将成人神经祖细胞重编程为诱导多能干细胞

Since an effective method for generating human neural precursor (NP) cells induced iPS cells can offer us a promising tool for studying human brain diseases, here we report direct reprogramming of adult human NP cells into iPS cells by retroviral transduction using four defined factors. NP cells were successfully isolated and cultured from the hippocampus tissue of epilepsy patients. When combined with four factors (Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc), iPS cell colonies were successfully obtained. Morphology, gene expression, and epigenetic status confirmed that these hNP-derived iPS cells exhibited ESC-like properties, including the ability to differentiate into all three germ layers both in vitro and in teratomas. Hence, our optimized method would be useful for generating human iPS cells from hNP cells and provide an important tool for studying neural system diseases.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

诱导神经干细胞的研究进展及应用前景

诱导神经干细胞(induced neural stem cells,i NSCs)是通过在成体细胞内转入特定外源因子而获得。目前主要有两种途径获得i NSCs,即直接诱导法和间接诱导法(需经历重编程过程中不稳定的中间状态)。与诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)比较,i NSCs直接将成体细胞重编程为神经干细胞,而不经过i PSCs再分化为神经干细胞,可减少其致瘤性,缩短诱导周期,提高转分化效率,这将使其更适于临床应用。本文就i NSCs的研究进展,应用前景加以综述。     

两种重编程系统诱导人牙源性多潜能干细胞的对比研究

目的：对比研究两种人牙源性多潜能干细胞重编程体系的特点。方法分别利用 STEMCCA 慢病毒／饲养层和仙台病毒／基质胶两种重编程系统,将人根尖乳头干细胞重编程为 iPS 细胞,比较两种方法的诱导效率、诱导工作量、iPS 细胞非整倍体核型比例、外源性基因消除难易程度等情况。结果 STEMCCA 重编程体系需要制备饲养层细胞 MEF,重编程效率约为0．1％,后期经 Cre-Loxp 酶切技术可得到无外源性转录基因的 iPS 细胞。仙台病毒重编程体系为无饲养层培养,基质胶制备方便、标准统一,重编程效率约为0．7％,明显高于 STEMCCA 系统（P ＜0．05）,外源性病毒和转录基因经自然传代后逐渐消除。结论与 STEMCCA 系统相比,仙台病毒／基质胶体系更适于人牙源性 iPS 细胞的诱导。     

Induction of dental pulp-derived induced pluripotent stem cells in the absence of c-Myc for differentiation into neuron-like cells

BackgroundA recent research breakthrough has demonstrated that the ectopic expression of four genes is sufficient to reprogram human fibroblasts into inducible pluripotent stem cells (iPSCs). However, whether human dental pulp cells (DPCs) could be reprogrammed into iPSCs remains an open question. In this study, we demonstrated that DPCs from deciduous and permanent teeth can be reprogrammed into iPSCs without c-Myc and had the capacity to differentiate into neuron-like cells.MethodsDPCs were obtained from donors and reprogrammed into iPSCs using retroviral transduction with SOX2, OCT4, and KLF4. Then, these iPSCs were differentiated into neuron-like cells. Microarray and bioinformatics were used to compare the gene expression profile among these iPSCs and iPSC-derived neuron-like cells.ResultsThe DPCs displayed a high vitality and capability to quickly restart proliferation and expressed elevated pluripotency similar to mesenchymal stem cells. According to our results, DPC-derived iPSC colonies that could be subcultured and propagated were established as early as 10 days after transduction, in comparison with the skin fibroblast (DPC-derived iPSCs) without c-Myc presented embryonic stem cell-like properties and the pluripotent potential to differentiate into neuron-like cells, which resemble neurons both morphologically and functionally.ConclusionThe human DPCs from deciduous and permanent teeth can undergo reprogramming to establish pluripotent stem cell lines without c-Myc. These surgical residues, usually regarded as medical waste, can be used as an alternative source of pluripotent stem cells for personalized medicine.     

利用piggyBac转座子构建小鼠诱导性多能干细胞及其鉴定

目的：利用 piggyBac 转座子载体携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 4 个核转录因子,重编程胎鼠成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs）,并探讨其作用效果。方法：分离Oct4-GFP小鼠的 MEFs,将携带鼠源 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等4个基因的piggyBac 转座子转入至MEFs;观察iPSCs克隆形成过程的形态表现;分析iPSCs染色体组成,评价iPSCs的核型变化。RT-PCR法检测小鼠iPSCs中胚胎干细胞（ESCs）相关基因Oct4、Nanog和FGF4的表达;免疫荧光、碱性磷酸酶染色和流式细胞术检测小鼠iPSCs中SSEA-1和Nanog蛋白表达。将iPSCs接种到NOD-SCID小鼠腹股沟进行畸胎瘤实验,4周后取畸胎瘤制备组织切片进行HE染色,观察组织分化情况。结果：通过piggyBac转座子成功构建iPSCs,其具有正常的核型,形态与小鼠ESCs相似,克隆边界清晰、呈圆形或卵圆形,克隆内细胞致密、核大。RT-PCR 和免疫荧光染色分析,iPSCs可表达多能性基因和蛋白（Oct4、Sox2、Kif4和c-Myc）。在免疫缺陷小鼠体内接种iPSCs可形成具有3个胚层组织的畸胎瘤。结论：以piggyBac转座子为载体将Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 4个转录因子基因导入MEFs,可以成功诱导MEFs成为具有ESCs特征的正常核型iPSCs。     

