P21对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制及对POLD1基因表达的调控

目的:研究P21对POLD1基因的调控通路,以探索阻断癌细胞恶性增殖的机制.方法:实验主要分3组:阴性对照组(转染空载体pXJ41-neo的803-pXJ细胞)、空白对照组(胃癌细胞MGC-803)、实验组(转染P21重组真核表达质粒pXJ41-p21的803-p21细胞).MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平的变化,Westernblot分析蛋白表达差异.结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞增殖受到明显抑制,凋亡率(%)增高(11.36±0.51vs7.39±0.17,7.69±0.47,F=85.338,均P<0.05).实验组P21mRNA表达水平显著提高(2.15±0.23vs1.05±0.11,1.00±0.00,F=59.054,均P<0.05),POLD1则显著下调(0.45±0.07vs1.09±0.13,1.00±0.00,F=49.907,均P<0.05);P21、P125蛋白表达变化与基因变化相一致.cyclinE、Rb1基因表达均上调,CDK2基因表达下调,c-myc基因表达则变化不大.结论:P21抑制了...     

缺氧环境中黏着斑激酶对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响

目的 研究缺氧对人肝癌细胞SMMC-7721黏着斑激酶(FAK)表达的影响以及FAK表达对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响.方法 通过1%体积分数O2的低氧培养建立人肝癌细胞SMMC-7721物理缺氧模型,Western blot检测FAK的表达.构建针对FAK mRNA的干扰质粒pshRNA-FAK及阴性对照质粒pGensil-2,并将其转染至SMMC-7721细胞,G418筛选稳定转染细胞株.Western blot检测FAK蛋白表达的变化,细胞迁移和侵袭实验检测缺氧条件下细胞迁移和侵袭能力的改变.在正常条件下将FAK真核表达质粒pcDNA3-FAK转染至SMMC-7721细胞,观测其侵袭能力的改变.根据数所资料的不同分别采用t检验、单因素方差分析,LSD法及Dunnett法进行统计学处理. 结果低氧培养的SMMC-7721细胞FAK蛋白表达水平逐渐升高,24 h后较0 h时明显升高(P<0.01).SMMC-7721细胞稳定转染pshRNA-FAK后,FAK蛋白表达显著下降,抑制率达74.6%±5.1%,在正常及缺氧条件下都对FAK表达有显著抑制作用.细胞迁移实验结果显示,缺氧显著促进SMMC-7721细胞迁移能力(t=18.66,P<0.01),侵袭实验结果与迁移实验结果一致.转染pshRNA-FAK对促进SMMC-7721细胞在缺氧环境中的迁移能力有显著抑制作用,透膜细胞数(353±36)个较对照组(392±31)个明显降低(F=173.983,P<0.05);细胞侵袭实验显示,转染pshRNA-FAK对促进SMMC-7721细胞侵袭能力有显著抑制作用,透膜细胞数(160±12)个较对照组(194±13)个明显降低(F=59.674,P<0.05).同时转染真核表达质粒pcDNA3-FAK显著促进SMMC-7721细胞侵袭能力.结论 缺氧促进SMMC-7721细胞侵袭可能与FAK表达水平升高相关,FAK表达的上调可能是缺氧促进肝癌细胞侵袭转移的机制之一.     

蛋白酶体β亚基4型对人肝癌SMMC7721细胞增殖存活的影响

目的旨在探讨蛋白酶体β亚基4型(PSMB4)对人肝癌SMMC7721细胞增殖存活的影响及其可能的机制。方法利用特异性短发夹RNA(shRNA)技术构建干扰PSMB4表达的SMMC7721实验组细胞;运用MTT、克隆形成实验检测细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,Western Blot检测相关蛋白的表达变化。计量资料两组间比较采用独立样本t检验。结果成功构建了干扰PSMB4表达的SMMC7721实验组细胞(shRNA1:t=22.67,P<0.0001;shRNA2;t=30.88,P<0.0001;shRNA3:t=67.82,P<0.0001)。MTT实验显示第4天(0.4770±0.0135 vs 0.3237±0.0127,t=8.286,P=0.0012)、第5天(0.5893±0.0088 vs 0.3847±0.0090,t=16.220,P<0.0001)实验组细胞OD490值显著低于对照组。克隆形成实验显示细胞集落数显著减少。流式细胞术显示实验组细胞的早期凋亡率[(5.5570±0.2589)%vs(3.8870±0.3324)%,t=3.964,P=0.0166]、晚期凋亡率[(12.6300±0.4198)%vs(5.3100±0.3062)%,t=14.080,P=0.0001]及总凋亡率[(18.1800±0.6785)%vs(9.1970±0.6313)%,t=9.967,P=0.0006]均明显高于对照组,且干扰PSMB4表达的实验组细胞中核因子-κB亚基p65蛋白表达降低(0.8015±0.0120 vs 0.2841±0.0110,t=31.830,P<0.0001),核因子-κB抑制蛋白α表达增加(0.4816±0.0112 vs 0.6583±0.0142,t=9.774,P=0.0006)。结论干扰PSMB4表达可能通过抑制NF-κB信号通路,从而导致肝癌SMMC7721细胞的增殖存活能力下降。     

