲缘关系,为青叶胆药用植物资源的开发利用提供理论依据。方法 采集青叶胆及近缘种共39份样品的红外光谱信息,对光谱数据进行自动基线校正、自动平滑、纵坐标归一化、二阶求导等预处理,结合化学计量学分析光谱数据。结果 青叶胆及其近缘种红外光谱主要吸收区域为900~400、1 310~900、1 500~1 310、1 800~1 500、2 800~3 000、3 000~3 500 cm^-1附近。二阶导数图谱在400~1 000 cm^-1指纹区吸收峰差异明显,物种之间吸收峰的峰数、峰强、峰形差异较大。对预处理后的红外光谱数据进行主成分分析（PCA）以及偏最小二乘判别分析（PLS-DA）发现,6种獐牙菜的PCA分析优于PLS-DA分析,系统聚类分析表明青叶胆与圈纹獐牙菜、显脉獐牙菜亲缘关系较近。结论 FTIR结合化学计量学方法,能够快速鉴别不同种类獐牙菜属植物,明确青叶胆及其近缘种之间的亲缘关系,为獐牙菜属植物亲缘关系研究提供一种快速、有效的方法。     

红外光谱结合化学计量学鉴别美洲大蠊及其他虫类药材研究

目的基于红外光谱法结合化学计量学建立美洲大蠊及其他虫类药材(全蝎、水蛭)粉末的鉴别方法,为美洲大蠊的鉴别提供一定的依据。方法运用傅里叶变换红外光谱仪采集3种虫药药粉的红外光谱数据,对已得光谱数据二阶求导后运用纵坐标归一化法、标准化法等预处理方法对光谱进行优化,采用化学计量学,包括系统聚类分析(hierarchicalcluster analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)以及偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)进一步对光谱数据进行分析。结果美洲大蠊与全蝎、水蛭的红外指纹图谱有差异。美洲大蠊在1 711、1 410、712 cm-1处吸收峰明显,全蝎在1 753、1 400、1 168、717 cm-1处吸收峰明显,水蛭在1 558、1 457、1 400、669 cm-1处吸收峰明显,且水蛭在1 753～1 711cm-1处明显无吸收峰。3种虫类药材在1 800～1 700 cm-1处峰形差异明显较大。二阶导数图谱中,主要峰的位置相同,但共有峰的强度不同。运用HCA分析方法发现3种虫类药材能够被快速区分,运用PCA与PLS-DA分析方法发现3种虫类药材分布在不同区域。结论本研究能够简便、快速的鉴别美洲大蠊与全蝎、水蛭等虫类药材,为美洲大蠊的质量控制及评价提供参考。     

红外光谱结合判别分析对滇重楼生长年限的鉴别

目的: 建立滇重楼生长年限的鉴别方法,为滇重楼的质量控制提供参考。 方法: 利用傅里叶变换红外光谱技术测试了同一产地7种不同生长年限的68株重楼主根木质部和表皮样品的红外光谱,利用Omnic8.0软件计算样品的二阶导数光谱和四阶导数光谱,分别以主根木质部和表皮在1 800~900 cm^-1的红外光谱、二阶导数红外光谱和四阶导数红外光谱数据为样品特征,采用Mahalanbis距离逐步判别分析法,依据Fisher线性判别准则建立重楼生长年限的判别模型,对未知生长年限的样品进行鉴别比较。 结果: 四阶导数光谱比其他级别的光谱鉴别效果好,表皮光谱比木质部光谱的鉴别效果好;利用表皮的四阶导数光谱数据建立判别分析模型对重楼的生长年限进行鉴别时,训练样本回判正确率100%,测试样本预测正确率78.6%,总正确率95.6%。 结论: 傅里叶变换红外光谱结合逐步判别分析法可鉴别重楼的生长年限,为生产实践中预测重楼的生长年限提供了一种新思路。     

红外光谱结合化学计量学对栽培滇重楼的产地鉴别研究

目的 比较滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis不同生长年限不同产地红外光谱特征,建立产地鉴别模型。方法 收集13个产地3～8年生栽培滇重楼样品,共计841株个体;通过衰减全反射-傅里叶变换红外光谱仪(attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectra,ATR-FTIR)采集样品红外光谱;结合多元散射校正(multiplicative scattering correction,MSC)、一阶导数(first derivative,FD)、二阶导数(second derivative,SD)和三阶导数(third derivative,TD)筛选最佳光谱预处理方式;利用偏最小二乘判别模型(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)鉴别相同生长年限不同产地的样品。结果 三阶导数与多元散射校正结合是对3年生和5～8年生样品进行产地鉴别的最佳光谱预处理方式;二阶导数与多元散射校正结合是鉴别4年生不同产地样品最佳光谱预处理方...     

