结核分枝杆菌rpoB基因的套式PCR扩增及其DNA测序

现代分子药理学研究发现,结核分枝杆菌(Mtb)的利福平耐药是由于其RNA聚合酶β亚单位基因(rpoB基因)突变所致。近年来,国内外学者通过“临床标本→Mtb培养鉴定→PCR→DNA测序(或sscp等分析)”的技术路线进行了临床病例研究[1、2、3]。但该技术路线不适于大样本的分子流行病学研究,并因为费时,尚不能服务于临床。鉴于套式聚合酶链反应(nestedPolymeraseChainReaction,nPCR)的灵敏度和特异性明显优于传统PCR,因此我们建立了Mtb的rpoB基因nPCR扩增体系。通过“临床标本→MtbnPCR→DNA测序”技术路线对临床病例直接进行Mtb感染诊断…     

适用于PCR检测的发根DNA提取法

目的 为适应在组织、细胞、血液等标本无法获取或现场只留下毛发的情况下进行基因组检查，本研究了自发根提取DNA的方法。方法 试验了三种提取方法，即Tris—钾镁盐液(TKM)法、细胞裂解法及最简单的水煮沸法。结果 三种方法所得的DNA产量不同，但经模板活性鉴定，均适用于PCR检查。结论 在其它样品取材受限时，毛发可作为另一类标本进行基因组DNA的分析。     

核酸扩增技术在献血者血液筛查中的应用分析

目的探讨核酸扩增技术在献血者血液筛查中的应用价值。方法采用HBV/HCV/HIV核酸检测试剂对血站常规ELISA筛查阴性的献血者标本进行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1RNA 3个项目的8人份汇集检测,阳性汇集池再拆分检测。结果 33 714份ELISA筛查阴性标本中,检出HBV DNA阳性标本5例,阳性检出率为0.015%,未检出HCV RNA阳性标本和HIV-1RNA阳性标本。结论核酸扩增技术应用于无偿献血者血液筛查,有助于提高献血者的血液质量,保证输血安全。     

结直肠癌石蜡切片行免疫组化染色后的DNA质量评估

目的对免疫组化染色后的结直肠癌石蜡标本重新处理,提取DNA并进行质量评估,旨在探讨稀缺标本重利用进行相关分子检测的可行性。方法收集病理确诊的结直肠癌石蜡标本30例,其中结肠癌13例,直肠癌17例。切片采用免疫组化En Vision两步法染色后进行DNA提取,并进行CTNNB1基因检测和CDH1甲基化检测。结果 30例经免疫组化染色的石蜡标本中提取到的DNA质量合格,并可以顺利进行后续CTNNB1基因检测和CDH1甲基化检测。结论结直肠癌标本,尤其是标本量较少或难以获取的样本,经免疫组化染色后仍能够提取高质量的DNA,并且可以用于靶基因的下游分子分析,是值得推广的方法。     

结核分枝杆菌rpoB基因的套式PCR扩增及其DNA测序

现代分子药理学研究发现,结核分枝杆菌(Mtb)的利福平耐药是由于其RNA聚合酶β亚单位基因(rpoB基因)突变所致.近年来,国内外学者通过"临床标本→Mtb培养鉴定→PCR→DNA测序(或sscp等分析)"的技术路线进行了临床病例研究[1、2、3].但该技术路线不适于大样本的分子流行病学研究,并因为费时,尚不能服务于临床.鉴于套式聚合酶链反应(nested Polymerase Chain Reaction, nPCR)的灵敏度和特异性明显优于传统PCR,因此我们建立了Mtb的rpoB基因nPCR扩增体系.通过"临床标本→Mtb nPCR→DNA测序"技术路线对临床病例直接进行Mtb感染诊断和Mtb利福平耐药检测.     

碘化钾法抽提冻存外周血DNA的方法初探

目的:探讨碘化钾法从冻存外周血中抽提基因组DNA的产量及质量.方法:对400μL冻存血标本(-20℃保存半年)及200 μL新鲜血标本(4℃保存不超过1周)分别采用KI法提取基因组DNA,比较其浓度和纯度.并进行CYP2C19相关基因的PCR扩增.结果:通过增加处理标本量,可以相应提高从冻存外周血中提取的基因组DNA产量,但获取的DNA纯度低于新鲜血标本.结论:KI法提取DNA时,需要根据实验目的和要求,选择适当的保存方法.     