RNAi沉默Sp3基因对肝癌HepG2细胞增殖的影响

目的:采用基因沉默和慢病毒转染技术,沉默人肝癌细胞HepG2中特异蛋白3(specificity protein 3,Sp3)的表达,观察沉默Sp3基因后的肝细胞的增殖能力变化.方法:采用Sp3-siRNA慢病毒转染人肝癌细胞HepG2,通过免疫印迹法和PCR技术检测Sp3的表达以验证转染效果,通过MTT检测细胞生长曲线和流式细胞技术测定细胞周期.结果:Western blot实验表明,实验组的Sp3表达量明显少于空白组和阴性对照组(0.37±0.08 vs 0.83±0.17,0.66±0.13,F=8.442,均P<0.05).RT-PCR也得到相同的结果(0.47±0.05 vs 0.74±0.08,0.70±0.16,F=7.322,均P<0.05).MTT实验结果显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞在48、72和96h时的增殖明显受到抑制(0.28±0.18 vs 0.34±0.19,0.35±0.07,F=3.888;0.57±0.11 vs 0.84±0.05,0.74±0.08,F=12.721;0.72±18.1 vs 0.98±0.05,0.93±0.9,F=6.342,均P<0.05).流式细胞术结果显示实验组细胞主要分布在G1期.结论:RNAi沉默Sp3基因导致人肝癌HepG2细胞体外增殖能力下降.     

PHB1对人肝癌细胞增殖的影响及其作用机制

目的探讨抗增殖蛋白1(prohibitin1,PHB1)对人肝癌细胞增殖的影响及其作用机制。方法构建PHB1真核表达重组质粒(pEGFP-PHB1)和PHB1靶向siRNA质粒(shRNA-PHB1)转染人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721,诱导PHB1在人肝癌细胞中表达上调和下调,采用MTT、流式细胞学、荧光定量PCR和免疫印迹等技术检测人肝癌细胞增殖、细胞周期,以及细胞周期关键调控分子的表达情况。结果高表达PHB1可阻滞HepG2和SMMC-7721细胞于G0/G1期[(67.28±2.94)%比(56.71±2.56)%,t=6.64,P=0.00;(69.48±3.82)%比(60.43±2.59)%,t=4.80,P=0.00],使S期比例下降[(14.74±1.45)%比(24.13±1.92)%,t=9.54,P=0.00;(13.73±1.26)%比(25.50±2.30)%,t=10.99,P=0.00],抑制细胞增殖;周期调控分子p53和p21CIP1mRNA和蛋白质水平显著升高,而Cyclin A2、Cyclin E1和CDK2 mRNA和蛋白质水平显著降低(P0.01)。低表达PHB1可促使HepG2和SMMC-7721细胞趋于S期[(31.65±2.71)%比(24.68±1.28)%,t=5.69,P=0.00;(31.02±2.49)%比(25.88±2.40)%,t=3.64,P=0.005],促进细胞增殖;p53、p21CIP1、Cyclin A2、Cyclin E1、CDK2 mRNA和蛋白质水平与PHB1高表达时相反(P0.01)。结论高表达PHB1可以阻滞人肝癌细胞周期于G0/G1期,进而抑制细胞增殖,其作用机制可能与p53介导的G0/G1期相关细胞周期蛋白有关。     