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导 多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的：利用人类胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast cells, hEFs)获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)系并对其全能性进行鉴定。方法：本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析。结果：所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论：4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。     

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的：利用人类胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblast cells,hEFs）获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）系并对其全能性进行鉴定。方法：本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析。结果：所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论：4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。     

人胚神经干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的实验研究

目的:研究侧脑室注射人胚神经干细胞(hNSCs)移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的有效性及hNSCs在EAE大鼠脑内的状况。方法:从自然流产的孕9～15周的人胚脑组织中分离、培养神经干细胞。用豚鼠全脊髓匀浆免疫Wistar大鼠制备EAE大鼠模型,分别在免疫后10、15、21天经侧脑室注射移植未分化的hNSCs入大鼠体内,观察hNSCs对EAE动物模型神经功能评分、脑内脱髓鞘病灶数目的影响,免疫组化方法观察移植后的hNSCs在EAE大鼠脑内存活、迁徙、分化的状况。结果:从人胎脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球。绝大多数细胞表达神经干细胞的标记物神经巢蛋白(nestin)。hNSCs移植组各时间点大鼠脑组织切片中均可见Brdu、nestin、NSE、GFAP、CNPase染色阳性细胞,CNPase阳性的少突胶质细胞比例随时间的延长而逐渐增多;hNSCs移植组大鼠自免疫后30天起其神经功能评分显著低于对照组(P<0.05);移植后20、30天脑内脱髓鞘病灶数目明显少于对照组(P<0.05)。结论:hNSCs体内体外均具有多向分化潜能,受炎症部位微环境信号的影响分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。hNSCs移植能有效改善EAE动物的神经功能评分,减少病灶数目。     

神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养

目的探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法分离新生SD大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入试验,免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化,分别用神经元特异性核抗原(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。     

多基因修饰小鼠诱导多潜能干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的观测胰岛素转录关键调控因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX-1)、神经分化因子1(NeuroD1)及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)对小鼠诱导多潜能干细胞(iPS细胞)分化为胰岛素分泌细胞的作用。方法筛选鉴定小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程的iPS细胞。以重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP联合感染小鼠iPS细胞,体外培养后以RT-PCR检测胰岛B细胞功能基因表达;免疫荧光检测胰岛素蛋白表达及定位;ELISA检测不同糖浓度(0、5、10、20、30、40mmol/L)下胰岛素的分泌量。结果起源于MEFs的iPS细胞能形成边缘光整的致密克隆,表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织,显示MEFs被成功地重编程为iPS细胞。Ad-PDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP感染的小鼠iPS细胞能分化为胰岛类B细胞,RT-PCR结果显示其胰岛B细胞功能基因的表达与小鼠胰岛B细胞株MIN6相似。免疫荧光检测可见胰岛类B细胞内有胰岛素表达。ELISA检测结果显示胰岛类B细胞对不同浓度葡萄糖有较好的反应性。结论胰岛素转录关键调控因子PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用,使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。     

神经系统疾病中应用诱导多能干细胞的研究进展

诱导多能干细胞（iPSCs）是将已分化完全的体细胞进行重编程,使之成为多能干细胞。现已有多项关键新技术的实施大大提升了iPSCs的转染效率和临床安全性。目前将iPSCs定向分化成的神经前体细胞、胶质细胞和神经元样细胞移植治疗各种神经系统疾病,展现出非常良好的前景。同时,利用iPSCs技术能在体外构建相关疾病模型,并进行药物筛选。本文就目前iPSCs在神经系统疾病中的应用作一综述。     

不同生长因子对神经干细胞定向分化的影响

目的 研究神经干细胞（NSCs）分化为神经元和胶质细胞的影响因素,探讨各种生长因子对小鼠NSCs定向分化的影响。方法 以无血清培养法从E13-14d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs后,分别加入50 mg/L EGF、bFGF、IGF-1、NGF和PDGF处理,分析不同生长因子对NSCs定向分化的影响。结果 分离得到的细胞表现出NSCs的特性,能无限增殖,神经元微管相关蛋白和胶原纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组相比,各生长因子均可显著诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中NGF的诱导NSCs分化为神经元的作用最强;IGF-1、NGF、PDGF均能明显诱导NSCs分化为星形胶质细胞。结论 几种生长因子均能促进NSCs分化,其中NGF诱导NSCs向神经元方向作用最强;而IGF-1、NGF和PDGF促进NSCs向星形胶质细胞分化的作用均较强。     

