复合支架材料构建组织工程骨修复兔颅骨缺损

目的观察以胶原缓释重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）及珊瑚构建的组织工程骨修复颅骨缺损的能力，明确复合BMSCs的组织工程骨修复颅骨缺损后新骨的来源。方法构建三种复合支架材料：（1）rhBMP-2／珊瑚；（2）胶原/rhBMP-2／珊瑚；（3）BMSCs／胶原／rhBMP-2／珊瑚。将其分别植入兔颅骨缺损处，8周和16周后采用X线片、HE染色、Masson三色染色法、荧光显微镜等观察比较骨缺损修复的情况。通过BrdU标记BMSCs及免疫组化染色方法证实新骨的来源。结果BMSCs／胶原/rhBMP-2／珊瑚组材料修复颅骨缺损的能力最强，且与自体髂骨修复的情况相近；胶原／rhBMP-2／珊瑚组材料次之，rhBMP-2／珊瑚组材料成骨能力较弱。BMSCs参与了新骨组织的形成，新骨组织部分来源于经诱导的BMSCs。结论胶原是rhBMP-2适宜的缓释载体，胶原及BMSCs对促进复合支架材料修复骨缺损有重要意义。BMSCs／胶原／rhBMP-2／珊瑚构建的组织工程骨可成为一种良好的骨缺损修复材料．     

rhBMP-2/明胶复合材料修复犬长骨节段性骨缺损的实验研究

目的 观察重组人骨形态发生蛋白－2（rhBMP-2)／明胶复合修复犬长骨节段性骨缺损的能力，检验rhBMP-2的诱导成骨活性。方法 手术造成20mm桡骨中上段骨缺损，实验组植入含2.0mg的rhBMP-2的复合材料片，对照组植入单纯明胶片。通过影像学、组织学观察及骨密度测定，评价rhBMP-2／明胶复合材料修复犬长骨节段性骨缺损的效果。结果 影像学检查示实验组术后12周时骨痂将缺损桥接，术后24周时达到皮质骨连接；对照组无骨痂形成。组织学检查示实验组术后12周时骨痂外层为板层骨，中央为编织骨，内有骨髓组织，术后24周时骨痂外层为皮质骨，中央为髓腔组织；对照组为纤维连接。骨密度测定示术后12周时骨痂密度达到正常值的79％，24周时达到正常值的88％。结论 rhBMP-2/明胶复合材料具有良好的诱导成骨活性作用，2.0mg的rhBMP－2能够很好的修复犬桡骨20mm的骨缺损。     

多孔β-磷酸三钙修复骨缺损的实验研究

目的 制备主要成分为β-磷酸三钙(β-TCP)的多孔颗粒并探讨其修复骨缺损和作为骨组织T程支架材料的可行性.方法 健康牛松质骨经脱细胞、脱脂处理后在高温下经2次煅烧制备主要成分为β-TCP的脱有机质骨多孔颗粒,在兔股骨髁制作包容性骨缺损模型并采用多孔β-TCP修复骨缺损.术后4、8、12周取材并采用X线检查、钼靶照相、荧光标记和组织学染色方法观察骨修复效果.结果 主要成分为β-TCP脱有机质骨多孔颗粒保持天然松质骨的孔隙结构,植入骨缺损后外形保持完整.术后4周材料与周边组织紧密结合,新生骨组织长入β-TCP孔隙内,原有骨缺损部位界限清楚,植入材料无明显吸收变小,中心部位无软组织或骨组织长入.植入8周β-TCP周边组织进一步向内部生长.β-TCP中心部位新生成的骨组织较少.植入12周β-TCP被周边新生骨组织严密包裹,且与新生骨组织界限模糊,植人材料部分吸收变小,新生骨小梁增多增厚并长入植入材料内部,但新骨形成量及形成速度降低.组织学检查显示β-TCP降解缓慢.结论 多孔β-TCP修复包容性骨缺损具有优良的成骨性能,可作为一种骨组织工程多孔支架材料,但需要改善其降解速度.     