Egr-1基因表达及其在射线诱导的肝癌细胞凋亡中的作用

目的:研究Egr-1基因的表达在放射诱导的细胞凋亡中的作用．方法:选择肝癌细胞系HepG2,SMMC-7721和正常肝细胞系HL-7702培养;培养细胞接受4Gy X射线照射;收获受照前和受照后1,2,4, 6,12和24 h的细胞,采用荧光定量PCR(FQ- PCR)检测0,1,2和4 h Egr-1基因的表达,采用流式细胞术(FCM)检测0,6,12和24 h细胞周期和细胞凋亡．结果:随HepG2,SMMC-7721和HL-7702在4GY X射线照射后1 h即诱导了Egr-1基因表达增高,4 h均未达峰值,分别为ΔEgrHepG2(12．9629±1．0649)、ΔEgr7702(0．0096±0．0008)和ΔEgr7721(0．0017±0．0003),HepG2显著高于HL-7702和SMMC-7721(P<0．01)．照射后6 h射线诱导的3株细胞凋亡均不明显,但在12 h均诱导了明显的细胞凋亡,而且HepG2(41．16％)和HL-7702(27．45％)已达峰值; SMMC-7721诱导的细胞凋亡水平较低,24 h仅为24．94％,且未达峰值．在射线诱导的细胞周期变化中,HepG2和SMMC-7721 S期的变化与细胞凋亡变化在6-12 h走势相反．结论:在HepG2,SMMC-7721和HL-7702细胞中,射线通过诱导Egr-1基因表达而诱导了细胞周期和细胞凋亡的变化;射线诱导的Egr-1基因表达水平可能与射线诱导的细胞凋亡成正相关;S期肿瘤细胞可能易发生射线诱导的细胞凋亡．     

人端粒酶催化亚单位锤头状核酶诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 构建带有U6启动子的人端粒酶催化亚单位锤头状核酶真核表达质粒及其突变体,转染入肝癌细胞株SMMC7721,观察端粒酶活性、细胞增殖和凋亡的情况。 方法 用分子克隆技术构建由U6作为启动子、绿色荧光蛋白基因作为报告基因的核酶真核表达质粒pGTRz-U6及其突变体pGTmRz-U6,并以空质粒pEGFP-C1作为对照。Lipofectamine2000转染人肝癌细胞株SMMC7721,G418筛选阳性克隆。RT-PCR检测核酶及hTERT基因的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)作细胞生长曲线观察其生长情况,TRAP-银染法检测端粒酶活性变化,流式细胞计数(FCM)法检测细胞的凋亡水平。 结果 核酶、突变核酶在SMMC7721中持续表达;凝胶成像系统分析SMMC7721-pEGFP-C1、SMMC7721-mRz、SMMC7721-Rz hTERT基因表达,用SPSS10.0软件对3种细胞进行分析,发现三者hTERT基因表达水平不同(F=47.987,P<0.01);t检验分析得出SMMC7721-Rz hTERT基因表达明显低于SMMC7721-mRz和SMMC7721- pEGFP-C1(t值分别为-7.640和-11.602,P值均<0.01)。SMMC7721-pEGFP-C1和SMMC7721-mRz hTERT表达没有区别(t=-0.178,P>0.05)。TRAP-银染及FCM结果分别显示,随着细胞的分裂,SMMC7721-Rz和SMMC7721-mRz细胞端粒酶活性逐渐降低,凋亡水平逐渐增加,7PDS细胞凋亡率分别是29.86％和9.87％,而对照组SMMC     

