HBV—DNA套式一次PCR方法的建立

应用乙型肝炎病毒ＤＮＡ Ｃ基因区的一对外引物（ＨＢＣ１和ＨＢＣ２，护增片段长度为５６６ ｂｐ）及一对内引物（ＨＢＣ３和ＨＢＣ４，护增片段长度为３０１ ｂｐ）对不同稀释度的ＨＢＶ－ＤＮＡ（ａｄｒ亚型）进行套式一次ＰＣＲ扩增，结果表明灵敏度可达到１０ａｇ水平。此方法快速、简便、灵敏、特异，与分子杂交的灵敏度相当。     

用多重及套式PCR同时检测血清中的HBV和HCV方法的建立

首次应用多重及套式ＰＣＲ技术同时检测人血清中的ＨＢＶ和ＨＣＶ。将抽提的ＨＢＶＤＮＡ和（或）ＨＣＶＲＮＡ在含ＡＭＶ逆转录酶、ＴａｑＤＮＡ多聚酶以及ＨＢＶ和ＨＣＶ外套引物的ＰＣＲ缓冲引物的ＰＣＲ缓冲液中进行逆转录后连续进行ＰＣＲ扩增，以第一轮扩增产物为模板，在含ＨＢＶ和ＨＣＶ内套引物的ＰＣＲ反应体系中进行第二轮扩增，产物经电泳后，以ＤＮＡ分子量标志物或已知片段做参考，出现５２３ｂｐ和（或）２６０ｂｐ产     

输血传播病毒-DNA聚合酶链方法的建立及应用

目的：建立输血传播病毒（ＴＴＶ）－ＤＮＡ聚合酶链反应方法并应用于新疆地区不同人群ＴＴＶ感染的检测。方法：根据已报道的ＴＴＶ基因痛列（ＤＤＢＪ序列号：ＡＢ００８３９４）,通过引物设计软件ＳＱＮＣＥ和ＯＬＩＧＯ在其ＯＲＦ１区设计一对ＰＣＲ引物,扩增产生一个３１５ｂｐ的扩增片段,产物经ＢｇⅠⅡ酶切分别产生一个２１９ｂｐ和９６ｂｐ的酶切片段。结果：用建立的ＰＣＲ方法在１５例维存尔族转氨酶升高的非甲－非庚型     

应用原位聚合酶链反应对肝细胞癌组织中HBVDNA进行再评价

为探讨ＨＢＶ感染与肝细胞癌（ＨＣＣ）发生之间关系，作者应用原位聚合酶链反应（ＰＣＲＩＳ）对２６例肝癌、２３例癌旁肝组织的石蜡切片进行了ＨＢＶＤＮＡ的检测，检出率分别为８４．６％和９１．３％，明显高于原位核酸杂交（ＩＳＨ）的５３．８％（１４／２６）和５６．５％（１３／２３）；亦高于从患者血清和ＨＣＣ组织提取ＤＮＡ后行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增的５７．７％（１５／２６）和５５．６％（５／９）。用ＰＣＲＩＳ方法，ＨＣＣ组织细胞中ＨＢＶＤＮＡ阳性颗粒强度、ＨＢＶＤＮＡ阳性细胞数和组织切片的清晰度均高于ＩＳＨ。ＰＣＲＩＳ既显示了ＰＣＲ技术的高敏性和特异性，又能在细胞内定位。本结果显示我国ＨＣＣ的发生与ＨＢＶ感染密切相关。     

抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因。方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整κ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析。结果：用重链引物扩增获得长约３６０ｂｐ的片段；用轻链引物扩增获得约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列。结论：克隆的重链可变区基因长度为３６０ｂｐ，属于小鼠重链可变区Ｉ（Ｂ）亚族；κ轻链长度为６４２ｂｐ，其中可变区为３２１ｂｐ，属于小鼠κ轻链Ⅴ亚族。     

登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２ ４３） 感染的Ｃ６／３６ 细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ 为模板,进行Ｄ２ ４３ 株ＮＳ３ 基因ｃＤＮＡ 片段的反转录 ＰＣＲ 扩增,片段长度为１１７６ ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ 片段克隆到Ｔ 载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｓⅡ（ ＋ ） 中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