胎儿骨髓间充质干细胞复合PLGA支架的形态学观察

目的：探讨胎儿骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenchymal stem cens,fBMSCs)与低热高压法制作的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)支架材料复合培养,构建组织工程化骨的可行性。方法：预制PLGA支架材料,取5月胎儿肱骨和股骨骨髓,用单核细胞分离液分离fBMSCs,含双抗的低糖DMEM原代和传代培养,侄置显微镜下观察细胞生物学特性,用FITC标记的抗CD105、CD44和用PE标记的抗CD34、CD29对第4代细胞进行流式细胞鉴定,并与PLGA支架材料复合培养1周后行扫描电镜观察。结果：原代及传代培养的fBMSCs增殖较迅速,第4代CD105阳性细胞占84．08％,CD29阳性细胞占88．77％,CD44阳性细胞占89．53％。复合PLGA支架材料细胞生长状态良好。结论：骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenehymal stem cells,fBMSCs)是骨组织工程适宜的种子细胞,与低热高压制作的PLGA支架材料复合可体外构建组织工程骨。     

仿生活性人工骨诱导兔椎板间多节段脊柱融合的研究

目的探讨采用先进快速成形(rapidprototyping,RP)制造技术结合骨组织工程方法研制新型仿生活性人工骨,系统研究该人工骨在兔腰椎椎板间多节段脊柱融合的情况。方法首先应用RP技术制备粒度均匀的颗粒型聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙[Poly(DL-lactic-co-glycolicacid)/Tricalciumphosphate,PLGA/TCP]复合人工骨载体材料,进一步将该载体材料与天然提取牛骨形态发生蛋白(bovinebonemorphogeneticprotein,bBMP)高效复合制备仿生活性人工骨,扫描电镜观察RP制备的载体材料及人工骨超微结构。雄性新西兰兔42只,均于L2～4左侧椎板及椎小关节表面分别植入颗粒型PLGA/TCP人工载体材料(A组)、颗粒型仿生活性人工骨(B组)和自体髂骨颗粒(C组),每组14只,于术后4,8和12周定期拍摄脊柱X线片,并于以上时相点按时取材(每组各取材2,2和10只兔),大体观察、手法检测及组织学方法(HE染色、三色光镜观察及四环素-钙黄绿素荧光检测)系统评价脊柱融合情况。结果先进RP制备的PLGA/TCP复合人工骨载体具有规则的空间网状支架结构、相互贯通的孔隙及材料表面微孔特征,均有利于bBMP的高效均匀复合。术后所有实验动物均存活,A组单纯载体材料植入后逐渐降解,但无骨诱导活性及新骨形成能力。B组仿生活性人工骨植入具有强的诱骨活性及骨性融合能力,不仅成骨早、新骨形成量大,而且在新骨形成及改塑的同时载体材料逐渐降解完全,术后12周可形成较为典型的骨小梁及骨髓结构,成骨代谢活性亦接近正常,所形成融合块较大、强度高。C组自体髂骨移植能达到良好的骨性融合,但至术后12周其所形成的新骨结构与B组相比,尚需进一步塑形及完善,所形成的融合块较小。术后12周,三组多节段(L2,3、L3,4)脊柱融合率分别为0%(0/20)、90%(18/20)和55%(11/20),B组融合率显著高于C组(P<0.05),C组融合率显著高于A组(P<0.01)。结论先进RP技术制备的PLGA/TCP人工载体不仅具有良好的空间超微结构及孔隙特性,而且能高效复合bBMP以正确构建组织工程仿生活性人工骨。该仿生活性人工骨诱导兔椎板间多节段的脊柱融合获得成功,其融合率明显高于自体髂骨移植,从而有望成为脊柱外科所需的新型人工骨移植材料。中、远期疗效的深入研究有待进一步开展。     

转染骨形态发生蛋白-2基因的人骨髓间质干细胞复合异种骨支架异位成骨的效果

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)罐因转染的人骨髓间质干细胞复合异种骨支架异位成骨效果。方法 分组：(1)BMP-2基因转染细胞 异种骨支架[去抗原牛松质骨(BCB)]；(2)对照基因转染细胞 BCB；(3)未转染细胞 重组BMP-2 BCB；(4)未转染细胞 BCB；(5)BCB。分别将各组人工骨植入裸鼠皮下，于术后4，8周行组织学观察．结果 体内植入后3d，细胞持续表达外源基因BMP-2基因转染组8周时完全由新形成的编织骨构成，血管丰富。结论 BMP-2基因转染后细胞复合BCB支架，可以在异位形成骨组织并诱导毛细血管长入。     