单酰甘油脂肪酶对人肝细胞癌裸鼠移植瘤的影响及其机制

目的探讨单酰甘油脂肪酶(MAGL)在人肝细胞癌(HCC)裸鼠移植瘤生长中的作用和机制。方法移植的SMMC-7721细胞株分为SMMC-7721~(WT)组(未处理)、SMMC-7721~(MAGL-KD)组(MAGL沉默)、SMMC-7721~(MAGL-OE)组(MAGL过表达)和SMMC-7721~(Vector)组(空载体转染) 4组。将27只雄性BALB/c裸鼠分为4组建立裸鼠皮下移植瘤模型,即A组(注射SMMC-7721~(WT)组细胞株,n=12)、B组(注射SMMC-7721~(MAGL-KD)组细胞株,n=5)、C组(注射SMMC-7721~(MAGL-OE)组细胞株,n=5)及D组(注射SMMC-7721~(Vector)组细胞株,n=5),其中A组又分为A1(正常饲喂,n=4)、A2[(高脂饲喂(HFD)+JZL184(MAGL的特异性抑制剂,n=4)和A3 (HFD饲喂,n=4) 3个亚组。观察并比较4组肿瘤体积变化,瘤体内增殖细胞核抗原(PCNA)、金属基质蛋白酶(MMP) 2、血浆溶血性磷脂酸(LPA)和前列腺素E2(PGE2)的表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果 MMC-7721~(WT)组、SMMC-7721~(MAGL-KD)组、SMMC-7721~(MAGL-OE)组3组间MAGL蛋白相对表达水平比较差异有统计学意义(0. 377±0. 026 vs 0. 182±0. 055 vs 0. 689±0. 019,F=33. 382,P 0. 001),SMMC-7721~(MAGL-KD)组MAGL蛋白表达水平显著低于SMMC-7721~(WT)组(P 0. 05),SMMC-7721~(MAGL-OE)组显著高于SMMC-7721~(WT)组(P 0. 05); A、B、C、D 4组间裸鼠皮下移植瘤大小比较差异有统计学意义[(4236. 125±1284. 283) mm~3vs (1883. 375±552. 977) mm~3vs (10 146. 061±1842.264) mm~3vs (4307. 452±2070. 708) mm~3,F=6. 804,P=0. 023],C组的裸鼠皮下移植瘤的生长速度比A组更快(P 0. 05),而B组比A组慢(P 0. 05); A、B、C 3组间PCNA和MMP2水平比较差异均有统计学意义(PCNA:25 843. 821±4201. 310 vs 17 426. 95±5139. 202 vs 39 753. 103±5721. 444,F=21. 482,P 0. 001; MMP2:52 841. 621±4339. 253 vs 35 511. 451±8251. 423 vs 68 274. 731±6418. 594,F=11. 526,P 0. 001),B组PCNA和MMP2水平均明显低于A组(P值均0. 05),而C组均高于A组(P值均0.05); A1、A2、A3 3组间肿瘤体积比较差异有统计学意义[(23 476. 289±483. 872) mm~3vs (18 593. 851±1385. 805) mm~3vs (37 703.198±2925. 254) mm~3,F=47. 371,P=0. 004],与A1组相比,A3组的裸鼠皮下移植瘤体积增长速度更快(P 0. 05),A2组明显受到抑制(P 0. 05); A1、A2、A3 3组间PGE2水平比较差异有统计学意义[(0. 109±0. 023)μmol/L vs (0. 056±0. 010)μmol/L vs(0. 168±0. 024)μmol/L,F=16. 492,P 0. 001],A3组PGE2水平明显高于A1组(P 0. 05),A2组明显低于A1组(P 0. 05);B、C、D 3组间PGE2水平比较差异有统计学意义[(0. 069±0. 025)μmol/L vs (0. 175±0. 023)μmol/L vs (0. 096±0. 019)μmol/L,F=31. 550,P 0. 001],B组PGE2水平明显低于D组(P 0. 05),C组明显高于D组(P 0. 05)。结论 MAGL可能通过调控PGE2促进裸鼠HCC皮下移植瘤的生长,提示MAGL可能成为未来治疗HCC的潜在靶点。     

RNA干扰GRP78基因对肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响

目的 研究shRNA干扰GRP78对肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响。方法 将GRP78特异性shRNA质粒载体Pla-anti-GRP78转染SMMC-7721,采用流式细胞术(FCM)检测转染效率、分析细胞周期分布和凋亡,从蛋白和mRNA水平检测干扰GRP78效果,MTT 法检测干扰GRP78对SMMC-7721增殖的影响。结果Pla-anti-GRP78转染SMMC-7721细胞48h后,GRP78表达下降,空白对照组GRP78 mRNA的表达量为1,无关shRNA组为0.95,而Pla-anti-GRP78组为0.25(P<0.05);转染Pla-anti-GRP78的SMMC-7721细胞G2期阻滞(55.2%,P<0.05);空白对照组凋亡率为6.6%,无关shRNA组为8.1%,而Pla-anti-GRP78组高达58.2%(P<0.05)。 结论　shRNA干扰GRP78表达抑制SMMC-7721的增殖,并诱导其凋亡。     