聚合酶链反应检测HBV感染患者血清HBV DNA的临床意义

聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术是本世纪分子生物学重大进展之一，在体外可将特异ＤＮＡ序列呈百万倍扩增，具有高灵敏度和高特异性。随着该技术的不断改进和完善，其在ＨＢＶ感染研究中的应用也越来越多，大大丰富和更新了人们对ＨＢＶ感染的认识［１］。本文应用ＰＣＲ技术检测不同ＨＢＶ感染患者血清中ＨＢＶＤＮＡ，旨在探讨急、慢性乙型肝炎及与ＨＢＶ感染相关的肝硬变和肝癌患者血清ＨＢＶＤＮＡ的存在情况及其与乙型肝炎病毒血清标志物（ＨＢＶＭ）在反映体内病毒复制方面存在的差异，…     

孕妇血清和胚胎组织中微小病毒B19 DNA的检出

作者建立了检测人微小病毒Ｂ１９（ＨＰＶ－Ｂ１９）的ＰＣＲ方法。两对引物（Ｐ１Ｐ２和Ｐ３Ｐ４）的设计均位于编码ＨＰＶ－Ｂ１９衣壳蛋白ＶＰ１基因区内，扩增产物分别为７００ ｂｐ和１０４ ｂｐ。比较Ｐ１Ｐ２－ＰＣＲ和Ｐ３Ｐ４－ＰＣＲ，二者均具有高度特异性和第三性，ＨＰＶ－Ｂ１９ ＤＮＡ最小检同量分别为５ ｆｇ。应用Ｐ１Ｐ２－ＰＣＲ对３２份孕妇血清和２１份胚胎组织标本进行了ＨＰＶ－Ｂ１９ ＤＮＡ的检测，结     

聚合酶链反应快速诊断白色念珠菌菌血症

目的：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术诊断白色念珠菌菌血症。方法：设计的引物特异性扩增编码白色念珠菌细胞色素Ｐ４５０Ｌ１Ａ１的基因，其长度为２４３ｂｐ。ＥＤＴＡ抗凝血用去污剂溶解，用ＤＮａｓｅＩ去除人体白细胞和污染的细菌ＤＮＡ；念珠菌的细胞壁用溶胞酶消化并用ＳＤＳ和蛋白酶Ｋ裂解。用酚／氯仿／异戊醇提取模板ＤＮＡ。用ＰＣＲ技术扩增。结果：与细菌、病毒及人体细胞ＤＮＡ无非特异扩增。检出血中白色葡萄的阈值     

检测人巨细胞病毒的套式PCR法及在妇产科的临床应用

报告了检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）的套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）法，及其在妇产科临床应用的结果。改进了从临床样品中提取ＤＮＡ的方法，优化了套式ＰＣＲ的条件。测得套式ＰＣＲ的扩增倍数为２．９×１０￣９，套式ＰＣＫ／电泳法的灵敏度为４０个ＨＣＭＶ基因组拷贝。临床应用结果表明，孕妇的ＨＣＭＶ感染率很高，母婴间存在ＨＣＭＶ感染的垂直传播关系。胎盘是传播的主要途径，胎盘的屏障功能随妊娠时间的延长而减弱。宫颈分泌物的感染也是母婴间ＨＣＭＶ感染传播的感染源。ＨＣＭＶ感染对胎儿发育的影响，应引起优生优育工作者们的重视。     