杂化改性后快速成型支架对骨缺损修复的实验研究

目的 观察以PLGA／β-TCP为原材料，快速成型方法制备的支架为骨架，采用胶原杂化及表面磷灰石沉积对其进行改性的新型骨组织工程材料对骨缺损的修复效果。方法 使用骨髓基质干细胞（BM-SCs）分别与改性前后支架复合，对兔桡骨缺损进行修复。通过X-ray、MicroCT形态学及组织切片病理学，观察改性前后材料降解、新骨生成情况。结果 改性后材料的降解及骨缺损修复能力较改性前有显著性提高，修复1年后改性组骨缺损完全修复。结论 采用胶原杂化及磷灰石表面沉积改性后的PLGA／β-TCP快速成型支架可作为3-D支架应用于骨组织工程。     

聚乳酸-羟基乙酸／磷酸三钙人工骨的体外构建

目的体外构建兔骨髓间充质干细胞与聚乳酸一羟基乙酸（PLGA）／磷酸三钙（TCP）及PLGA支架材料的复合体,初步评价人工骨构建效果。方法股骨骨穿获得兔骨髓,传代至3～4代,成骨诱导后进行成骨性能检测。同时转染腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）后分别与PLGA及PLGA／TCP支架材料复合,采用激光扫描共聚焦显微镜和扫描电子显微镜对细肜支架复合物进行形态学观察。结果与结论种子细胞在两种支架上均可黏附、生长：PLGA／TCP复合支架材料较PLGA更有利于细胞生长,为下一步兔自体骨缺损修复提供了良好的实验基础。     

天然珊瑚和同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程支架的组织相容性研究

目的：评价天然滨珊瑚(NC)和同种异体脱钙骨(DBM)的组织相容性，探讨其作为骨组织工程支架的可行性。方法：将NC和DBM直接植入动物体内，术后1、2、6周取材，通过大体观察和组织学检查观察生物材料在体内组织反应。结果：两种材料均未引起明显的炎症和排斥反应，对实验动物无不良影响。同时发现DBM组诱导出少量骨组织，NC组未见新生骨。结论：NC和DBM具有良好的组织相容性，DBM还具有鲁诱导性，两种材料可能都是比较理想的骨组织工程支架材料。     

聚D,L-乳酸多孔支架的体外相容性研究

目的 评估聚D,L-乳酸(PDLLA)三维多孔支架的体外细胞相容性,探讨其作为骨组织工程支架类材料的可行性,为进一步进行体内试验提供依据.方法 将分离、获取的第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs)按随机数字表法分成5组(0,3,6,9,12周组),分别用含体积分数20％降解液(0,3,6,9,12周时的PDLLA降解液)的细胞培养液和成骨诱导分化培养液进行细胞培养(以不含有降解液的细胞培养液或者成骨诱导分化培养液培养组为对照组,即0周组),从BMSCs的毒性、活力、成骨分化能力等方面定量评估PDLLA支架材料的细胞相容性;将分离、获取的第3代BMSCs种植于PDLLA支架材料上,定期进行扫描电子显微镜观察,从不同时相点细胞在PDLLA材料表面的生长情况定性评估PDLLA支架材料的细胞相容性. 结果 各组与对照组比较均未发现对细胞具有明显的毒性作用;各组均未发现对细胞的活力具有明显的负面影响(t3=-0.441,P=0.671;t6=1.596,P=0.154;t9=-0.492,P=0.636;t12=-1.135,P=0.283);各组细胞ALP染色和钙结节染色结果均表现为阳性,ALP活性定量检测和Ⅰ型胶原蛋白表达的定量检测与对照组之间差异均无统计学意义.扫描电镜结果显示,BMSCs在PDLLA三维多孔支架材料上呈现较好的贴壁生长.结论 PDLLA支架材料对BMSCs具有较好的体外相容性,可以作为一种骨组织工程支架类材料进行后续的体内试验.     