葡萄糖调节蛋白78在棕榈酸诱导肝癌细胞凋亡过程中的作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白(GRP)78在棕榈酸(PA)诱导肝癌细胞凋亡中的作用。方法选取人肝癌细胞SMMC-7721,分为对照组和PA组;采用光学显微镜观察两组细胞死亡情况,采用反转录PCR检测两组GRP78 mRNA表达;同时将肝癌细胞分为对照组、空白载体组和GRP78载体转染组,其中GRP78载体转染组转染高表达GRP78质粒,空白载体组转染空白质粒,采用Western印迹检测GRP78蛋白表达情况,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果肝癌细胞SMMC-7721在PA刺激下,24 h后死亡细胞明显增多;PA组肝癌细胞SMMC-7721 GRP78 mRNA相对表达量为(3.014±0.447),明显高于对照组的1.012±0.322(P<0.05);GRP78载体转染组GRP78蛋白相对表达量明显高于对照组和空白载体组,细胞凋亡率明显低于对照组和空白载体组(均P<0.05)。结论高表达GRP78可抑制PA诱导的肝癌细胞凋亡。     

TAGLN真核表达载体pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAG-LN-mut及稳定转染细胞株的构建

目的:构建携tagln基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的人结肠癌细胞株RKO并鉴定.方法:通过Gateway克隆技术,使用pOTB7-TAGLN-mut与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与pcDNA6.2/EmGFP-BsdV5-DEST空载体进行LR重组反应,生成目的质粒pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut通过测序验证目的质粒的插入序列.将携带tagln的真核表达载体和对照质粒稳定转染至人结肠癌细胞株RKO.通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测tagln的mRNA和蛋白表达水平.通过细胞侵袭实验了解transgelin在结肠癌细胞RKO中的作用.结果:携带tagln的真核表达载体测序分析显示插入序列及位点正确;实时荧光定量PCR及免疫印迹结果显示,稳定转染重组目的质粒的细胞株(RKO-TAGLN细胞)中tagln的表达水平与转染对照质粒的细胞株(RKO-CTRL细胞)及野生型RKO细胞相比明显上调,差异具有统计学意义(mRNA相对表达水平分别为45.58±12.79、1.32±0.43和1,P<0.01;蛋白质灰度定量值为1.69±0.04、0.29±0.05和0.29±0.04,P<0.01).细胞侵袭实验提示,RKO-TAGLN细胞较RKO-CTRL细胞的侵袭能力提高(161.76%±61.18%,P<0.01).结论:成功构建携tagln基因的真核表达载体并建立过表达transgelin的稳定细胞株和对照细胞株,为研究transgelin在结肠癌中的作用奠定基础.     

原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2／pim-3,观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响．方法:利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2／pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定．将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测．结果:将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2／pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3．5％,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10．7％,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11．0％,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0．05);倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-772 1细胞中的正常表达;MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡．结论:真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡．     

βig—h3对人神经胶质瘤U87细胞侵袭力的影响

目的应用转化生长因子β诱导基因克隆3（βig—h3）真核表达载体pEGFP—C2／βig—h3转染人神经胶质瘤U87细胞,观察βig-h3对U87细胞侵袭力的影响。方法重组质粒pEGFP-C2／βig—h3用脂质体转染人神经胶质瘤U87细胞,采用明胶酶谱法和Transwell小室细胞侵袭实验检测转染后细胞基质金属蛋白酶（MMPs）表达水平和侵袭力的变化。结果与未转染的U87细胞和转染pEGFP—C2空载体的U87／vector相比较,在转染重组质粒pEG-FP-C2／βig-h3的U87／h3细胞中,βig-h3mRNA和蛋白表达均显著增高,U87／h3细胞MMPs表达水平明显提高,细胞侵袭率显著增高（P均〈0．01）。结论βis—h3可促进人神经胶质瘤U87细胞分泌MMPs,从而增强细胞的侵袭力,与神经胶质瘤的侵袭和转移密切相关。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ/P4启动子调控胸苷激酶载体的构建