武当山区重楼属植物基于ITS2的种内鉴别研究

目的对武当山区重楼属植物进行种内分子鉴定研究,以DNA条形码技术解决重楼因种内形态差异小而难以鉴别的问题,规范重楼的正品来源,确保本地药材的质量以及临床用药的有效性。方法对ITS(internal transcribed spacers)序列进行克隆测序,以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR(polymerase chain reaction)扩增并双向测序,所得序列经Codon Code Aligner拼接后,用软件MEGA6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0)进行相关数据分析,并构建NJ邻接树(neighbor-joining tree),利用Keller等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2的二级结构。结果经BLAST鉴定,采集的武当山区重楼样本来源准确;武当山区重楼属植物ITS2序列长度均为232 bp,与七叶一枝花的基因序列相比,球药隔重楼有16个变异位点,华重楼只有1个变异位点;武当山区重楼的ITS2序列种内K2P(Kimura-2-parameter)距离为0~0.073 6,种内平均K2P距离为0.027 2;由所构建的系统聚类树可以看出,本地区重楼主要分为七叶一枝花和球药隔重楼2大类,华重楼为七叶一枝花的变种,宽叶重楼、狭叶重楼与七叶一枝花为一支,不支持宽叶重楼、狭叶重楼成为独立的变种;比较ITS2二级结构发现,武当山区重楼属植物螺旋区的茎环数目、大小、位置有明显差异。结论 DNA条形码为重楼属药用植物鉴别开辟一条新途径,不论是相似性搜索法、最近距离法还是NJ系统发育树等方法,其分析结果均充分表明,ITS2序列可将不同品种重楼药材很好地区分开;七叶一枝花、狭叶重楼、宽叶重楼的ITS2基因232个碱基序列完全相同,MEGA 6.0的分析结果也表明宽叶重楼、狭叶重楼与七叶一枝花属于一支,不支持宽叶重楼、狭叶重楼成为独立的变种,建议作为七叶一枝花的变型处理;ITS2作为DNA条形码序列能够有效地区别重楼属植物,在中药材的鉴定中具有重要的应用前景,在实现规范化种植规程中可用于种质种源的正确鉴定。     

多叶重楼与云南重楼中4种重楼皂苷的积累差异

目的考察多叶重楼Paris polyphylla Smith var.polyphylla与云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的积累差异。方法 HPLC法测定多叶重楼根、叶、茎中4种重楼皂苷含有量,建立20批样品的指纹图谱,聚类分析对2种植物不同部位中各重楼皂苷的积累差异进行评价。结果不同居群多叶重楼中各重楼皂苷含有量及其总量均有显著差异(P0.05,P0.01)。根中未检测到重楼皂苷Ⅵ,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ平均含有量最高;叶中重楼皂苷Ⅶ平均含有量和总含有量最高;茎中仅检测到重楼皂苷Ⅶ,总含有量最低。多叶重楼和云南重楼根的相似度较高,叶和茎较低。根据不同部位重楼皂苷总含有量,样品可分为3类。结论可考虑将多叶重楼作为云南重楼的替代品。     

红外光谱结合化学计量学鉴别獐牙菜属植物

目的:采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合化学计量学实现獐牙菜属植物快速、准确鉴别。方法:采集川东獐牙菜、青叶胆、紫红獐牙菜、狭叶獐牙菜和西南獐牙菜不同部位(根、茎、叶) 543份样品红外光谱信息,原始数据经标准正态变量(SNV),多元散射校正(MSC),平滑(SG),一阶导数(1D),二阶导数(2D),三阶导数(3D)等处理后删减4 000～3 700,2 799～1 800 cm~(-1)和682～653 cm~(-1)波段,建立偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和支持向量机(SVM)模型。结果:5种獐牙菜属植物相同部位平均光谱较为相似,无法区分,同一物种不同部位光谱特征峰有差异,复杂程度为叶茎根;根、茎和叶3个部位PLS-DA和SVM模型均能准确鉴别5种獐牙菜属植物,且MSC+SG+2D预处理效果最佳。PLS-DA模型R~2Y 0. 8,RMSEP RMSECV,所建模型稳定,效果好,Q~2超过0. 6,预测集正确率达到100%,所有预测集样品分类正确,模型预测能力强。根、茎和叶SVM模型最优惩罚参数c分别为22. 627 4,2和1. 414 2,均在正常范围内,预测集正确率均为100%,分类准确率高。结论:FTIR结合PLS-DA和SVM模型能准确区分不同獐牙菜属植物,模型预测效果好,为其他植物鉴别提供一定的参考依据。     

