Survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7 survivin及HSP70表达的影响

目的探讨survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7survivin、HSP70表达的影响。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF7,将已构建的真核表达载体(pIRES2-EGFP-survivin siRNA、pIRES2-EGFP-HSP70)用脂质体介导转染MCF7细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过western-blot、RT-PCR检测转染后细胞中HSP70蛋白、survivin蛋白及survivinmRNA表达的变化。结果转染空载体与转染真核表达载体的乳腺癌细胞株MCF7于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,证实转染成功。转染真核表达载体的MCF7细胞与转染空载体的MCF7细胞和未转染的MCF7细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高。结论 survivin siRNA能有效抑制MCF7细胞内源survivin基因的表达,HSP70能上调MCF7细胞HSP70蛋白的表达,为进一步深入研究survivin siRNA、HSP70双基因对乳腺癌细胞株MCF7生物学特性的影响奠定实验基础。     

Ei sh单纯疱疹病毒1型ICP34.5在Vero细胞的 表达及对Bax/Bcl-2的影响

摘要:目的　构建单纯疱疹病毒1 型（HSV-1）真核表达载体pmR-mcherry-ICP34.5,验证ICP34.5对宿主细胞Bax、Bcl-2 mRNA相对表达量及对Bax/Bcl-2的影响。方法　以提取HSV-1病毒DNA为模版,PCR扩增HSV-1 ICP34.5序列,双酶切连接至pmR-mcherry真核表达载体上,并对重组真核表达载体进行验证,然后重组载体瞬时转染Vero细胞,mRNA水平表达用逆转录PCR方法检测,融合蛋白的表达的检测用荧光显微镜,MTT检测对Vero的细胞活性,喜树碱诱导凋亡后,实时定量PCR检测Bax、Bcl-2 mRNA在细胞中的相对表达量。结果　转染后RT-PCR 验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用,转染重组质粒的Vero细胞和正常细胞的中Bax mRNA表达量和Bcl-2 mRNA表达量相差不大,但Bax/Bcl-2得比值明显低于转染pmR-mcherry空质粒的Vero细胞和正常加药的Vero细胞。结论　pmR-mcherry-ICP34.5 真核表达载体能在Vero细胞中高效表达,并能减弱空质粒转染对细胞活性作用,ICP34.5能使Vero细胞中Bax/Bcl-2稳定性增强,使细胞抗凋亡。     

CyclinE干扰RNA对大鼠PC12细胞增值的影响

目的利用脂质体法转染CyclinE的干扰RNA真核表达载体,然后检测细胞的增值速率,探讨CyclinE在神经细胞中的作用,为帕金森病的研究提供有价值的资料。方法 1.利用脂质体法转染CyclinE的干扰RNA真核表达载体,用倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达量。2.利用MTT法检测转染后细胞的增值速率。结果 1.倒置荧光显微镜观察显示,成功的转染了CyclinE的干扰RNA真核表达载体。2.MTT法检测显示,转染组细胞的增值速率明显低于未转染组和阴性对照组。结论 RNA干扰CyclinE后使得PC12细胞的增值速率减慢。     

HPV16E6真核表达载体的构建及其在CaSki细胞中的表达及定位

目的:构建pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,转染CaSki细胞,检测其在CaSki细胞中的表达。方法:用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上,通过脂质体将pEGFP-C2-HPV16E6转染入CaSki细胞。结果:pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体构建成功,转染CaSki细胞48h后经RT-PCR及Western-blot检测可见HPV16E6蛋白的高表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白主要在CaSki细胞核内表达。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,为进一步对HPV16E6的研究奠定了基础。     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

miR-29c真核表达载体构建及鉴定

目的构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c真核表达载体,为进一步研究miR-29c的功能和靶基因鉴定奠定基础。方法根据miR-29c成熟体序列设计合成1对miRNA寡聚单链DNA,经退火后克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中,瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经实时荧光定量PCR检测pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c在肺癌细胞中表达miR-29c。结果 A549转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c 24 h后,miR-29c表达量上升,明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c,并能有效表达miR-29c。     