目的 探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ/(IGF-Ⅱ)P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应.方法用分子生物学方法构建IGF-Ⅱ P4启动子和巨细胞病毒启动子(CMV)调控下HSV-tk 与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并用脂质体转染法将其转入肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中,在荧光显微镜下观察荧光表达情况.加入GCV使总浓度分别为0、1.0、10.0和100.0μg/ml,用四甲基偶氮唑盐实验检测HSV-tk/GCV系统对各种细胞的杀伤作用,用RT-PCR法检测转染前后胸苷激酶(tk)和EGFP mRNA的表达情况.用方差分析进行统计学处理.结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;pDC316-tkEGFP-CMV和pDC316-tkEGFP-P4转染的HepG2细胞均出现明显的细胞生长抑制现象,两者转染细胞的抑制率分别为6.95%±0.67%、24.99%±1.53%、49.68%±1.68%和71.85%±3.28%,4.83%±0.35%、17.34%±1.15%、30.17%±1.30%和40.39%±0.82%,转染后者对HepG2细胞的抑制率低(F=24.055,P<0.05),pDC316-tkEGFP-CMV转染的HeLa细胞也出现明显的细胞生长抑制现象,其抑制率分别是6.36%±0.83%、23.95%±1.72%、45.13%±1.64%和69.38%±3.17%.转染质粒pDC3 16-tkEGFP-P4的HeLa细胞未发现明显的细胞抑制现象.结论成功构建IGF-ⅡP4启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础.

Abstract：

Objective To investigate the selective killing effect of herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir(HSV-tk/GCV)suicide gene system controlled by human IGF-II P4 promoter on HCC cells in vitro.Methods Recombinant shuttle plasmid vectors driven by IGFⅡ P4 promoter and driven by CMV promoter were constructed by techniques of gene recombination.The recombinant shuttle plasmids were then transfected into HepG2 and HeLa cells by techniques of lipidosome transfection.EGFP expression was detected by fluoroscopy.Tk and EGFP mRNA expression were detected by RT-PCR.The selective killing effect after GCV application was determined with MTT method.Statistical analysis was performed with ANOVA analysis.Results Identification of pDC3 16-tkEGFP-P4 by enzyme digestion and sequencing analysis showed that the construction of the recombinant shuttle plasmid was correct.It was found that green fluorescence protein could only be seen in HepG2 cells.not in HeLa cells.The results of RT-PCR showed only two bands could be seen in the samples of pDC316-tkEGFP-P4 transfected HepG2 cells.The growth of HepG2 cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV and pDC316-tkEGFP-P4 were inhibited remarkably,the growth inhibition rates were 6.95% ± 0.67%,24.99% ± 1.53%,49.68% ±1.68%,71.85% ± 3.28% and 4.83% ± 0.35% vs 17.34% ± 1.15%,30.17% ± 1.30%,40.39% ± 0.82%(F = 24.055,P < 0.05),respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-CMV were also inhibed,the growth inhibition rates were 6.36% ± 0.83%,23.95% ± 1.72%,45.13% ± 1.64%and 69.38 % ± 3.17%,respectively. The growth of HeLa cells transfected with pDC316-tkEGFP-P4 was not inhibed. The growth inhibition rates were 0.91 ± 0.04,1.18 ± 1.32,1.19 ± 0.10 and 1.32 ± 0.05(F = 26.469,P < 0.01),respectively. Conclusion The shuttle plasmid vector carrying the tkEGFP fusion protein gene driven by IGF-Ⅱ P4 promoter has been constructed successfully and its specific expression in HepG2 cells provided the basis for targeted gene therapy for HCC.     

pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体的构建和hTim-3质粒稳定转染16HBE细胞株的建立