一步法快速鉴定皮肤癣菌

目的探讨一步法快速鉴定皮肤癣菌的临床价值。方法采用快速简便的一步法处理癣菌及非癣菌菌株获得菌株DNA。癣菌通用引物的敏感性测定:将获得的菌株DNA以及人DNA进行PCR扩增后跑电泳,观察是否出现特定大小的阳性条带。PCR反应体系的敏感性测定:用超微量分光光度计测量癣菌菌液的DNA浓度,再将癣菌菌液的DNA进行10倍连续稀释,获得不同浓度的癣菌菌液,随后进行PCR扩增,记录特定大小的阳性条带出现时的最小癣菌DNA浓度值,PCR重复做3次。结果所有癣菌菌株经PCR扩增后均出现366 bp的阳性条带,非癣菌菌株及人DNA经PCR扩增后均未出现任何条带。将浓度为600 ng/μl的癣菌DNA浓度经10倍连续稀释后,得到的7个浓度菌液,其中600 ng~6 pg经PCR扩增后出现366 bp的阳性条带,第7个600 fg浓度经PCR扩增后未出现任何条带。结论皮肤癣菌通用引物CHS1具有较高的特异性,可用作检测癣菌的特异性引物,本实验PCR体系的敏感度较高,为6 pg。     

普通PCR与TD-PCR在临床医学科研中应用价值的比较

目的 比较普通聚合酶链反应(PCR)与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR,TD-PCR)在临床医学科研中的价值.方法 以人类外周血基因组DNA为模板,设计VHL基因3个外显子的3对引物,根据普通PCR及TD-PCR原理设计包括3个外显子片段在内的PCR程序,通过试验选择PCR最佳反应条件,在同一程序中分别对3个片段进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,纯化后PCR产物测序分析两种试验方法 的差别.结果 电泳检测及纯化后DNA产物测序分析均显示TD-PCR扩增产物条带特异性、效率较普通PCR扩增产物高.结论 成功建立了TD-PCR方法 ,TD-PCR方法 较普通PCR更为高效实用,为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段.     

人巨细胞病毒^32P标记PCR产物探针敏感度

＾３２Ｐ探针杂交是病原微生物基因诊断应用最广泛的方法之一，在建立了人巨细胞病毒ＰＣＲ、套式ＰＣＲ的基础上，我们用６１３ｂｐ ＰＣＲ外引物扩增产物的制备了杂交探针，并与３００ｂｐ内引物扩增产物进行转膜杂交，可将单纯琼脂糖凝胶电泳１７ｎｇ的检测水平提高到０．５ｎｇ，释释梯度相当于提高２个数量级。因此，利用ＰＣＲ结合＾３２Ｐ杂交就可以检测出不到１个病毒的基因拷贝（１００ａｇ），为临床人巨细胞病毒潜伏感染     

用三甲基甘氨酸克服G+C丰富靶基因的PCR扩增困难

为探讨三甲基甘氨酸等有机溶剂对G＋C碱基丰富基因PCR扩增困难的影响，分别用标准PCR和添加有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、甲酰胺及三甲基甘氨酸的改进剂PCR对G＋C含量为70％的周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（ARF）和G＋C含量为90％的胰岛素样生长因子受体Ⅱ（IGFRⅡ）进行扩增。结果显示，应用标准PCR及添加有甘油或甲酰胺的PCR均不能特异性扩出上述两基因；加入10％DMSO虽可扩出ARF基因但同时有非特异性产物；而加入三甲基甘氨酸可特异地扩增出642bp的ARF和540bp的IGFR Ⅱ基因。表明三甲基甘氨酸可消除G＋C丰富DNA区域二级结构对PCR扩增的干扰，明显促进这类基因的PCR扩增。     

肝肾移植术后受者人巨细胞病毒两种检测方法的对比研究

目的:探讨巢式PCR(Nest PCR)检测器官移植术后受体人巨细胞病毒(HCMV)DNA,并与传统ELISA法作方法学对照。方法:巢式PCR针对HCMV AD169株IEA基因设计内外两对引物,对59例肝、肾移植术后受体(肝移植27例、肾移植32例)血、尿标本进行HCMV DNA检测。分离血清作EIASA检测IgG、IgM。结果:血液Nest PCR阳性率肝移植62.9％,肾移植46.8％;ELISA法阳性率:IgC35.5％,IgM27.1％,IgG+IgM18.6％,IgM阳性标本(16例)DNA检测皆为阳性,6例IgG、IgM皆阴性标本DNA检测仍为阳性。两法检测,P<0.05,证明两法存在显著差异,结论:巢式PCR是一种敏感特异、简便快速诊断HCMV感染的方法,灵敏度及特异性高于传统ELISA,能弥补ELISA的假阴性,更适用于临床检测器官移植术后HCMV感染。     