miR-145真核表达载体的构建及表达

目的构建miR-145的真核表达载体,为研究miR-145在结肠癌中的生物学功能奠定基础。方法设计并应用PCR扩增miR-145基因片段,将其导入真核表达载体pCMV-myc中构建重组质粒pCMV-miR-145后,将重组质粒转染入结肠癌细胞系HCT116中,运用RT-PCR检测miR-145的表达情况。结果酶切及DNA测序证实miR-145被正确克隆入真核表达载体pCMV-myc中,该重组质粒能在HCT-116细胞中高效表达miR-145。结论成功构建了miR-145的真核表达载体pCMV-miR-145,该载体能有效高表达miR-145。     

miR-19b下调大鼠H9c2心肌细胞Kir2.1蛋白表达

目的:检测miR-19b对大鼠H9c2心肌细胞Kir2.1表达的影响,探讨miRNA参与房颤发生发展的机制。方法:培养大鼠H9c2心肌细胞,构建miR-19b过表达质粒、miR-19b干扰质粒、阴性序列质粒,通过慢病毒载体感染大鼠H9c2心肌细胞;倒置荧光显微镜观察感染效率,qRT-PCR检测H9c2细胞中miR-19b mRNA表达水平。qRT-PCR检测H9c2细胞中Kir2.1mRNA水平。Western blot检测H9c2细胞中Kir2.1蛋白表达水平。结果:miR-19b慢病毒载体成功感染H9c2细胞;qRT-PCR检测,与阴性序列组相比,miR-19b过表达组Kir2.1 mRNA表达水平降低,miR-19b干扰组Kir2.1 mRNA表达水平升高;Western blot检测,与阴性序列质粒组相比,miR-19b过表达组Kir2.1蛋白表达水平降低,miR-19b干扰组Kir2.1蛋白表达水平升高。结论:miR-19b抑制KCNJ2的转录,下调Kir2.1蛋白表达,提示mi-19b可能参与房颤的发生发展。     

靶向Nrf2基因microRNA表达载体构建及初筛

目的 利用真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP miR载体构建针对人Nrf2基因的微小RNA( microRNA)真核表达载体,为研究Nrf2基因在化学物毒作用提供参考依据.方法 设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列,构建重组载体并命名为pcDNA-Nrf2-A、pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcDNA-Nrf2-D,转染人乳腺癌MCF-7细胞;通过荧光显微镜观察绿色荧光监测转染效率,转染48 h后用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测瞬时转染细胞Nrf2基因mRNA和蛋白的表达变化观察沉默作用来初筛有效的重组载体.结果 成功构建miRNA真核表达载体pcDNA-Nrf2;转染效率约为20% ～40%;瞬时转染重组质粒48 h后,与空白对照和阴性对照质粒比较,pcDNA-Nrf2-A Nrf2 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05);pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcDNA-Nrf2-D mRNA表达降低,差异有统计学意义(P ＜0.001),pcDNA-Nrf2-C抑制Nrf2基因mRNA表达强于pcDNA-Nrf2-D(P ＜0.05).结论 成功构建了Nrf2的microRNA表达载体pcDNA-Nrf2-C,可作为进一步研究Nrf2基因功能的工具.     

Livin靶向RNA干扰对人胃癌细胞SGC7901细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin靶向RNA干扰对SGC7901细胞株生物学特性的影响,探索胃癌基因治疗的新途径。方法设计和构建Livin特异性的siRNA真核表达载体,转染SGC7901细胞,应用RT-PCR分析LivinmRNA的表达情况,采用MTT法检测细胞的生长状况,通过流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。结果构建真核表达载体p-siRNA1并转染SGC7901细胞后,RT-PCR结果显示2条Livin siRNA真核表达质粒均能有效抑制Livin mRNA的转录表达,干扰组细胞与未转染组细胞比较,生长受到明显抑制,凋亡率明显增加。结论成功构建了Livin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人胃癌细胞Livin mRNA表达,并抑制胃癌细胞生长,促进其凋亡。     

