光动力效应致靶细胞线粒体损伤的机制研究

目的 探讨光动力效应对靶细胞线粒体损伤的发生机制.方法 先将血卟啉单甲醚与ECV304细胞共同孵育12h,采用荧光探针标记技术和细胞器-细胞荧光强度比值法对细胞内HMME进行亚细胞定位和定量分析.应用荧光显微镜汞灯照射以激发光敏剂产生光动力效应,并加入ROS探针H2DCF-DA检测单线态氧的产生.分别在光照前后采集线粒体及DCF的荧光图像并进行荧光强度的定量分析.结果 细胞总荧光光强在光照后较光照前降低26.4%;以细胞器光照前的平均荧光光强比值为基准,则光照后线粒体降低了31.1%.线粒体区域在单纯光照和有HMME存在情况下均检测到DCF荧光的增强.结论 光动力效应会引起线粒体内光敏剂发生一定程度的光漂白作用,表明线粒体内产生了一定数量的单线态氧,后者导致线粒体损伤.     

血啉甲醚和血卟啉衍生物在类风湿关节炎滑膜细胞中吸收特性的对比研究

目的：探讨体外培养的类风湿性关节炎（RA）患者的滑膜细胞对光敏剂血淋甲醚（HMME）的吸收特点,并与目前常用的光敏剂血卟啉衍生物（HpD)进行对比。方法：用荧光分光光度计法检测RA滑膜细胞对HMME、HpD的吸收量与孵育时间和孵育浓度的关系。结果：①RA滑膜细胞对HMME、HpD的吸收量随着孵育浓度的增加而增加。当培养液中光敏剂浓度达80μg/ml时,孵育1h细胞内HMME含量达到饱和状态;而HpD的浓度要到140μg/ml时细胞内的吸收量才达到高峰,当两种光敏剂细胞内浓度均达高峰时,HMME的含量为HpD含量的2倍。②细胞对两种光敏剂的吸收量亦随着孵育时间的增加而增加,HMME吸收得更快,第15分钟时吸收量为最大吸收量的52．9％,第60分钟为84．4％,细胞对HpD的吸收第15分钟为49．1％,第60分钟为69．2％。结论：与光敏剂HpD相比,RA滑膜细胞能更多更快地吸收HMME。推测HMME较HpD更适合用于光动力疗法滑膜切除术。     

质膜制备技术近况(综述)

细胞是生物体的基本结构和功能单位。所有细胞都有细胞膜(常称质膜)。真核细胞除质膜外还存在着细胞内膜系统构成的各种亚细胞结构、如线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、过氧化酶体和核膜等,这些膜结构(包括质膜)统称为生物膜。原核细胞没有线粒体、内质网、核膜,唯一的膜结构是质     

两种荧光显微成像系统采集细胞器探针荧光图像的对比研究

目的：应用荧光显微数码成像系统和共聚焦荧光显微成像系统采集细胞器探针图像的对比研究。方法：传代培养内皮细胞，将四种细胞器探针与细胞共同孵育不同时间。采用荧光显微镜、计算机及高分辨率数码CCD组成的荧光显微数码成像系统采集四种细胞器探针的荧光图像。同时应用激光共聚焦显微镜采集图像进行对比。结果：两种系统均可采集到细胞器荧光探针的图像；荧光显微数码成像系统采集的图像的特点为分辨率高，速度快，对细胞器的损伤小。结论：荧光显微数码成像系统在细胞器探针的荧光检测定位研究中准确可靠、方便实用。     

叶酸-聚乙烯亚胺复合碳点的跨膜机制和胞内分布

目的：探讨以叶酸和聚乙烯亚胺（PEI）为原料合成的荧光碳点跨MC3T3-E1细胞膜转运途径、胞内分布其对细胞的影响,并阐明其机制。方法：以叶酸和PEI为原料,通过水热法合成具有细胞成像功能的荧光碳点,采用MTT法筛选碳点的最佳使用浓度。将MC3T3-E1细胞分为空白对照组、叶酸组和碳点组,通过细胞周期、细胞凋亡和细胞活性氧（ROS）水平检测评估碳点的生物相容性;通过胞膜窖途径抑制剂制霉菌素、巨胞饮途径抑制剂诺考达唑的使用,探讨细胞摄取碳点的途径;利用碳点在紫外光激发下发射蓝色荧光的特点,通过各种细胞器探针进行荧光共定位以观察碳点在细胞内的分布。结果：与空白对照组比较,24 h时100~450mg·L^-1碳点组细胞增殖率明显升高（P<0.05）;在48h时,当碳点浓度达到350 mg·L^-1时,细胞增殖率仅有空白对照组的68.4%（P<0.05）。与空白对照组比较,碳点组G₀期和G₁期细胞比例明显下降（P<0.05）,S期细胞比例明显升高（P<0.05）;G₂期和M期细胞比例亦升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;与空白对照组比较,叶酸组和碳点组细胞凋亡率无明显改变（P>0.05）,但细胞内ROS水平明显降低（P<0.05）。与空白对照组比较,制霉菌素组细胞摄取碳点量减少（P<0.05）。倒置荧光显微镜观察,碳点的蓝色荧光与线粒体的红色荧光较好重叠,与溶酶体的红色荧光较好重叠,与内质网的红色荧光不完全重叠,与高尔基体的红色荧光重叠得较差。结论：碳点生物相容性较好,被细胞摄取后可以分布至细胞质的主要细胞器上,可作为一种非病毒载体应用到转基因治疗中。     