SEN病毒中国分离株基因克隆及序列分析

目的：测定SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，并对其进行初步分析。方法：根据国外已发表的SEN病毒基因序列设计特异性引物，应用套式PCR方法从一份非甲-非戊型(non-A-E)肝炎患者血清中，分段扩增了包括SENV-D型所有编码区(ORFs)长3175bp的DNA片段，将其克隆到T载体后测序。结果：测序结果经BLAST软件分析，与国外发表的3株D型SEN病毒SENV-D(AX025730)，SENV-D(AB059352)，TTV(AB028668)的核苷酸序列同源性分别为90％，88％和91％；与2株D型SEN病毒SENV-D(AX0Z5730)，TTV(AB028668)0RF1所编码蛋白的氨基酸同源性分别为93％和92％。ORF1蛋白中含有Rep蛋白(在病毒复制中起作用的一种蛋白)的两个保守基序，此外还有一个保守的ATP／GTP结合基序(P-loop)以及若干个高度保守的蛋白激酶磷酸化位点。结论：测定得到了SENV-D亚型中国分离株的基因组序列，有助于其检测方法及致病性的研究，并为研究SEN病毒的进化地位提供方便。     

SEN病毒部分基因的克隆及序列测定

目的：了解我国人群中是否存在SEN病毒(SENV)感染,并分析SENV国内分离株的部分基因序列,方法：在SENV的保守区设计引物,建立巢式PCR方法检测血清中SENV DNA,并对PCR产物进行克隆,测序,结果,7例非甲－非瘐型肝炎,且输血传播病毒（TTV）阴性患者中,2例SENV阳性,其中一株的序列与意大利SENV－D株（AX－25730）相对应位置核苷酸序列同源性为90％,结论：本研究证初了我国存在SENV感染,建立了检测SENV的PCR方法,并对SENV部分基因进行了克隆及测序,对进一步开展SENV诊断和流行病学调查具有重要意义。     

乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究

目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer Premier 5．0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定。用PixSys5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片。样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析。结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳。结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性。     

人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR序列包含潜在蛋白结合位点

目的：检测中国人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR多态性，探询VNTR序列是否具有潜在的蛋白结合位点，从而为进一步研究这些VNTR的功能提供线索。方法：采用PCR方法扩增健康中国人外周血淋巴细胞基因组hTERT基因第2内含子多态性VNTR片段，克隆并鉴定，以多态性重复单元做为探针进行凝胶延迟实验，以确定该片段是否存在蛋白结合位点。结果和结论：hTERT基因第2内含子内上游的一个VNTR序列(VNTR2-1st)存在一个潜在蛋白结合位点，该蛋白能够与多态性VNTR DNA序列形成复合物，蛋白结合的关键位点处于42bp重复单元c端的典型E-box基序(CACGTG)，但是c-myc并不参与结合该VNTR2-1st重复单元。此外，利用第6内含子内上游的VNTR(VNTR6-1st)的重复单元做为探针，结果发现该38bp VNTR6-1st重复单元不能与HeLa细胞核蛋白因子结合，从而提示了不同VNTR序列功能的多样性。     

聚合酶链反应检测人巨细胞病毒的方法及临床应用

在人巨细胞病毒（HCMV）高度保守区IEA基因内设计一对引物，建立了聚合酶链反应（PCR）检测HCMVDNA的方法，经实验证明有高度的特异性和敏感性，对其它疱疹病毒和正常人DNA无交叉反应，HCMVAD169株DNAEcoRⅠ酶切J片段的最小检出量为0.1fg,相当于6个基因拷贝，对PCR反应体系中的有关实验条件如Mg^2 浓度，引物浓度，TaqDNA多聚酶的浓度，循环程序等及尿标本的处理方法进行优化选择，用PCR检测20例肾移植受尿标本中HCMVDNA，结果11例（55%）阳性，表明PCR是一种快速，特异，敏感的检测方法，适用于肾移植等病人的HCMV感染监测。