脂肪基质干细胞跨胚层分化为神经干细胞的实验研究

目的：探讨脂肪基质干细胞向神经干细胞跨胚层分化的可行性,进而为神经系统损伤修复寻找理想的种子细胞．方法：无菌条件下取大鼠腹股沟脂肪组织,消化离心后低糖含血清培养基培养,待细胞生长至亚融合状态改用神经干细胞培养基诱导,用免疫荧光对诱导的细胞进行鉴定．结果：大鼠脂肪基质干细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的细胞,后者形成细胞球（或称“神经球”）,该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快形成新的神经球．神经干细胞球进一步分化,可见到有的细胞胞体增大并出芽,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系,表达Nse或Gfap抗原．结论：大鼠脂肪基质干细胞在一定条件下可以向神经干细胞跨胚层分化．该种来源的神经干细胞可能成为中枢神经系统损伤修复的理想种子细胞．     

PDGF对人神经干细胞分化和甲状腺激素受体表达的影响

[目的]探讨血小板衍生生长因子(Platelet-derived Growth Factor,PDGF)在人神经干细胞(Human Neural Stem Cells,hNSCs)定向分化中的作用,以及在hNSCs分化过程中PDGF对甲状腺激素受体(Thyroid Hormonereceptors,TRs)的表达调控。[方法]用免疫细胞化学方法鉴定分化后的细胞类型,分别用半定量RTPCR法、 ELISA法检测不同诱导条件下hNSCs分化前后TRα1、TRα2、TRβ1在转录与翻译水平上的表达变化。 [结果]PDGF诱导hNSCs分化后NF阳性细胞约占80％;TRα1、α2、β1mRNA表达水平分别比10％胎牛血清诱导分化组上调约40％、30％、10％(P<0．05)。TRα、β蛋白质表达趋势为hNSCs>PDGF诱导分化组>血清诱导分化组(P<0．05)。[结论]PDGF能引发hNSCs向神经元分化,同时在转录与翻译水平上调hNSCs分化后TR各亚型的表达,增强甲状腺激素对中枢神经系统发育的重要调控作用。     

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶(cytimidine deaminase，CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD，限制性内切酶消化鉴定后，采用Lipofectamine 2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)，G418筛选阳性克隆，加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Flourocytosine，5-FC)，MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞，并将CD基因成功地转染了神经干细胞，G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感。结论 CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗研究提供依据。     

Induced pluripotent stem cells and hepatic differentiation

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are generated by reprogramming somatic cells to a pluripotent state by the introduction of specific factors. They can be generated from cells of different origins, such as fibroblasts, keratinocytes, hepatocytes, and blood. iPSCs are similar to embryonic stem cells (ESCs) in several aspects, such as morphology, expression of pluripotency markers, and the ability to develop teratoma that contains tissue from three germ layers. In addition, iPSCs can undergo tridermal differentiation, including hepatic specific lineages. Considering that iPSCs could be a source of hepatocyte regeneration, iPSC-based therapy has been widely implicated in the treatment of liver disease and hepatic regeneration. In the present review, we discuss the therapeutic potential of iPSCs in hepatic repair and focus on the clinical applications of iPSCs.     

新生大鼠海马齿状回神经干细胞的鉴定及褪黑激素对其分化的影响

目的 :探索新生大鼠海马齿状回神经干细胞分离培养及鉴定方法 ,并观察不同剂量褪黑激素对神经干细胞分化的影响。方法 :从新生大鼠海马齿状回分离得到神经干细胞 ,采用无血清培养技术进行培养 ,并采用 10、10 0 μmol/L褪黑激素诱导分化。应用细胞免疫化学方法进行神经干细胞巢蛋白 (nestin)、神经元特异性烯醇化酶 (neuronspecificenolase ,NSE)、胶质纤维酸蛋白 (glialfibrillaryacidicprotein ,GFAP)检测以进行细胞鉴定。结果 :鉴定表明从新生大鼠海马齿状回分离培养的细胞具有神经干细胞的特征 ,并可在体外增殖 ,经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。褪黑激素能促进神经干细胞向神经元分化 ,但低浓度组与高浓度组的褪黑激素对神经元的分化并无显著性差异。结论 :从新生大鼠海马齿状回成功分离培养了神经干细胞 ,是研究细胞诱导分化的良好模型。褪黑激素能促进神经干细胞向神经元分化。     

脂肪干细胞的研究及应用进展

干细胞在治疗各种疾病方面拥有巨大的潜能。在细胞治疗方面,脂肪干细胞是最有前景的种子细胞之一,其他的还包括胚胎干细胞和诱导的多能干细胞。胚胎干细胞和诱导的多能干细胞都具有多向分化潜能,因而起着举足轻重的作用。但是,胚胎干细胞和诱导的多能干细胞分别受限于伦理学问题及细胞表型的鉴定。脂肪干细胞则不受这些限制,不仅易于获取,而且方便扩增。在不同的诱导条件下,脂肪干细胞能分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞和神经细胞,这些分化潜能可应用于再生医学领域,如：皮肤重建,骨和软骨修复等。本篇综述着重讨论目前脂肪干细胞的分离、分化和治疗应用。