重组人BMP-2聚乳酸缓释纳米微球对体外培养兔成骨细胞增殖和矿化的影响

目的 观察重组人骨形态发生蛋白-2聚乳酸纳米微球缓释系统(rhBMP-2-PLA-Ns)对体外培养的兔成骨细胞的生物学效应. 方法 体外培养兔成骨细胞并鉴定,将rhBMP-2-PLA-Ns和第3代成骨细胞一起培养,免疫荧光法检测成骨细胞核中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,茜素红染色方法观察矿化结节的形成,Western blot检测rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞自分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用,并与单纯rhBMP-2组和空白组进行比较. 结果 培养5 d后,各组PCNA阳性细胞差异无统计学意义.培养10 d后,rhBMP-2-PLA-Ns组阳性细胞数明显高于单纯rhBMP-2组和空白组,表明rhBMP-PLA-Ns能够明显促进PCNA在成骨细胞核中的表达.与其他两组比较,rhBMP-2-PLA-Ns能显著促进矿化结节的形成(P<0.05);对Western blot检测结果进行半定量分析显示:三组成骨细胞均有VEGF的自分泌,加入rhBMP-2-PLA-Ns成骨细胞自分泌VEGF的量超过单纯rhBMP-2组以及空白对照组(P<0.05).结论 rhBMP-PLA-Ns有较好的生物学活性,能促进成骨细胞的增殖、矿化和VEGF自分泌的增加,具有一定的临床应用价值,为加快骨创伤的愈合提供了新的思路.     

支架材料聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙的细胞毒性检测

目的 检测新型支架材料——聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙( PLGA/TCP)的细胞毒性.方法 采用扫描电子显微镜观察PLGA/TCP支架材料的表面及内部结构,并选用小鼠L929细胞株,用MTT法体外检测PLGA/TCP复合体的细胞毒性,与已被美国FDA批准应用于临床的PLGA支架材料进行比较.结果 扫描电镜下PLGA/ ...     

骨形成蛋白缓释生物膜的临床应用

目的 观察骨形成蛋白缓释生物膜在活髓保存治疗中的效果。方法 以聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）为缓释载体，骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）为主药，并添加适量的甲硝唑制成膜（实验组）。与成品氨氧化钙糊剂（对照组），分别用于盖髓术，观察其疗效。结果 应用BMP缓释生物膜经过1、3、6个月的组织学及X线片检查，可见1个月时牙本质桥形成，6个月时，临床治愈率达97．05％，而氢氧化钙糊剂的治愈率是92．86％，但无统计意义。结论 BMP缓释生物膜盖髓的临床效果不低于氢氧化钙。而且操作简便、快捷，可为新一代生物盖髓剂的开发运用打下基础。     

以PLGA为支架的组织工程脂肪的实验研究

目的：研究以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料的可行性。方法：实验组：取兔的脂肪间充质干细胞，行体外扩增培养至第3代，达到一定数量后成脂诱导1周，接种于PLGA支架上，继续诱导1周，置于兔背部肩胛骨两侧皮下，分别于4、8周从大体和组织学方面观察脂肪形成情况；对照组：单纯以未接种细胞的支架移植于兔背部肩胛骨两侧皮下，于相同时间点进行检测。结果：实验组植入4周后，该复合物在支架中有脂肪形成，并可见细胞突入支架材料中；8周后支架材料继续降解，脂肪组织形成明显，伴有少量血管长入。对照组支架材料逐渐崩解，未见脂肪组织形成。结论：以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料提供了一个好的思路。     

PLGA微米与纳米载药颗粒用于药物携带与递送的比较研究

 

目的 通过评价聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid copolymer,PLGA)微米颗粒(micron particle,MP)与纳米颗粒(nanoparticle,NP)的表面特征、载药能力、药物缓释能力及细胞吞噬能力等方面来比较阐述PLGA纳米与微米颗粒在细胞预处理与修饰中的合理应用。方法 分别制备PLGA纳米颗粒与微米颗粒,并进行表征;随后,比较其载药能力,并对药物的释放特征进行测定;最后,在不同时间点通过荧光强度评价两种颗粒与细胞结合或进入细胞的能力。结果 所制备的纳米粒与微米颗粒粒径分别分布在200~300 nm和2~4 μm;两种颗粒载药量相当,分别为14.3%和14.1%;在药物缓释方面,纳米颗粒存在显著的早期突释现象;微米颗粒释放缓慢,持续缓释可达一周左右;粒径相对小的纳米粒更容易进入或与细胞结合,共孵育12 h即达到最大值,微米颗粒相对较慢,最大值出现在共孵育24 h后。结论 PLGA纳米颗粒作为药物载体更适合于急性组织或细胞保护,微米颗粒更适合于慢性持续性保护。