细胞穿透肽CCL融合蛋白的构建与表达

目的评估细胞穿透肽CCL融合蛋白构建的可能性。方法将CCL6 PEP 6XHis构建至pABP质粒，然后提取pABP CCL6 PEP质粒进行人胚肾HEK293细胞转染表达，以及CCL6 PEP 6XHis 蛋白层析纯化和检测。结果成功构建并纯化细胞穿透肽CCL融合蛋白。将CCL6 PEP 6XHis Tag 基因经PCR扩增、接入T 载体、克隆、培养，并提取质粒进行测序鉴定，所得序列与目的基因一致。成功将CCL6 PEP 6XHis基因构建至哺乳动物细胞表达载体pABP 中，经质粒提取和酶切鉴定，电泳结果显示，HindⅢ + XbaⅠ切出约430 bp的条带，符合预期，酶切鉴定正确。蛋白质印迹法（Western Blot）检测结果阳性，表明纯化得到的目标蛋白带有hisx6标签。结论细胞穿透肽CCL融合蛋白能够人工构建，并通过真核细胞进行表达。     

霍乱毒素B亚单位在乳酸乳球菌食品级表达系统中的分泌性表达

目的 在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)食品级分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ和L.lactis MBP71/pSQ中克隆表达霍乱毒素B亚单位(CTB),实现CTB的分泌性表达.方法 采用PCR扩增霍乱弧菌569B菌株染色体中CTB蛋白编码基因片段,克隆到食品级分泌表达载体pSQZ和pSQ中,转化入宿主菌L.lactis MBP71,构建CTB的分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB;采用Western-blot检测重组菌株中CTB的表达及表达量.结果 PCR扩增得到CTB编码基因片段ctB,酶切、连接到载体pSQZ和pSQ并转化到宿主菌L.lactis MBP71中,构建了分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB.Western-blot检测发现,L.lactis MBP71/pSQ-ctB和L.lactis MBP71/pSQZ-ctB系统均能分泌性表达CTB,L.lactis MBP71/pSQ-ctB上清的表达量约为2 μg/ml;L.lactis MBP71/pSQ-ctB的表达效率远远高于L.lactis MBP71/pSQZ-ctB.结论 成功实现了CTB在食品级表达系统中的分泌性表达.     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：采用基因工程技术，将转化生长因子B前体相关蛋白（LAP）通过基质金属蛋白酶（MMP）水解部位与人可溶性TNFI型受体（hsTNFRI）连接，构建pcDNA3，1／LAP-MMP-hs TNFRI融合蛋白真核表达载体，获得LAP-MMP-hsTNFRI融合蛋白。方法：将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），得到pcDNA3．1／MMP重组体；将TGF-β1的LAP段和hsTNFRI与MMP水解部位连接，获得pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI真核表达载体。测序鉴定后，脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果：酶切及测序结果证实pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI重组载体构建成功，转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论：成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3，1／LAP-MMP-hsTNFRI，并获得融合基因的瞬时表达，为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

The child's art expression

The child's art expression deals with the artistic expression of characteristics of the child as they relate to the world. The visual-haptic theory is explored as is the baseline theory and its extension, the inside-out expression, the fold-over picture, the upside down depiction and the front view-top view display. The visual-tactual physical experience is expressed in its transference to a two-dimensional surface in artistic form. The relationship of the physical environment to the child's inner world is a significant factor in the child's growth pattern.     

Facial expression accompanying pain

The study of facial expression accompanying pain is of both practical and theoretical importance. It has been suggested that nonverbal behavior may provide accurate information on pain states to supplement self-report and that perhaps facial expressions could even serve as accurate measures of pain in the absence of verbal report. Recent studies of specific facial expressions accompanying pain have benefited greatly from the techniques and findings of earlier research on facial expressions of emotion. These research findings also raise a number of questions concerning relationships between pain and emotion expressions, and provide some tools (e.g. direct facial measurement systems) for answering them. A review of empirical research indicates that there are distinct facial expressions which accompany acute painful experiences with some regularity, and that these expressions occur in both infants and adults, at least in Western cultures. Important areas for future research include cross-cultural studies, investigations of the circumstances under which these facial expressions occur and the possibilities for masking or falsifying them and research into facial behaviors related to chronic pain.