血液筛查中隐匿性乙型肝炎病毒的核酸检测初步研究

目的 通过对无偿献血者血液标本进行核酸检测,再对核酸检测阳性标本进行HBV DNA定量和“两对半”检测,提高隐匿性乙型肝炎病毒的检出率,缩短窗口期,保障血液检测质量.方法 采用ELISA检测无偿献血者血液标本,并使用核酸检测ROCHE COBAS S201血液核酸筛查系统,对核酸检测阳性标本进行HBV DNA定量检测,同时进行乙型肝炎“两对半”检测.结果 无偿献血者血液标本22467份,经两遍ELISA检测HBsAg阳性标本94人份,再对于22273份ELISA阴性标本再进行核酸检测,结果 有39人份检出为HBV DNA.结论 核酸检测阳性39人份中HBsAg阳性标本8人份,其中有两例拷贝数较高,并且为HbsAg、HBeAb、HBcAb阳性.核酸检测在采供血机构血液筛查中起到了重要作用.     

2型神经纤维瘤病标本库的建立及应用分析

目的初步建立2型神经纤维瘤病（NF2）患者的扬瘁库,分析其临床应用及遗传学研究的1介值。方法收集NF2患者病例资料并进行长期跟踪随访,绘制家族系谱图并建立信息资料库;采集NF2患者及家族高危成员外周静脉血,分离血浆、血清及淋巴细胞分别保存;术中获取新鲜肿瘤组织15min内存入液氮中,部分组织制作成石蜡标本;提取肿瘤及淋巴细胞标本中的DNA,质检并保存,采用PCR—DNA测序方法进行NF2基因突变分析。结果已将293例患者信息纳入资料库,并完成定期随访;收集肿瘤冰冻标本72例,肿瘤石蜡标本275例,血液样本80例;外周血及冰冻肿瘤组织提取DNA的OD260／280值在1．80-1．86之间,198例石蜡样本提取的DNA片段长度主要分布在1700～2500bp之间,能满足分子遗传学研究的需要。结论NF2标本库的建立可为症状前基因筛查、遗传规律分析及发病机制研究提供标本来源。     

昆明地区体检人群输血传播病毒分子流行病学研究

目的通过对体检人群输血传播指标的检测,探究云南昆明地区第4、5组群输血传播病毒分子流行病学的特点。方法本次研究材料取于2016年4月在云南省第一人民医院体检科223份体检人群的血液标本,充分离心后提取血清,在零下80℃保存。利用聚合酶链式反应对血清输血传播病毒进行检测,阳性样品测序以后,对其同源性与系统进化予以分析。结果本研究对223份血清予以检测,并根据序列的测定与比对,明确了150份阳性标本,其病毒感染率为64.38%,第4组群检测出47份,其输血传播病毒的感染率21.08%;第5组群检测出77份,其输血传播病毒的感染率34.53%;混合感染9份,感染率4.04%。结论获取了本地区第4、5组群输血传播病毒流行病学的有关数据,对输血传播病毒具有预防作用。     

核酸检测技术在献血者血液筛查中的应用

目的评估核酸检测技术(NAT)应用于献血者血液筛查的必要性和可行性。方法采用美国罗氏诊断公司cobas s 201系统对2010年8月～2011年12月血站ELISA检测合格的献血者79 414人份血液标本进行HIVRNA-1,-2、HCV RNA和HBV DNA 3项联合核酸检测(cobas TaqScreen MPX试剂),先对6人份标本混样进行NAT,如为阴性,则直接出具结果,如出现阳性结果,再进行拆分检测;对NAT检测反应性标本进行分项确证试验。结果ELISA法共检测了98 935人份标本,抗-HIV、抗-HCV、HBsAg均为阴性的合格血液共96 923份;对79 414人份血液标本NAT共检出阳性194例,阳性率为0.24%;分项检测发现127例阳性标本,病毒类型均为HBV DNA,未检测出HCV RNA和HIV RNA,阳性检出率为65.46%(127/194)。结论 NAT能在ELISA检测阴性的献血者血液标本中筛查到HIV RNA-1,-2、HCV RNA和HBV DNA反应性标本,常规开展NAT能进一步提高血液及输血安全。     