     

载VEGF肝素化HA-TCP明胶支架的理化性能及其生物学效应初步评价

 目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)肝素化羟基磷灰石-磷酸三钙(HA-TCP)明胶支架的结构及理化性能,评估其对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)诱导分化作用。方法 将肝素结合到HA-TCP明胶支架上,检测支架的物理结构和机械性能;对不同肝素浓度的支架进行吸水率、VEGF负载、抑菌能力及骨髓间充质干细胞(BMSC)生长实验分析,来初步评价肝素化HA-TCP明胶支架的性能。结果 载VEGF肝素化HA-TCP明胶支架呈淡黄色,孔隙丰富,孔径范围100~400 μm,比表面积1.01±0.06 m²/g,平均介孔25.96 nm,弹性模量0.93 MPa,最大压缩强度2.40 MPa;三组HA-TCP明胶支架吸水率无明显差异,肝素化支架组比空白支架组有更好的VEGF结合、缓释能力(P<0.05),高浓度肝素组比低浓度肝素组能保持更久的VEGF活性浓度和抗菌能力(P<0.05)。BMSCs在支架上呈片状、岛状分布,肝素化支架组的细胞增殖活性明显强于空白组(P<0.05),产生更多的钙结节。结论 载VEGF肝素化HA-TCP明胶支架具有良好的理化性能;肝素化可提高支架的VEGF负载和释放能力、抑菌能力,促进BMSCs增殖和成骨分化,是一种有应用前景的骨组织工程材料。     

rhBMP-2对兔下颌骨牵引成骨的影响及BMP-4的表达

 目的 通过观察兔下颌骨牵引成骨过程,探讨不同剂量重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)在不同时间对成骨区新骨生成的影响及其BMP-4的表达.方法 日本大耳白兔48只行单侧下颌骨牵引,分别将不同剂量 rhBMP-2胶原复合物植入骨切开处,间歇期5 d,牵引速度0.4 mm/d,2/d,共牵引5 d.用免疫组化方法观察牵引成骨新骨生成区BMP-4在固定1、7、14、28 d时的表达及新骨生成情况.结果 随着稳定期延长,牵引间隙内新骨逐渐生成.1.5 mg BMP-2剂量组的新骨生成优于对照组,3 mg BMP-2剂量组的新骨组织在同一时期内最多.BMP-4主要定位于成骨细胞和软骨细胞中,表达高峰出现在稳定期的1、7 d,此后逐渐下降,第28天阳性表达微弱.结论 rhBMP-2能促进牵引成骨,并具有浓度依赖性,BMP-4可能在牵引成骨的早期发挥重要作用.     

GM—CSF和rhBM—2m对小鼠急性放射损伤治疗作用的对？…

目的　研究和比较重组人骨形成蛋白 (rhBMP 2m)、GM CSF对照射后小鼠造血损伤的修复作用。方法　rhBMP 2m用分子生物学方法由大肠杆菌中获得 ;该实验中rhBMP 2m对照射后动物的影响 ,通过观察动物的 30天活存率表示。结果　照射对照组小鼠的 30天活存率为 0 ,平均活存天数为 (9 1± 2 2 )d ;GM SCF治疗组小鼠的 30天活存率为 2 0 0 % ,平均活存天数为 (1 1 5±1 9)d ,rhBMP 2m治疗组小鼠的 30天活存数为 4 ,活存率为 40 % ,平均活存天数为 (1 3 2± 6 1 )d。结果显示GM CSF和rhBMP 2m均能提高受照小鼠的活存率 ,并延长活存时间 ,而且后者优于前者(P <0 0 5)。结论　rhBMP 2m对小鼠急性放射损伤具有治疗作用 ,初步观察其优于GM CSF