目的筛选表达Tim-3的人呼吸道相关细胞株,为进一步阐明Tim-3可能与人呼吸道疾病相关奠定基础;构建pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体,以期用于hTim-3的功能研究。将测序正确的重组质粒pEGFP-C2-hTim-3转染入人支气管上皮细胞株16HBE中,筛选出阳性细胞克隆,为后续实验提供理论基础。方法用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃5%CO2饱和湿度培养箱中体外培养人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82,调整细胞到最佳状态,对数生长期时收集细胞,抽提总RNA,逆转录为cDNA。参照人GenBank中Tim-3基因的全长序列,使用Primer5.0设计并合成其引物,采用PCR检测以上3种细胞Tim-3的mRNA。将健康人外周血Tim-3基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pEGFP-C2,经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,构建包含目的基因Tim-3的重组质粒pEGFPC2-hTim-3。利用脂质体介导pEGFP-C2-hTim-3质粒和pEGFP-C2质粒分别转染16HBE细胞,荧光显微镜下观察16HBE细胞的瞬时转染效率,并采用含G418的培养基筛选以获得整合pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2的阳性细胞克隆,用荧光显微镜观察pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2在16HBE细胞上的定位表达。结果 1）PCR显示人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3 mRNA;2）构建了具有筛选特征和能够稳定表达的pEGFP-C2-hTim-3质粒载体,测序结果与预期设计完全一致;3）瞬时转染后经荧光显微镜检查可见表达pEGFP-C2-hTim-3绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足8%,表达pEGFP-C2绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足15%。采用G418筛选后获得表达野生型hTim-3和外源性pEGFP-C2-hTim-3的16HBE细胞及转染pEGFP-C2空质粒的16HBE细胞,经荧光显微镜观察前者定位在胞膜上,后者定位于胞质中。结论人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3mRNA,Tim-3可能与人类呼吸道疾病的发生和发展相关。成功构建了真核表达载体pEGFP-C2-hTim-3并获得了高表达pEGFP-C2-hTim-3的16HBE阳性?     

靶向乙型肝炎病毒X蛋白小干扰RNA对稳定表达X基因的正常人肝细胞株线粒体功能的影响

目的 构建并鉴定靶向HBV X蛋白(HBx)小干扰RNA(siRNA)重组表达质粒,观察其对稳定表达HBx基因的正常人肝细胞株HL-7702/HBx线粒体功能的影响.方法 设计合成两条针对全长HBx基因具有短发夹结构的siRNA序列,克隆至载体psiRNA-Hh1GFPzeo中,构建重组表达质粒pX1和pX2,并以不针对任何序列的重组质粒pScr作为对照.通过脂质体介导转染人HL-7702/HBx肝细胞株,RT-PCR及Western印迹检测其对HBx的阻抑效应.流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△ m)水平的变化.采用方差分析对实验结果进行统计分析.结果酶切鉴定和测序结果证实pX1和pX2构建成功.pScr、pX1、pX2分别转染入HL-7702/HBx细胞48 h后,空白对照组HBx mRNA和蛋白表达水平分别为0.65±0.12和0.62±0.09,pX1组分别为0.33±0.10和0.19±0.08,明显低于空白对照组(t=4.73,P<0.05;t=7.53,P<0.05),pX2组分别为0.48±0.10和0.37±0.11,亦明显低于空白对照组(t=2.39,P<0.05;t=4.43,P<0.05),但pX1组抑制效果强于pX2组(t=2.28,P<0.05).RNA干扰后细胞内ROD水平为5.00±0.38,△ m水平为33.86±0.50;空白对照组ROS为72.10±0.55,△ m为3.57±0.26(t=276.22,P<0.05;t=107.15,P<0.05).结论 靶向HBx的siRNA能特异性抑制HBx在HL-7702/HBx细胞中的表达,并降低细胞内ROS水平,提高△ m水平,减轻细胞内氧化应激反应.     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。     

Construction of eukaryotic expression plasmid containing HCV NS3 segment and protein expression in human HL-7702 hepatocytes

AIM:To construct the eukaryotic expression plasmidcontaining HCV NS3 segment and to analyze theexpression of NS3 protein in normal human hepatocyteHL-7702.METHODS:We amplified HCV NS3 fragment fromplasmid pBRTM/HCV 1-3011 containing the whole lengthof HCV genome,recombined it with expression vectorpcDNA3.1(-)to form the eukaryotic expression vectorpcDNA3.1(-)/NS3,and transfected human HL-7702hepatocytes with the recombined plasmid by cationicpolymers.The expressed HCV NS3 protein was detectedand analyzed by immunohistochemical method andWestern blot.RESULTS:The amplified NS3 fragments had correctmolecule weight and sequence.The successfullyconstructed eukaryotic expression plasmids weretransfected to HL-7702 cells.The expressed NS3 proteinshad correct molecular weight 70000.CONCLUSION:Eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)/NS3 containing NS3 segment of HCV can beconstructed,the sequence of NS3 fragments is consistentwith the template.Normal human HL-7702 hepatocytescan efficiently express specific HCV NS3 protein in vitro.     