护士血液标本采集认知状况的调查分析

目的了解护士血液标本采集认知状况。方法采用自行设计的调查问卷对400名护士血液标本采集认知状况进行调查。结果除血液标本处理和血液标本采集量外,护士血液标本采集认知正确率为75.75%以下。不同年龄、职称和学历及科室护士血液标本采集认知情况比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论护士血液标本采集知识较缺乏。进行血液标本采集技术和相关知识培训,建立和健全检验质量管理的标准与质量要求,可确保检验前标本的采集质量。     

纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性

背景：相对于血液标本,口腔拭子标本更利于大规模载脂蛋白E基因多态性分析的研究,但目前对口腔拭子标本基因组DNA的提取尚无统一方法。 目的：探索合适的口腔拭子标本基因组提取方法以分析载脂蛋白E基因的多态性。 方法：收集50例散发性阿尔茨海默病患者口腔拭子标本,每份标本分别应用纳米磁珠法与PicoDNA微量核酸提取试剂盒法提取基因组DNA,对比分析两种方法获得的基因组DNA纯度和浓度,后续进行PCR反应,应用DNA电泳确认有无成功扩增出目的条带,通过DNA测序方法分析载脂蛋白E基因的多态性。 结果与结论：两种方法提取的基因组DNA纯度均较好,纳米磁珠法提取的基因组DNA浓度要高于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法所得浓度（P〈0.05）。两组获取的基因组DNA均可成功进行PCR扩增,但电泳结果示纳米磁珠法扩增的目的条带更清楚。两组PCR产物DNA测序结果一致,载脂蛋白E基因ε2、ε3、ε4基因型的比例分别是6%,71%,23%。表明纳米磁珠法相对于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法提取口腔拭子标本基因组DNA更适合用于大样本载脂蛋白E基因多态性的研究。     

慢性乙型肝炎病毒感染者唾液HBV DNA检测及其意义

目的探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者唾液HBV DNA检测的流行病学意义及诊断价值.方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清学标志物.用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测HBV DNA.对114例慢性HBV感染者唾液和血液标本进行检测与分析.结果 114例慢性HBV感染者唾液和血液HBV DNA阳性率分别为28.1%和47.4%,阳性者平均HBV DNA含量分别为6.37±0.95和8.18±1.54(拷贝数/ml的对数),后者均显著高于前者.唾液HBV DNA含量与血液含量高度正相关(r=0.918).血液HBV DNA阳性者的唾液阳性率为59.1%(32/54).血液HBV DNA阴性者唾液阳性率0.00%(0/60).血液HBsAg(+)、HBeAg(+)者的唾液HBV DNA阳性率为100%(20/20).血液HBsAg(+)、HBeAg(-)者的唾液HBV DNA阳性率为15.1%(11/73).结论慢性HBV感染者尤其是HBeAg阳性者和血液HBV DNA阳性者的唾液含有HBV,可能有一定传染性.     

PCR-焦磷酸测序法快速检测和鉴定临床常见致病菌的研究

焦磷酸测序（Pyrosequecing）技术为近年新一代短片段DNA序列分析技术。国外主要用于分子流行病学的单个核苷酸多态性位点大容量快速检测和临床微生物菌种鉴定与分型，但国内尚未开展。本研究刚该技术对针对不同细菌的独特分子标志，设计基于PCR技术的快速菌种鉴定方法，以提供从分子水平快速鉴定菌种的新的可靠方法。     

皖南地区血液集中化检测应用分析

目的探讨皖南地区血液集中化检测的意义。方法对皖南5家血站常规检测合格的标本,采用2套血液核酸筛查系统进行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA检测。酶免阴性、核酸阳性的标本,进行乙肝血清学补充试验。最后对5家血站的核酸阳性检出率进行分析。结果在集中化检测期间共检测39 616例标本,检出HBV阳性39例,其中芜湖12例、安庆16例、池州3例、黄山5例、铜陵3例。结论各单位送检的标本质量,直接影响核酸检测结果准确性。NAT能在ELISA检测阴性的献血者血液标本中筛查到核酸阳性标本,有效降低了经血传播传染病的危险。核酸集中化检测可进一步提高血液质量及保障血液安全。     