人宫颈癌HeLa细胞氧化损伤中溶酶体与线粒体损伤的时间顺序及其意义

目的: 探讨溶酶体及线粒体死亡途径在氧化应激诱导HeLa细胞凋亡过程中的时间顺序及其意义,阐明溶酶体膜通透性在氧化应激诱导线粒体凋亡过程中的重要作用。方法：以对数生长期人宫颈癌HeLa细胞作为研究对象,利用维生素K3（VK3）复制氧化应激模型,实验分为对照组、VK3 1 h、VK3 3 h、VK3 6 h和VK3 12 h作用组。MTT 法检测各组细胞生存率;′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色检测细胞内活性氧（ROS）水平,吖啶橙（AO）染色观察溶酶体膜通透性,罗丹明123染色检测线粒体膜电势(ΔΨm),Western blotting法检测凋亡相关蛋白caspase-3活化片段的表达。结果：与对照组比较,VK3 6和12 h组HeLa细胞生存率降低（P<0.05）。Western blotting法检测,与对照组比较,VK3 6和12 h组HeLa细胞内caspase-3活化片段表达水平增加（P<0.05）。DCFH-DA染色,VK3作用1、3及6 h
,HeLa细胞内绿色荧光增强。AO染色,VK3 3　h 和6 h组可见HeLa细胞的溶酶体内红色颗粒状荧光减弱,细胞浆绿色荧光增强。罗丹明123染色,VK3 6 h组可见HeLa细胞浆内红色荧光强度明显降低(提示ΔΨm下降)。结论：氧化损伤能够诱导溶酶体及线粒体死亡途径,并且溶酶体的变化先于线粒体,提示溶酶体通透性在氧化应激诱导线粒体凋亡过程中具有重要作用。
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内质网应激在对比剂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的:探讨内质网应激(ERS)在对比剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用及N-乙酰半胱氨酸(NAC)的保护作用。方法:将不同浓度(50,100,150mgI/ml)碘普罗胺分别加入体外培养的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中孵育1h;10mmol/L NAC预处理细胞1h后,加入100mgI/ml碘普罗胺共孵育1h。Hoechst-33342染色法检测肾小管上皮细胞凋亡率;荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的产生;Western印迹法检测细胞内内质网功能调节蛋白GRP78、内质网源性转录因子CHOP表达水平。结果:对比剂呈浓度依赖性诱导NRK-52E细胞凋亡,且呈浓度依赖性诱导NRK-52E细胞内ROS生成及GRP78、CHOP蛋白表达上调(P<0.05);经NAC预处理后,细胞内ROS生成及细胞凋亡率明显下降(P<0.05),且GRP78、CHOP蛋白表达下调(P<0.05)。结论:碘普罗胺能诱导肾小管上皮细胞凋亡,其机制可能与细胞内ROS生成增加,诱发ERS,上调GRP78、CHOP蛋白表达有关。抗氧化剂NAC通过降低NRK-52E细胞内ROS介导的ERS,减少肾小管上皮细胞凋亡。     

阿霉素在人白血病敏感细胞株HL-60和多药耐药细胞株HL-60／ADR的分布和积聚变化

目的 了解化疗药物阿霉素(ADR)在人白血病敏感细胞株HL-60和多药耐药细胞株HL-60／ADR细胞内的分布和积聚变化及其与耐药的关系。方法 应用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术研究ADR在细胞内的分布和积聚，以及维拉帕米、BSO、布雷菲尔得菌素、氯喹对细胞内ADR异常分布的影响。以3种特异染色线粒体、高尔基体和溶酶体的荧光物质Rhodaminel23、NBD-ceramide和中性红作为探针，鉴定分隔储留ADR的细胞器。结果 与ADR在HL-60细胞核、胞浆均匀分布不同，在HL60／ADR，ADR呈点棘状分布于细胞浆，核内ADR荧光很少。这种分布方式与NBD-ceramide荧光在该细胞的分布极为相似。BSO和布雷菲尔得菌素可逆转ADR在HL-60／ADR的异常分布和积聚，而维拉帕米和氯喹无此作用。结论 ADR在耐药细胞的异常分布和积聚与肿瘤细胞耐药的形成有关。     

基于罗丹明B类荧光探针的Fe3+细胞成像研究

目的:构建一种基于罗丹明B为母体的新型荧光探针,考查其作为荧光探针P的光学性能,发展适合于分析检测细胞内Fe3+的可视化成像分析的荧光探针法.方法:RAW细胞中加入20 μmol/LFe3+孵育30 min后,再在该培养液中加入20 μmol/L探针P,37℃下继续孵育30 min,559 nm激发,收集570～670 nm波段内的荧光信号.结果:探针能够实现对细胞内Fe3+的可视化成像分析.结论:本方法探针容易制备,分析速度快,可实现结果的可视化观测.     

微波辐射非热效应对A549细胞损伤反应的研究

目的研究探讨微波辐射的非热效应对人肺癌A549细胞损伤的反应,以期为微波治疗肿瘤提供更全面的理论依据。方法采用剂量为100W（12mv/cm2）、150W（18mv/cm2）和200W（21mv/cm2）的微波辐射冰浴方法制备的非热效应细胞模型10min;24h后收集细胞,以Western印迹方法分析细胞Cytochromec、Caspase-3,GRP78、Caspase-4,CathepsinD的表达;MDC染色、激光共聚焦显微镜观察细胞溶酶体变化。结果辐射后A549细胞Cytochromec、GRP78蛋白表达增加,并且凋亡相关蛋白Caspase-3,Caspase-4活化;细胞溶酶体活性增强表现为CathepsinD表达增加以及MDC染色荧光强度加强。结论微波辐射非热效应对组织细胞所造成的损伤反应可能是通过细胞线粒体、内质网和溶酶体途径共同所诱导的细胞凋亡,为微波治疗肿瘤提供新的思考方向。