陕产宽叶重楼的生药学研究

目的:研究陕产宽叶重楼根茎的生药学特征。方法:采用形态组织学鉴别方法,研究原植物形态、生药性状和显微特征,并使用HPLC法测定4种重楼皂苷的总含量。结果:陕产宽叶重楼原植物来源清楚。根茎显微特征:横切面有栓化表皮,皮层宽广、内皮层不连续,中柱为薄壁组织中散布周木式维管束等结构;生药粉末中含极多单粒淀粉,常见草酸钙针晶、环纹和螺纹导管。HPLC法测定重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量达到3%以上。结论:陕产宽叶重楼来源确定、生药性状稳定,具有特定显微结构,重楼皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量均达到了2015版《中华人民共和国药典》标准。该研究阐释了陕西民间将宽叶重楼根茎与药典所载中药重楼同名等效使用的合理性,为制订宽叶重楼质量标准、寻求中药重楼替代资源奠定了基础。     

丛枝菌根真菌对滇重楼内源激素的影响

目的初步探索接种不同外源性丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis幼苗内源激素水平变化规律。方法以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜种子与28种AM真菌共培养后采样,采用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎和须根内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)的量。结果接种外源性AM真菌能提高滇重楼幼苗菌根侵染率和成苗率,AM真菌对滇重楼幼苗根茎和须根中ZR、GA、IAA、ABA 4种激素量的变化表现出不同的规律,但具有偏好性。与对照组相比,整体上接种AM真菌处理组根茎中ZR、GA量呈现增长的趋势,IAA量变化规律不明显,而ABA量呈现减少的趋势,接种AM真菌处理组根茎中ABA/ZR、ABA/GA、ABA/IAA值呈现减少的趋势,但须根与根茎的变化趋势相反。结论 AM真菌能促进滇重楼幼苗的存活率,且不同AM真菌菌株影响滇重楼内源激素量。     

基于生物量和活性成分的滇重楼幼苗优良菌根真菌筛选

目的以菌根生活力、根茎生物量和活性成分为指标,筛选适宜滇重楼幼苗生长发育的优良丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)真菌。方法以灭菌土壤为生长基质,采用室温盆栽试验,研究接种28种外源性AM真菌对滇重楼幼苗菌根生活力、根茎生物量和重楼皂苷产量(单株幼苗所含的重楼皂苷量、重楼皂苷含量与幼苗生物量的乘积)、根茎重楼皂苷与核苷含量的影响。结果接种的28种AM真菌与滇重楼幼苗均形成了共生体系并且发育良好,并能提高滇重楼幼苗菌根生活力,但具有偏好性。大多数AM真菌处理组能提高滇重楼根茎生物量,促进了滇重楼幼苗重楼皂苷和重楼核苷的积累,表现为重楼皂苷含量和产量的提高。菌根形成对滇重楼幼苗次生代谢的影响还表现在重楼皂苷和重楼核苷的器官分配上,菌根化滇重楼幼苗须根中4种重楼皂苷总量具有高于根茎的趋势,而根茎中9种核苷总量明显高于须根。结论本研究中不同AM菌株的表现,对进一步提高滇重楼幼苗生物量和品质的菌株筛选具有重要的借鉴作用,巨大巨孢囊霉Gigasporagigantea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora、沾屑多孢囊霉Diversispora spurca、异配盾孢囊霉Dentiscutata heterogama、沙荒球囊霉Septoglomus deserticola、薄壁两性囊霉Ambispora leptoticha可望能作为培育滇重楼菌根化苗的理想菌株。     

基于SSR分子标记的滇重楼遗传多样性研究

目的研究滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis自然居群的遗传多样性,为滇重楼资源的保护和合理利用提供数据。方法采用SSR分子标记对滇重楼5个不同居群共115份样品进行遗传多样性分析。结果筛选出8对可用SSR引物,多态位点百分率(PPB)为100%,多态信息量(PIC)为0.745 6。在居群水平和物种水平上,观测等位基因数(N_a)分别为8.425 0和17.750 0,有效等位基因数(N_e)分别为4.960 9和7.500 7,观测杂合度(H_o)分别为0.295 5和0.294 8,期望杂合度(H_e)分别为0.654 8和0.774 4,Shannon’s信息指数(I)分别为1.520 1和2.038 6。遗传分化系数(F_(st))为0.172 8,基因流(N_m)为1.196 6。利用UPGMA聚类分析,将5个居群分为2类。结论滇重楼遗传多样性水平较高,居群内和居群间具有一定的遗传分化。对保护和发展滇重楼资源提出若干措施,为滇重楼的保护和科学可持续利用提供参考。     