过氧化物酶体增殖物辅助激活因子1 α基因多态性对糖异生基因转录的影响

目的 研究过氧化物酶体增殖物辅助激活因子1α（PGC-1α）基因482号密码子甘氨酸-丝氨酸突变（Gly482Ser）多态性对糖异生关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）转录的影响.方法 （1）应用寡核苷酸诱导的定点突变和PCR技术构建PGC-1α 1444位点基因多态性表达质粒,并用普通PCR和酶切方法构建连接荧光素酶报告基因的人PEPCK启动子报告质粒PGL3-hPCK-luc.分别将PGC-1α基因482号密码子为甘氨酸的野生型表达质粒pcDNA3.1-PGC-1α（G）或482号密码子为丝氨酸的突变型表达质粒pcDNA3.1-PGC-1α（S）,与转录因子肝细胞核因子4α（HNF4α）表达质粒pcDNA3.0-HNF4α共转染进培养的人肝癌细胞及人正常肝细胞株.（2）转染48 h后检测细胞株内PGC-1α及PEPCK的mRNA水平及蛋白水平.进一步按不同组合联合转染PGL3-hPCK-luc及内参质粒PRL-SV40,培养48 h后用双荧光素酶检测试剂盒检测细胞荧光素酶的相对活性.多组间比较用单因素方差分析,2组组间比较用独立样本t检验.结果 成功构建PGC-1α 1444位点突变质粒及PGL3-hPCK-luc荧光素酶报告质粒.瞬时转染进HepG2细胞中,PGC-1α（G）与PGC-1α（S）质粒转染组PGC-1α mRNA及蛋白表达水平均明显增加,但2组间无明显差异（P＞0.05）;联合转染PGC-1α和HNF4α组的PEPCK的mRNA及蛋白表达水平较单转染PGC-1α明显增高（分别为10.40±0.70、4.50±0.50和0.86±0.18、0.99±0.09,均P＜0.05）;转染PGC-1α（G）＋HNF4α组较PGC-1α（S）＋HNF4α组PEPCK的mRNA及蛋白表达水平分别增高1.83倍和1.4倍（分别为10.40±0.70、5.35±0.23和4.50±0.50、3.00±0.40,均P＜0.05）.转染PGC-1α＋HNF4α组可显著促进PEPCK启动子活性（与单转染PGL3-hPCK-luc组比较）（分别为28.0±5.0和2.4±0.4,F=23.41,P＜0.05）;在HepG2中联合转染HNF4α时,PGC-1α（G）组较PGC-1α（S）可使PEPCK启动子相对活性增高2倍（分别为83±10和41±5,F=23.41,P＜0.001）;在L02细胞中联合转染HNF4α时,PGC-1α（G）组较PGC-1α（S）可使PEPCK启动子相对活性增高2.25倍（分别为28.0±5.0和12.6±1.5,F=60.75,P＜0.001）.结论PGC-1α可辅助激活HNF4α对PEPCK转录的促进作用,而PGC-1α基因Gly482 较Ser482对HNF4α的蛋白辅助激活作用更强,这可能为基因多态性引起蛋白表达后不同构型影响蛋白-蛋白相互作用有关.     

巨噬细胞内表达的人颗粒溶素对胞内结核分枝杆菌的杀菌活性

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)的真核表达质粒并探讨其表达后对巨噬细胞RAW264.7内结核分枝杆菌的杀菌能力.方法利用套式PCR从同种异型抗原激活的人CTL中扩增出GLS基因,并克隆入pBudCE4.1载体,构建重组质粒.将其转染至感染结核分枝杆菌H37Rv的巨噬细胞株RAW264.7中,套式PCR、免疫荧光检测GLS表达;转染96 h后裂解细胞作抗酸染色及菌落计数,检测GLS细胞内直接杀菌活性.数据行t或t'检验.结果成功构建携带GLS的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS;在转染的已感染H37Rv巨噬细胞株RAW264.7中,从转录和翻译水平都检测到目标基因GLS的表达产物;转染96 h,佛波酯+pBudCF4.1/GLS组、佛波酯+pBudCE4.1组与未激活初始巨噬细胞荷菌量分别为(1.44±1.25)、(3.16±0.20)和(3.59±0.21)个,两两比较,差异均有统计学意义(t=2.403,t=2.854,均P＜0.05).结论携带人GLS的真核表达质粒在巨噬细胞表达后具有明显的杀菌活性,为进一步作为结核基因治疗疫苗的应用提供了实验依据.