静脉血液标本管理的研究进展

正静脉血液标本是判断患者病情进展程度及疾病治疗效果的重要依据,其质量关系到检验结果是否能够真实反映患者的病情。血液标本不合格率受实验室前和实验室操作的共同影响。随着实验室技术及实验室质量控制的开展,实验室前阶段已成为标本质量控制的薄弱环节。国外研究~([1])报告,因实验室前操作不当引起的血液标本不合格率为46%~68%,国内为35%~75%~([2])。本文对实验室前静脉血液标本的管理进行综述,旨在明确实验室前静脉血液标本     

核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用

核酸分子杂交技术能特异地检测细胞及微生物的核酸序列，广泛地使用于肿瘤学、遗传学、病理学、微生物学、细胞学、流行病学的基础研究和临床诊断。核酸分子杂交的技术主要包括标本的处理、探针的制备和标记、杂交及杂交物的检测。     

核酸检测技术在血液筛查中的应用及分析

目的 对济南地区无偿献血者进行病毒核酸检测,探讨将核酸检测技术应用于血液筛查的重要意义.方法 采用Roche Cobas S201血液筛查系统对本中心ELISA检测阴性的91 271份标本进行HBV、HCV和HIV 3项联合筛查,并对核酸检测阳性标本进行分项定量检测和乙肝5项检测.结果 91 271份标本中共检出核酸阳性标本60例,阳性检出率为0.066％;其中38例定量检测阳性,且均为HBV DNA.结论 核酸检测技术应用于血液筛查可有效地提高血液安全.     

巢式聚合酶链式反应检测布鲁氏菌核酸DNA方法的建立

目的建立一种具有灵敏性高,特异性强的巢式聚合酶链式反应(PCR)方法检测血液标本中布鲁氏菌核酸DNA。方法使用细菌基因组提取试剂盒提取纯菌核酸DNA;使用血液等组织基因组核酸DNA提取试剂盒提取血液标本核酸DNA,对提取的核酸DNA先行常规PCR预扩增,以扩增的PCR产物为模板进行荧光定量PCR第二次扩增(即巢式PCR)。对纯菌提取的核酸DNA进行灵敏度和和特异性测试,构建巢式PCR的Ct值与核酸DNA拷贝数之关系曲线;检测临床血液标本核酸DNA,同时比较常规两种PCR方法检测结果。结果常规PCR检测的灵敏度为512个核酸DNA拷贝数;巢氏PCR检测有效范围为921.6 ng/μl^6.8 fg/μl,对应的Ct值为12.04~37.50,其指数关系为:y=(e-0.695x)×1012;R2=0.9986,巢式PCR扩增效率为2.28×109倍,检测限为2个布鲁氏核酸DNA拷贝数。巢式PCR的灵敏度为91.67%,特异度为93.10%,阳性预测值为91.67%,阴性预测值为93.10%。对一起羊养殖场采集的25份血液标本应用巢式PCR方法检测,结果阳性率为92.00%(23/25);27份健康人群血液标本没有检测出(无Ct值)。结论巢式PCR具有较好的灵敏性和特异性,特别适合于血液标本布鲁氏菌核酸DNA的检测。     

儿童烧伤患者感染MRSA的耐药性及分子流行病学研究

目的：调查儿童烧伤患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的耐药性及分子流行病学情况,为控制感染提供科学依据。方法通过PCR扩增mecA基因鉴定 MRSA菌株,K-B纸片法检测菌株耐药性,随机扩增多态性DNA（RAPD）对其进行同源性分析。结果从住院烧伤儿童临床标本分离得到的52株金黄色葡萄球菌中 MRSA占44．2％（23/52）,且对多种抗菌药物均耐药。23株MRSA经RAPD分析可分为4型,以Ⅱ型为主。结论儿童烧伤患者分离MRSA菌株具有多重耐药性,应根据药敏试验结果合理选用抗菌药物进行治疗;RAPD技术能为控制感染提供分子流行病学依据。