混合丛枝菌根真菌接种时期对滇重楼幼苗内源激素含量的影响

目的研究混合丛枝菌根(AM)真菌不同接种时期对滇重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis幼苗内源激素含量的影响。方法室内盆栽法,分别将滇重楼种子、1年生苗、2年生苗接种混合AM真菌,于灭菌土壤基质中进行共生培养,采用高效液相色谱法测定内源激素玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)含量。结果混合AM真菌对不同时期,不同种源的滇重楼根状茎和根中内源激素ZR、GA、IAA、ABA含量变化的影响不尽相同。整体上,与对照组比较,野生种源和栽培种源滇重楼根状茎和根的ZR和GA内源激素含量均呈增加趋势,ABA含量均呈减少趋势。滇重楼根状茎和根中IAA/ABA、GA/ABA、ZR/ABA增大。结论 1年生苗期接种S2、S6型混合AM真菌,对促进滇重楼幼苗根状茎和根生长的综合效果最佳。     

云南重楼中血管内皮生长因子结合因子的活性研究

目的筛选并分离云南重楼水提物中能与血管内皮生长因子(VEGF)蛋白结合的物质,并探究其对VEGF的刺激作用。方法采用固相化VEGF亲和柱色谱的方法筛选云南重楼水提物中的VEGF结合因子,HPLC法进一步分离纯化该因子成分,并采用MTT法以VEGF敏感型细胞株HepG2为模型验证该因子活性,采用UV、RRLC-QTOF检测,推测该因子可能的成分组成。结果从云南重楼水提物中筛选到能与VEGF蛋白结合的因子(命名为因子B3),HPLC分离纯化后因子B3可以促进VEGF敏感型细胞HepG2的增殖,而对VEGF不敏感型细胞HEK293的增殖没有影响。因子B3和VEGF蛋白对HepG2细胞的增殖促进作用存在叠加效应;而这种效应可以被VEGF抗体阻断;因子B3本身对HepG2细胞的增殖作用也可以被VEGF抗体阻断。通过UV和RRLC-QTOF检测,推测因子B3可能为皂苷类成分。结论云南重楼中得到的因子B3具有促进VEGF功能的活性。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

滇重楼根茎品质与根际土壤因子的相关性分析

目的 探明野生与移栽滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis根际土壤中基本养分、土壤酶活性与根茎品质的关系，筛选影响滇重楼活性成分的主导土壤因子，为滇重楼合理施肥提供参考依据。方法 以采自云贵川33个样点的滇重楼为材料，测定了其根茎品质指标以及生长土壤基本养分含量和土壤酶活性；分析了根茎品质指标与土壤因子的相关性，并采用逐步回归分析方法筛选出影响滇重楼根茎品质的主要土壤因子。结果 滇重楼野生品和移栽品在总皂苷、总多糖、总黄酮含量上具有一定的差异，药材品质具有一定的地域性。所有滇重楼根际土壤样品的酸碱度适中，基本养分充足、含量丰富，土壤酶活性高，适宜于滇重楼的生长发育，野生地土壤肥力质量优于移栽地。野生滇重楼根茎总皂苷与多酚氧化酶活性呈现出极显著正相关，总黄酮与pH值、脲酶活性呈极显著负相关关系。移栽滇重楼根茎总皂苷与速效钾含量呈现出显著负相关，总黄酮与蔗糖酶活性呈显著正相关关系，总多糖与碱性磷酸酶活性呈显著正相关。结论 滇重楼品质主要受到土壤因子综合影响，在滇重楼野外就地保护或人工栽培过程中，注意根据实际情况增减土壤各养分的含量及其比例关系。     

AM真菌对滇重楼光合参数及生理指标的影响

通过室温盆栽接种试验与室内分析相结合的方法,观察灭菌土壤条件下接种28种丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼光合参数和生理生化指标的影响。结果表明,滇重楼与AM真菌形成了良好的共生关系。AM真菌诱导处理后,不同AM真菌对滇重楼叶片的光合参数和生理生化指标的影响有所差异,AM真菌的施用能够提高滇重楼叶肉细胞的光合作用强度,提高滇重楼叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量及保护酶活性,增强了滇重楼抗不利环境的能力,促进了滇重楼的生长,而滇重楼与AM真菌之间存在一定的相互选择性。从综合接种效应来看,瑚状盾巨囊霉Racocetra coralloidea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora、近明球囊霉Claroideoglomus claroideum、透明盾巨孢囊霉S. pellucida和明球囊霉Rhizophagus clarus是最适宜滇重楼大田栽培时推广应用的优良备选菌株。